間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基在動(dòng)脈粥樣硬化治療中的研究進(jìn)展

陳雪晴 周迎春

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致心腦血管疾病最重要的危險(xiǎn)因素，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。各種危險(xiǎn)因素（如高脂血癥、高血壓病和糖尿病等）導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜受損時(shí)[1]，在活性氧、高血糖和脂多糖等活性因子的刺激下，血管壁產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等表面特性發(fā)生改變，釋放大量炎性介質(zhì)和氧化代謝產(chǎn)物，加速AS的發(fā)展。而血管鈣化、斑塊破裂、管腔內(nèi)血栓形成和斑塊內(nèi)出血等則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心血管事件[2]。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有抑制炎癥反應(yīng)，修復(fù)組織損傷的潛能，而各類干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展則為加速干細(xì)胞制劑的臨床應(yīng)用提供了可能[3-4]。MSCs是人體內(nèi)來(lái)源較豐富的一類成體干細(xì)胞，廣泛存在于骨髓、脂肪、表皮和血液等組織，易于分離培養(yǎng)[5]；此外，MSCs還具有低免疫原性的特點(diǎn)，同種異體移植不容易引起免疫排斥反應(yīng)[6-7]。將MSCs應(yīng)用于AS，移植的MSCs可通過(guò)趨化因子梯度遷移至損傷區(qū)域，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)損傷，抑制動(dòng)脈狹窄的形成[8]。然而體外輸注的MSCs壽命相對(duì)短暫，只有少數(shù)會(huì)分化形成新的細(xì)胞或組織[9]，且分化機(jī)制尚不明確，分化過(guò)程難以控制；另一方面，血管內(nèi)膜損傷后，骨髓MSCs會(huì)歸巢到受損血管局部，分化為血管平滑肌細(xì)胞，參與再狹窄或動(dòng)脈斑塊鈣化的形成，這些瓶頸促使研究者們把目光轉(zhuǎn)向了MSCs的替代治療。

研究發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠合成、分泌多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子。在動(dòng)物模型中，盡管體外輸注的MSCs遠(yuǎn)離實(shí)際損傷部位，但仍可以促進(jìn)傷口愈合[10]，提示MSCs可通過(guò)旁分泌發(fā)揮抗炎、抗凋亡和促進(jìn)新生血管形成的治療作用[11]。Shabbir等[12]將MSCs注射至倉(cāng)鼠腿肌腱內(nèi)，采用示蹤技術(shù)，雖然未在其它組織中發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞，但心肌梗死倉(cāng)鼠的心室功能得到改善，多種生長(zhǎng)因子表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡和心肌纖維化程度減輕，出現(xiàn)心肌再生跡象。

由此，含有多種MSCs自體分泌因子的條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）引起了人們極大興趣。近年來(lái)，Timmers等[13]發(fā)現(xiàn)應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（mesenchymal stem cell conditioned medium，MSC-CM）可改善大鼠心肌梗死后的心臟功能。Chen等[14]報(bào)道了MSC- CM通過(guò)抑制炎癥和保護(hù)竇內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)預(yù)防放射性肝損傷。Tamari等[15]發(fā)現(xiàn)MSC-CM能夠加速傷口愈合。因此，應(yīng)用MSC-CM既可避免直接輸注MSCs引起的不良反應(yīng)，又可發(fā)揮MSCs分泌因子的治療作用。

隨著對(duì)MSC-CM的深入研究，越來(lái)越多的研究者們把目光轉(zhuǎn)向了MSC-CM對(duì)AS的治療作用。本文綜述了應(yīng)用MSC-CM治療AS的最新進(jìn)展，希望為深入研究MSC- CM的應(yīng)用前景提供參考。

一、MSC-CM

MSC-CM是指將MSCs的培養(yǎng)基上清液，直接用于培養(yǎng)其他細(xì)胞或作為其他細(xì)胞培養(yǎng)基的添加成分，利用MSCs分泌的各類細(xì)胞因子達(dá)到影響待培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和功能發(fā)揮的目的。采用去血清的MSC-CM直接輸注于人體，是擬將MSC-CM用于臨床的新途徑。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，從人胎盤組織中提取的MSCs，使用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80﹪時(shí)收集的培養(yǎng)基上清液具有穩(wěn)定的治療效果[16]。

