臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)TLR4/NF-κB炎癥通路及氧化應(yīng)激改善NAFLD大鼠肝臟損傷作用研究

王文清 易文城 林擁華

伴隨著社會(huì)進(jìn)步和生活方式改變，非酒精性脂肪肝病（non alcohol fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病率呈現(xiàn)逐年攀升趨勢，而且患者漸趨低齡化，已成為本世紀(jì)重要的公共健康問題之一[1]。目前NAFLD確切的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，除了公認(rèn)的“兩次胰島素抵抗打擊”，還有研究提示其發(fā)病與機(jī)體炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)[2-3]。而臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）具有獨(dú)特的直接和間接修復(fù)機(jī)體多種組織功能的作用[4]，但其對NAFLD肝臟受損的作用及機(jī)制研究鮮見報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)對照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討hUC-MSCs對NAFLD大鼠肝臟損傷的作用及其與TLR4/NF-κB和氧化應(yīng)激的關(guān)系。

材料與方法

一、材料

1.動(dòng)物：清潔級SD大鼠34只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，基礎(chǔ)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

2.hUC-MSCs：hUC-MSCs制備方法為剪取足月產(chǎn)婦臍帶基質(zhì)組織塊，采用膠原酶Ⅳ消化，留取懸液，離心、萃取，沉淀，再以0.05﹪胰蛋白酶消化，過濾，留取含有細(xì)胞濾液，離心、計(jì)數(shù)細(xì)胞，采用不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基接種、常規(guī)培養(yǎng)及傳代。本實(shí)驗(yàn)選用第3 ～ 7代細(xì)胞。

二、方法

1.NAFLD造模方法：采用高糖高脂飼料8周喂養(yǎng)SD大鼠建立NAFLD模型。飼料配方62.5﹪基礎(chǔ)飼料、20﹪蔗糖、15﹪豬油和2.5﹪膽固醇。

2.實(shí)驗(yàn)大鼠分組：SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC組）和NAFLD造模組。NC組10只以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。NAFLD造模大鼠20只再次隨機(jī)分為模型對照組（MC組）和hUC-MSCs治療組（MC+hUCMSCs組）。MC組和MC+hUC- MSCs組大鼠均繼續(xù)給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，其中，MC+hUC-MSCs組每兩周尾靜脈注射含hUC-MSCs數(shù)目為5×106個(gè)的培養(yǎng)液100 μl，共干預(yù)8周。

3.實(shí)驗(yàn)大鼠治療方法：MC+hUC-MSCs組每兩周尾靜脈注射100 μl含5×106個(gè)hUC-MSCs的培養(yǎng)液，NC組和MC組每兩周尾靜脈注射不含hUC- MSCs的等容積培養(yǎng)液。治療時(shí)間共8周。

4.實(shí)驗(yàn)大鼠一般指標(biāo)觀察、血清及肝臟組織標(biāo)本的采集：密切觀察并記錄大鼠飲食、精神、活動(dòng)狀態(tài)和體重等一般狀況；治療8周后各組大鼠以尾靜脈采血方式留取血清標(biāo)本，并稱鼠體重和鼠肝濕重，計(jì)算肝指數(shù)（﹪）=（肝濕重/體重）×100﹪，剪取肝臟組織標(biāo)本并給予適宜保存。

5.血清相關(guān)指標(biāo)：甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、空腹血糖（FPG）和空腹胰島素（FINS）；計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FPG×FINS/22.5（FPG：mmol/L，F(xiàn)INS：mU/L）。

6.大鼠肝臟組織行HE染色并采用光鏡和透射電鏡觀察組織病理：遵循美國國立衛(wèi)生研究院2011年NASH臨床研究網(wǎng)病理工作組指南，評定NAFLD 活動(dòng)度積分（NAFLD activity score，NAS），分級為 0 ～ 8分，包括：（1）肝細(xì)胞脂肪變：0分（＜ 5﹪）；1分（5﹪～ 33﹪）；2分（34﹪～ 66﹪）；3 分（＞ 66﹪）。（2）小葉內(nèi)炎癥（20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶）：0分，無；1分（＜ 2個(gè)）；2分（2 ～ 4個(gè)）；3分（＞ 4 個(gè)）。（3）肝細(xì)胞氣球樣變：0分，無；1分，少見；2分，多見。

