陳林 黃國良

[摘要] 目的 探討內(nèi)脂素對大鼠腎小球系膜細(xì)胞（GMCs）細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)GMCs，隨機(jī)分為對照組和不同濃度內(nèi)脂素（25、50、100、200 ng/mL）干預(yù)組，逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測GMCs纖維連接蛋白（FN）和Ⅰ型膠原（COLⅠ）mRNA，Western印記測定FN、COLⅠ蛋白。結(jié)果 不同濃度內(nèi)脂素干預(yù)GMCs 24 h后，細(xì)胞FN及COLⅠ的mRNA和蛋白表達(dá)均較對照組增多（P<0.05），且隨著內(nèi)脂素濃度增加，其表達(dá)呈逐漸增加的趨勢（P<0.05）。結(jié)論 內(nèi)脂素呈一定的濃度依賴性促進(jìn)GMCs細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)，可能參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病腎??；內(nèi)脂素；纖維連接蛋白；Ⅰ型膠原

[中圖分類號] R589 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-4062（2018）10（b）-0001-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of visfatin on the expression of extracellular matrix in rat mesangial cells （GMCs）. Methods GMCs were cultured in vitro and randomly divided into control group and intervention group with different concentrations of visfatin（25 ng/mL，50 ng/mL，100 ng/mL， 200 ng/mL）. Reverse transcription-PCR（RT-PCR） was used to detect GMCs fibronectin（FN） and type I collagen，（COLI） mRNA，Western blotting to determine FN，COLI protein. Results After treatment with different concentrations of lipoprotein for 24 hours， the mRNA and protein expressions of FN and COLI increased compared with the control group（P<0.05），and the expression increased gradually with the increase of visfatin concentration（P<0.05）. Conclusion The visfatin promotes the expression of extracellular matrix of GMCs in a concentration-dependent manner， which may be involved in the development of diabetic nephropathy.

[Key words] Diabetic nephropathy； Visfatin； Fibronectin； Type I collagen

糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）是以系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）沉積及腎小球硬化為主要特征。系膜細(xì)胞ECM成分包括膠原纖維（Collagen，COL）、纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）、層粘連蛋白等。內(nèi)脂素是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，具有促炎作用[1-2]。有研究顯示DN患者血漿內(nèi)脂素水平明顯升高[3]，體外實(shí)驗(yàn)[4-5]亦表明，內(nèi)脂素還具有促纖維化作用，可能參與DN發(fā)生發(fā)展。國內(nèi)關(guān)于內(nèi)脂素與DN的關(guān)系研究報(bào)道較少。該研究旨在通過體外培養(yǎng)GMCs，觀察內(nèi)脂素對GMCs ECM表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

大鼠腎小球系膜細(xì)胞株（武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心），重組內(nèi)脂素（美國Biovision公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas公司），PCR 引物合成（上海生工股份有限公司），F(xiàn)N小鼠單抗、COLⅠ小鼠單抗（美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)GMCs，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞接近亞融合狀態(tài)時(shí)改用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h 以同步化，再隨機(jī)分為：對照組及不同濃度內(nèi)脂素（25、50、100、200 ng/mL）干預(yù)組，孵育24 h。

1.2.2 RT-PCR檢測FN和COLⅠmRNA表達(dá) RNAiso Plus提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增FN、COLⅠmRNA基因片段。FN引物：上游 5-CAGTTTGTGGAAGTGACCGA-3，下游 5-TGGAGGTTAGTGGGAGCATC-3；COLⅠ引物：上游 5-CATCCACAAGCGTGCTGTAGGTG-3；下游 5-TGCCGTGACCTCAAGATGTGCC-3；β-Actin引物：上游 5-TGCCCATCTATGAGGGTTAC-3，下游 5-TCTCTTGC TCGAAGTCTAGG-3。Image J軟件計(jì)算目的基因/內(nèi)參灰度值。

1.2.3 Western印跡檢測FN和COLⅠ蛋白表達(dá) 裂解液充分裂解細(xì)胞，4℃ 14 000 r/min離心15 min，取上清。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，二抗中室溫孵育1 h，膠片顯影。Image J 軟件分析目的蛋白/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)脂素對GMCs FN mRNA表達(dá)影響

不同濃度內(nèi)脂素作用后，GMCs FN mRNA表達(dá)增加，均高于對照組（P<0.01）。在25～100 ng/mL濃度范圍內(nèi)，隨著內(nèi)脂素濃度增加，F(xiàn)N mRNA表達(dá)逐漸增加（P<0.01），200 ng/mL組與100n g/mL組FN mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2 內(nèi)脂素對GMCs FN蛋白表達(dá)影響