近年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，MSC-CM的成分也逐漸被闡明[17]，包括各種細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、蛋白酶以及微小核糖核酸（microRNA，miRNAs）。這些活性成分促進(jìn)細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管再生和減輕炎癥反應(yīng)的作用為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。一方面，輸注含有自體分泌因子的條件培養(yǎng)基可降低移植干細(xì)胞帶來(lái)的致瘤風(fēng)險(xiǎn)，避開(kāi)異體移植帶來(lái)的免疫相容等問(wèn)題[18]；另一方面，通過(guò)體外干預(yù)，控制MSCs分泌因子的成分和含量為將MSC-CM應(yīng)用于個(gè)體化精準(zhǔn)治療開(kāi)拓了新方向。

二、MSC-CM用于AS治療的研究基礎(chǔ)

MSCs是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新及多向分化潛能的干細(xì)胞。在應(yīng)用MSCs治療AS過(guò)程中，一方面，移植的MSCs能夠向血管損傷部位募集，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)損傷；另一方面，MSCs亦可分化為平滑肌細(xì)胞，參與血管增生、再狹窄或者斑塊鈣化。AS是一種病因復(fù)雜的血管壁慢性炎癥性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，機(jī)體內(nèi)環(huán)境、免疫功能強(qiáng)弱、移植細(xì)胞量和移植方式等都會(huì)影響MSCs治療效果。

在AS模型小鼠中，Yoshimasa等[19]發(fā)現(xiàn)尾靜脈輸注脂肪來(lái)源的MSC-CM可以減少小鼠主動(dòng)脈根部粥樣斑塊的面積，而將MSC-CM作用于內(nèi)皮細(xì)胞，可以降低細(xì)胞黏附分子（cell adhesion molecule，CAM）的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞募集，減輕單核細(xì)胞的黏附作用。Basmaeil等[20]則發(fā)現(xiàn)將胎盤來(lái)源的MSC-CM作用于內(nèi)皮細(xì)胞可以修復(fù)過(guò)氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化、以及血管新生功能。而Alshabibi等[21]則發(fā)現(xiàn)蛻膜來(lái)源的MSC-CM可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞谷胱甘肽和硫氧還蛋白還原酶的活性，減輕單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。Doherty等[22]發(fā)現(xiàn)在AS和糖尿病中，MSC-CM具有潛在的抗炎活性。而Frodermann等[23]則報(bào)道了輸注MSCs可以降低血中甘油三酯和膽固醇水平，提出使用“泵療法”持續(xù)輸注MSC-CM降低血脂的構(gòu)想，解決輸注MSCs被攔截在肺、肝、腎的問(wèn)題。國(guó)內(nèi)研究人員采用P3代MSC-CM作用于氧化損傷的肺臟上皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞的凋亡促進(jìn)基因Bax蛋白表達(dá)減弱,凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，提示MSC-CM可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡機(jī)制，發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于AS進(jìn)程中氧化損傷的作用[16]。

Chen等[24]發(fā)現(xiàn)骨髓MSC-CM中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor，IGF）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）、促血管生成素 1（angiopoietin，Ang-1）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell-derived factor，SDF-1）、促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）等表達(dá)水平提高，提示MSC- CM中存在多種有益血管生長(zhǎng)的活性物質(zhì)。Kim等[25]發(fā)現(xiàn)脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)基含有多種生長(zhǎng)因子，具有再生功能，可以保護(hù)細(xì)胞免受化學(xué)物質(zhì)和輻射因素帶來(lái)的氧化損傷。在AS的進(jìn)程中，氧化應(yīng)激是血管損傷、斑塊形成的主要機(jī)制之一，而條件培養(yǎng)基中含有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以減輕氧化損傷，保護(hù)血管。Takanori等[26]證實(shí)了牙髓來(lái)源的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)元祖細(xì)胞的遷移和分化，誘導(dǎo)血管再生，改善大腦中動(dòng)脈閉塞后的缺血性腦損傷，提示在動(dòng)脈狹窄，缺血缺氧引起的心腦損傷中，條件培養(yǎng)基不僅可以用于治療AS，還可以促進(jìn)心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的遷移，改善預(yù)后。浙江大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的MSC- CM可以通過(guò)阻斷BMP2-Smad1/5/8信號(hào)通路抑制血管鈣化[27]，提示MSC-CM可以作為治療AS晚期并發(fā)癥的新靶點(diǎn)。

三、MSC-CM治療AS的機(jī)制研究

AS病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。在AS起始階段，脂類沉積于內(nèi)膜，持續(xù)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等表面特性發(fā)生改變，釋放大量炎性介質(zhì)和氧化代謝產(chǎn)物。內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞黏附分子和炎癥介質(zhì)，促使單核細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，中膜平滑肌細(xì)胞遷入內(nèi)膜，單核細(xì)胞通過(guò)清道夫受體吞噬氧化修飾的低密度脂蛋白，并合成大量細(xì)胞外基質(zhì)和活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），形成 AS 斑塊。