7.Western Blot法檢測組織蛋白表達(dá)：取大鼠肝臟組織經(jīng)PBS漂洗，組織裂解液提取總蛋白，聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后加 VEGF抗體（1:1 000）、抗 HIF-1α抗體（1:1 000）、β-action（1:5 000）過夜，TBCT 漂洗再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育，TBGT漂洗，加入ECL暗室曝光，用Fluor-s凝膠系統(tǒng)分析蛋白條帶，蛋白的相對含量以目的蛋白吸光密度面積與GAPDH條帶的比值表示。檢測各組大鼠肝臟組織 8-OHdG、SOD、TNF-α、IL-6、TLR4和 NF-κB等蛋白表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，肝指數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和胰島素抵抗指數(shù)用± s表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、比較各組大鼠治療8周后體重、肝濕重和肝指數(shù)

治療8周后，與NC組比較，MC組和MC+hUC-MSCs組大鼠體重、肝濕重和肝指數(shù)均增高（P＜0.05），與 MC 組比較，MC+hUC-MSCs組大鼠體重、肝濕重和肝指數(shù)均降低（P＜0.05，表 1）。

表1 各組大鼠治療8周體重、肝濕重和肝指數(shù)比較（± s）

表1 各組大鼠治療8周體重、肝濕重和肝指數(shù)比較（± s）

注：NC組為正常對照組；MC組為模型對照組；hUC-MSCs治療組為MC+hUC-MSCs組與NC組比較，aP＜ 0.01；與MC組比較，bP＜ 0.01

分組 鼠數(shù)（只） 體重（g） 肝濕重（g） 肝指數(shù)（﹪）NC 組 10 376±16.3 6.38±3.15 2.03±0.07 MC 組 10 410±13.7a31.89±7.25a 7.09±0.02a MC+hUC-MSCs組 10 395±18.3a17.13±7.36ab4.11±0.08ab F值 11.05 42.18 16585.64 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

二、比較各組大鼠治療8周后TG、TC、LDL、HDL

治療8周后，與NC組比較，MC組大鼠TG、TC 和 LDL 增高（P＜ 0.05），HDL 降低（P＜ 0.05）；與MC組比較，MC+hUC-MSCs組大鼠TG、TC和LDL 均有不同程度降低（P＜ 0.05），HDL 增高（P＜0.05，表 2）。

三、比較各組大鼠治療8周后ALT、AST和HOMA-IR

治療8周后，與NC組比較，MC組大鼠ALT、AST和HOMA-IR均升高（P＜ 0.05）；與MC 組比較，MC+hUC-MSCs組大鼠ALT、AST和HOMAIR 均有不同程度的降低（P＜ 0.05，表 3）。

四、比較各組大鼠治療8周后HE染色光鏡下肝臟組織病理變化

NC組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核清晰，肝小葉排列有序；MC組大鼠肝細(xì)胞呈彌漫性脂肪變性，胞核變形，肝小葉紊亂伴炎癥細(xì)胞浸潤；MC+hUCMSCs組上述肝組織病理改變好轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞較少脂肪變性，大部分胞核清晰，肝小葉排列紊亂改善，僅少量炎癥細(xì)胞浸潤。（圖1）

五、比較各組大鼠治療8周后NAS積分

干預(yù)8周，與NC組比較，MC組大鼠NAS積分增高；與MC組比較，hUC- MSCs治療組大鼠NAS 積分降低 [（0.36±0.16）分vs（8.72±0.35）分、（4.78±0.51）分，（P＜ 0.05）]。

表2 各組大鼠治療8周TG、TC、LDL、HDL比較（mmol/L± s）

表2 各組大鼠治療8周TG、TC、LDL、HDL比較（mmol/L± s）

注：與 NC 組比較，aP＜ 0.01；與 MC 組比較，bP＜ 0.01

分組 鼠數(shù)（只） TG TC LDL HDL NC 組 10 0.96±0.29 2.23±0.37 0.71±0.18 2.95±0.27 MC 組 10 5.79±0.68a 6.08±0.79a 6.06±0.31a 0.75±0.18a MC+hUC-MSCs組 10 3.69±0.83ab 4.52±0.63ab 3.62±0.18ab 1.31±0.26ab F值 142.43 97.15 1337.60 226.81 P 值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

六、比較各組大鼠治療8周后透射電鏡肝臟組織病理變化

NC組肝細(xì)胞核大而圓，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊，線粒體結(jié)構(gòu)清晰；MC組肝細(xì)胞漿內(nèi)充滿脂肪滴，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫，線粒體結(jié)構(gòu)不同程度破壞如嵴斷裂；MC+hUC-MSCs組肝細(xì)胞漿脂肪滴減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫減輕，線粒體結(jié)構(gòu)較清楚（圖2）。