各組細(xì)胞FN蛋白表達(dá)亦高于對照組（P<0.05），與其mRNA表達(dá)趨勢一致，在內(nèi)脂素25～100 ng/mL范圍，F(xiàn)N蛋白表達(dá)也隨著內(nèi)脂素濃度的升高而逐漸增加（P<0.01），200 ng/mL組與100 ng/mL組FN 蛋白表達(dá)亦差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。

2.3 內(nèi)脂素對GMCs COLⅠmRNA表達(dá)影響

觀察內(nèi)脂素與GMCs COLⅠmRNA表達(dá)的量效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)25 ng/mL內(nèi)脂素也促進(jìn)GMCs COLⅠmRNA表達(dá)增加（P<0.01），且隨著內(nèi)脂素濃度升高，其COLⅠmRNA表達(dá)逐漸增加（P<0.01）。見表2。

2.4 內(nèi)脂素對GMCs COLⅠ蛋白表達(dá)影響

進(jìn)一步觀察內(nèi)脂素對GMCs COLⅠ蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與其mRNA表達(dá)一致，內(nèi)脂素亦呈濃度依賴性促進(jìn)細(xì)胞COLⅠ蛋白表達(dá)增加（P<0.05）。見圖2。

3 討論

內(nèi)脂素是新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細(xì)胞因子，除在脂肪組織外，在腎臟、心臟和骨骼肌等部位亦表達(dá)豐富[6]。許多研究表明，炎癥狀態(tài)下內(nèi)脂素表達(dá)明顯增加，其與炎癥因子相互作用，級聯(lián)放大，參與了多種炎癥相關(guān)性疾病[7]。慢性低度炎癥狀態(tài)是DN進(jìn)展的因素。Song等[5]通過體外培養(yǎng)大鼠GMCs，發(fā)現(xiàn)高糖可刺激GMCs分泌內(nèi)脂素增多。再給予外源性內(nèi)脂素刺激GMCs，細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)增加，纖維化相關(guān)因子分泌增多，腎臟纖維化加速。其他研究亦表明[8]，隨著內(nèi)脂素表達(dá)的下調(diào)，高糖誘導(dǎo)的GMCs增殖、炎癥及纖維化過程明顯被抑制。臨床報(bào)道顯示糖尿病患者血漿內(nèi)脂素水平明顯升高，DN患者血漿內(nèi)脂素濃度升高更為顯著[8]。血漿內(nèi)脂素水平還與蛋白尿的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。這些研究均提示內(nèi)脂素可能與DN密切相關(guān)。該實(shí)驗(yàn)通過內(nèi)脂素對GMCs ECM表達(dá)影響的角度為切點(diǎn)，探討內(nèi)脂素在DN中的可能作用。

腎小球原有基質(zhì)成分（如FN）以及非正常腎小球基質(zhì)成分（如COLⅠ和COLⅢ）表達(dá)增多均導(dǎo)致ECM異常沉積。該實(shí)驗(yàn)選取FN、COLⅠ作為觀察指標(biāo)，觀察不同濃度內(nèi)脂素對GMCs FN、COLⅠ表達(dá)的影響。結(jié)果顯示25 ng/mL內(nèi)脂素作用GMCs 24 h，細(xì)胞FN 和COLⅠmRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，且隨著內(nèi)脂素濃度升高，表達(dá)呈逐漸增加趨勢。提示內(nèi)脂素呈一定的濃度依賴性促進(jìn)GMCs FN和COLⅠ表達(dá)。

該研究與其它許多體外細(xì)胞研究結(jié)果相似，內(nèi)脂素具有顯著的促進(jìn)細(xì)胞膠原纖維表達(dá)的作用[7，9]；另外還表明內(nèi)脂素能促進(jìn)GMCs FN基因和蛋白表達(dá)，提示內(nèi)脂素能刺激GMCs合成大量ECM。高糖是內(nèi)脂素表達(dá)增加的一個(gè)重要因素[5，10]。另外對DN患者使用雷米普利治療，其炎癥、內(nèi)皮細(xì)胞功能及蛋白尿均明顯改善，并伴有血漿內(nèi)脂素水平顯著下降[11]，表明RAS系統(tǒng)激活也促進(jìn)內(nèi)脂素表達(dá)。故推測糖尿病患者在高糖刺激及RAS系統(tǒng)激活后，內(nèi)脂素水平明顯升高，而內(nèi)脂素又進(jìn)一步激活RAS系統(tǒng)[12]，形成惡性循環(huán)，最終促進(jìn)GMCs纖維化因子表達(dá)增加，可能是DN發(fā)展中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

該研究為DN防治提供一個(gè)可能的新靶點(diǎn)，但還需體內(nèi)動物試驗(yàn)進(jìn)一步研究證實(shí)，且內(nèi)脂素在DN中的可能通路及機(jī)制有待深入探討。

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（收稿日期：2018-07-15）