隨著AS的發(fā)展，動(dòng)脈內(nèi)-中膜增厚，管腔中的彌散氧相對(duì)不足，引起血管壁缺血、缺氧，進(jìn)而觸發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、遷移，重塑形成新生毛細(xì)血管。而動(dòng)脈鈣化是晚期AS的并發(fā)癥，是引起心血管事件的重要原因。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）向成骨細(xì)胞的分化在動(dòng)脈鈣化中起重要作用，產(chǎn)生的脂蛋白和磷脂復(fù)合物會(huì)加重血管損傷。衰老、慢性腎病、糖尿病、高血壓和高血脂會(huì)加速鈣化過(guò)程，減輕血管鈣化可以從根本上減少心血管惡性事件的發(fā)生。AS是多細(xì)胞，多因素參與的，伴隨著炎癥反應(yīng)和內(nèi)皮細(xì)胞功能改變的血管損傷性疾病，應(yīng)用MSC-CM治療AS的機(jī)制可以從改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抑制炎癥反應(yīng)和減輕血管鈣化等方面來(lái)闡述。

（一）MSC-CM對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化與抗凋亡作用

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)移植的MSCs進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)通過(guò)分泌抗炎因子及抗氧化酶類物質(zhì)，減輕炎癥及氧化刺激，從而減輕組織損傷。因此認(rèn)為MSC-CM同樣可發(fā)揮抗氧化和組織修復(fù)能力[28-29]。研究也證實(shí)了MSC-CM具有一定的氧自由基清除能力，其抗氧化能力相當(dāng)于100 μmol/L維生素C[16]。

MSC-CM不僅可通過(guò)提高內(nèi)皮細(xì)胞谷胱甘肽和硫氧還蛋白還原酶的活性來(lái)發(fā)揮抗氧化功能[21]，將MSC-CM作用于氧化損傷的肺上皮細(xì)胞，Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路中Nrf2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Keap1分子表達(dá)減弱，提示MSCCM還可能通過(guò)激活Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化作用[16]。

缺氧情況下得到的Akt-MSC條件培養(yǎng)基，可減少大鼠的心肌梗死面積，改善心室功能。其中表達(dá)上調(diào)的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）VEGF、IGF-1等，可抑制低氧誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，并下調(diào)凋亡促進(jìn)基因Bax的表達(dá)，上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，提示MSCCM可通過(guò)自體細(xì)胞因子發(fā)揮抗凋亡作用[30-31]。

持續(xù)高糖環(huán)境可增加血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的通透性使其易于凋亡[32]，而MSC-CM可通過(guò)下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中促細(xì)胞通透性的基因，如ALOX5[33]和NPPB[34]的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)抗細(xì)胞通透性的基因，如NPR1[35]的表達(dá)來(lái)逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Xagorari等[36]發(fā)現(xiàn)MSC-CM可以通過(guò)激活FGL1來(lái)預(yù)防急性肝損傷后的肝細(xì)胞凋亡，而Huang等[37]則稱MSCs的旁分泌因子可以保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞免于凋亡。

（二）MSC-CM調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能基因的表達(dá)

糖尿病，高脂血癥，氧化損傷等會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞活性下降、凋亡增多、遷移能力下降、增殖受損、血管新生能力下降和單核細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)等，而這些因素又促進(jìn)了AS進(jìn)程。MSC-CM通過(guò)旁分泌作用調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能基因的表達(dá)，從分子水平直接影響內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生能力，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減緩AS進(jìn)程。

遷移是早期動(dòng)脈硬化內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，也是影響血管新生的初始階段。MSC-CM作用于內(nèi)皮細(xì)胞可下調(diào)增殖抑制基因CAV1[38]的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)促增殖基因PLAT[39]和PDGFRA[40]的表達(dá)，提示MSC-CM可從分子水平提高內(nèi)皮細(xì)胞的生存率。MSC-CM作用于內(nèi)皮細(xì)胞后可 上 調(diào) EDN1[41]、PF4[42]、ICAM1[43]，SPHK1[44]等 基 因，而這些基因的表達(dá)產(chǎn)物可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。血管新生通常伴隨著細(xì)胞因子的趨化作用，將MSC-CM作用于內(nèi)皮細(xì)胞，白介素 -6（interleukin，IL-6）[45]、IL-8[46-47]、IL-10[48]、IL-11[49]、PDGF-Rβ[50]等細(xì)胞因子的表達(dá)增加。在葡萄糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷后加入MSC-CM，各種抗血管生成基因，包括AGT[50]和COL18A1[51]的表達(dá)下調(diào)；多種促血管生成基因，包括 F2R[52]、ICAM1[43,53]、PGF[54]、CCL2[55]的表達(dá)上調(diào)，為將MSC-CM應(yīng)用于改善血管功能打下基礎(chǔ)。

另一方面，MSC-CM 對(duì)細(xì)胞凋亡（FASLG[56]），損傷（ENG[57]、CX3CL1[58]、F3[59]、THBD[59]、AGTR1[60]）， 炎 癥（IL3[61]、ALOX5[62]、FLT1[63]）也具有調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，MSC-CM可以逆轉(zhuǎn)葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡并通過(guò)提高細(xì)胞生存率，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，降低葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞通透性和單核細(xì)胞浸潤(rùn)的刺激作用來(lái)修復(fù)葡萄糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷（圖1）。流行病學(xué)調(diào)查顯示，高血脂誘發(fā)的AS人群中多數(shù)伴隨糖尿病，而MSC-CM對(duì)葡萄糖損傷的逆轉(zhuǎn)作用為將MSC-CM應(yīng)用于AS的治療開(kāi)辟了廣闊的前景。

圖1 MSC-CM逆轉(zhuǎn)葡萄糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響

（三）MSC-CM減少炎癥細(xì)胞的黏附及炎癥因子的表達(dá)

在AS中，氧化損傷會(huì)帶來(lái)持續(xù)性的炎癥反應(yīng)，而MSC- CM的免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)揮了一定的代償作用。輸注MSC-CM至AS模型小鼠中，體循環(huán)中的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的數(shù)量有所降低。

將MSC-CM作用于人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells，HAOECs），MSC-CM 中含有的 HGF 抑制了單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。HGF可抑制NFκB通路，下調(diào)HAOECs中E-選擇素的表達(dá)，同時(shí)減弱外周血單核細(xì)胞系來(lái)源的單核-巨噬細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。HGF還可以抑制平滑肌細(xì)胞中的JNK通路的活化，抑制脂多糖誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1）表達(dá)，因此JNK（MAPK）和 NFκB 是HGF在內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用的下游靶點(diǎn)，除了HGF，MSC-CM還含有其他多種細(xì)胞因子，包括小分子化合物和細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs)，可能也發(fā)揮一定抗炎作用。

研究發(fā)現(xiàn)，MSC-CM和超濾MSC-CM后得到的EVs可以減少腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）誘導(dǎo)炎癥損傷內(nèi)皮細(xì)胞中黏附分子的表達(dá)。在TNF-α刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞中JNK（MAPK）和NFκB信號(hào)通路被激活，而MSC- CM和EVs可以抑制JNK（MAPK）和NFκB的磷酸化，逆轉(zhuǎn)TNF-α對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。

另一方面，MSC-CM含有的腫瘤生長(zhǎng)因子-β（tumor growth factor，TGF-β），IL-27，TNF-α 刺 激基因 6 和 IL-10也發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。MSC-CM中的IGF-1也可以抑制血管壁的炎癥反應(yīng)，過(guò)氧化損傷以及斑塊的形成。然而IGF-1并不能減少VCAM-1和細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1）的表達(dá)，因此IGF-1在改善內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮的具體作用及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

MSC-CM還可增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞活性，并減弱M1型巨噬細(xì)胞活性。AS小鼠主動(dòng)脈弓的冰凍切片染色顯示，在斑塊形成最初4周，以單核細(xì)胞聚集為主，而在斑塊形成后，巨噬細(xì)胞增殖、聚集進(jìn)一步加重了炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞因子和脂質(zhì)等因素的刺激下，巨噬細(xì)胞分化為不同的表型，M1型巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，將MSC-CM作用于刺激后的巨噬細(xì)胞，可下調(diào)M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，如TNF-α，IL-6和Arg-2，同時(shí)上調(diào)M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，如SRA1、MRC1和Arg-1。應(yīng)用MSC-CM培養(yǎng)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞，MSC-CM中的HGF通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄激活因子3（activator of transcriptional，STAT3），抑制 JNK 和 NFκB 通路來(lái)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2之間的類型轉(zhuǎn)換，減輕炎癥反應(yīng)。而對(duì)脂多糖活化的脾來(lái)源巨噬細(xì)胞，MSC-EVs可以下調(diào)TNF-α的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)IL-10的表達(dá)。MSC-CM對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的影響是不同的，MSC-CM可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)低密度脂蛋白的攝取，卻對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，這可能是其減輕AS的作用機(jī)制之一，但闡明其中的具體機(jī)制還有待深入研究。

（四）MSC-CM抑制血管鈣化

隨著AS的發(fā)展，冠狀動(dòng)脈中的鈣沉積，加重了AS斑塊的不穩(wěn)定性，常導(dǎo)致急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)生。VSMCs向骨（軟骨）細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及其去分化是血管鈣化的重要環(huán)節(jié)，但其發(fā)生機(jī)制尚不明確。MSC-CM通過(guò)阻斷BMP2- Smad1/5/8信號(hào)通路抑制β-甘油磷酸（glycerol phosphate，β-GP）誘導(dǎo)的血管鈣化，發(fā)揮關(guān)鍵性的保護(hù)作用[27]。MSC-CM可降低VSMCs中的鈣含量和堿性磷酸酶活性，減少VSMCs表面成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，如：Msx2、Runx2和骨鈣蛋白（osteocalcin，OC），提示MSC-CM可被用于預(yù)防或治療血管鈣化。

炎癥是動(dòng)脈鈣沉積的關(guān)鍵因素，鈣化本身已被確定為活躍的炎癥過(guò)程，在不同血管部位（內(nèi)膜，中膜，外膜），不同程度的鈣沉積是AS中非常普遍的現(xiàn)象[64-66]。研究也證實(shí)了血管鈣化是多種炎癥因子共同參與的過(guò)程：TNF通過(guò)促進(jìn)骨形態(tài)蛋白-2（bone morphogenetic protein，BMP-2）的釋放、增強(qiáng)BMP-2的活性來(lái)加速VSMCs中的鈣沉積；IL-1可以增強(qiáng)非組織特異性堿性磷酸酶的活性，而IL-6可以通過(guò)抑制基質(zhì)γ羧基谷氨酸蛋白（matrix gamma carboxyglutamic acid protein，MGP）來(lái)增強(qiáng)BMP-2的活性。研究發(fā)現(xiàn)，MSC-CM中的TNF-α刺激基因-6，前列腺素E2，吲哚胺-2, 3-雙加氧酶，一氧化氮合酶和IL-10發(fā)揮了抗炎作用。同時(shí)MSC-CM下調(diào)了TNF、IL-1和IL-6的表達(dá)，這可能也是MSC-CM減輕鈣化的機(jī)制之一。而MSC-CM中含有的其他細(xì)胞因子，如IGF-1和VEGF可能也在減輕鈣化中發(fā)揮了重要作用。

四、結(jié)論

采用不同預(yù)處理方法得到的MSC-CM中可能含有不同的細(xì)胞因子，如低氧預(yù)處理MSCs，可提高M(jìn)SC-CM中VEGF、IGF-1、HGF 和 Ang-1的含量[67]；以細(xì)胞因子預(yù)處理MSCs，也可以誘導(dǎo)MSC-CM中活性成分的改變，如VEGF的表達(dá)上調(diào)[68]；而采用三維球體技術(shù)培養(yǎng)MSCs，可上調(diào) MSC-CM 中趨化因子（CXCR4）、抗癌蛋白（TRAIL、IL- 24、CD82）和抗炎蛋白（TSG-6）的表達(dá)[69]。

將MSC-CM作為干細(xì)胞治療的替代療法應(yīng)用于臨床，有助于克服干細(xì)胞治療帶來(lái)的致瘤隱患?，F(xiàn)階段，應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病的前提是干細(xì)胞在移植后依然保持其移植前的特性，然而考慮到機(jī)體環(huán)境復(fù)雜，疾病成因的“土壤學(xué)說(shuō)”，很難確保干細(xì)胞在不同土壤中的最終結(jié)局。應(yīng)用條件培養(yǎng)基，不僅過(guò)程可控，結(jié)果也是可以預(yù)期的，并在劑量和給藥方式上有更大的靈活性。然而，輸注MSC-CM確實(shí)難以模擬移植MSCs對(duì)活性因子持續(xù)、動(dòng)態(tài)的分泌。此外，條件培養(yǎng)基含有動(dòng)物血清以及死細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）釋放的蛋白質(zhì)[70]，直接輸注或有一定風(fēng)險(xiǎn)。因此，將MSC-CM治療AS真正用于臨床前，還需要更多的體內(nèi)（體外）實(shí)驗(yàn)探究MSC-CM中具體的活性成分及其作用機(jī)制。