七、比較各組大鼠治療8周后Western Blot法檢測肝臟組織 TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α、8-OHdG和SOD蛋白表達(dá)

與 NC 組比較，MC 組肝組織 TNF-α、IL-6、8-OHdG 、TLR4 和 NF-κB 蛋 白 表 達(dá) 均增高（P＜0.05），SOD 降 低（P＜ 0.05）； 與 MC 組 比 較，MC+hUC-MSCs組 肝 組 織 TNF-α、IL-6、8-OHdG、TLR4 和 NF-κB 蛋白表達(dá)均降低（P＜ 0.05），SOD增高（P＜ 0.05）（圖 3，圖 4）。

表3 各組大鼠治療8周ALT 、AST和HOMA-IR比較（± s）

表3 各組大鼠治療8周ALT 、AST和HOMA-IR比較（± s）

注：與NC 組比較，aP＜ 0.01；與 MC組比較，bP＜ 0.01

分組 鼠數(shù)(只) ALT(U/L) AST(U/L) HOMA-IR NC 組 10 39.8±5.3 52.5±6.4 1.51±0.19 MC 組 10 157.3±8.7a 176.4±9.8a 21.6±2.13a MC+hUC-MSCs組 10 93.6±9.1ab 114.3±8.6ab 7.2±0.81ab F值 556.25 545.76 615.15 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖1 光鏡下觀察各組大鼠治療8周肝臟組織病理改變（HE染色，×200）

圖2 透射電鏡下觀察各組大鼠治療8周肝臟組織病理改變（×7 000）

圖3 各組大鼠治療8周Western Blot法檢測肝臟組織TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α、8-OHdG 和 SOD 蛋白表達(dá)水平

圖4 各組大鼠干預(yù)8周Western Blot法檢測肝臟組織TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α、8-OHdG 和 SOD 相對蛋白水平比較

討 論

NAFLD指排除酒精和其他明確的肝損害原因、由遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激等所致的脂質(zhì)在肝細(xì)胞沉積為主要病理特征，早期呈現(xiàn)單純性脂肪性肝病，但目前臨床缺乏有效的治療手段，可進(jìn)一步進(jìn)展至脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化、肝硬化甚至肝惡性腫瘤[5]。目前NAFLD的發(fā)病機(jī)制公認(rèn)為經(jīng)典的“兩次胰島素抵抗打擊”學(xué)說[6]，即胰島素抵抗首次打擊可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積，過量沉積的脂質(zhì)可進(jìn)一步引發(fā)胰島素抵抗，這二次胰島素抵抗將促使肝臟脂質(zhì)過氧化[7]，可激活細(xì)胞膜上Toll樣受體-4（tolllike receptor 4，TLR4），刺激核轉(zhuǎn)錄因子 -κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB），激活 NF-κB 使肝細(xì)胞線粒體膜損傷，導(dǎo)致呼吸鏈功能受損，線粒體結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙，最終引發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生炎性壞死和肝纖維化[8-9]。胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激形成惡性循環(huán)、共同促進(jìn)NAFLD的病程進(jìn)展[10-11]。本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飼料喂食SD大鼠誘導(dǎo)NAFLD模型，模型組大鼠胰島素抵抗指數(shù)和肝功轉(zhuǎn)氨酶增高，光鏡和電鏡下觀察到大鼠肝組織呈不同程度脂肪變性和炎性病理改變，Western Blot法檢測其肝臟組織TNF-α、IL-6、8-OHdG、TLR4 和 NF-κB 蛋白表達(dá)增高，SOD蛋白表達(dá)均降低，證實(shí)了NAFLD與胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激失衡相關(guān)。

藥物如胰島素增敏劑和抗氧化劑等對NAFLD的治療效果尚不確切[12-13]。NAFLD常伴發(fā)肥胖、糖尿病、高尿酸血癥等代謝性疾病[14-15]。近年研究提示干細(xì)胞具有抗炎癥及抗氧化應(yīng)激的作用，并已成為治療代謝性疾病及其并發(fā)癥的研究熱點(diǎn)。因此，探討hUC-MSCs對NAFLD肝臟受損的作用及其機(jī)制具有臨床應(yīng)用價(jià)值。hUC-MSCs已被證實(shí)可直接定向歸巢至受損的肝臟組織，通過分泌血管內(nèi)皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子等促進(jìn)肝細(xì)胞再生、減少c-Jun氨基末端激酶和p38促分裂原活化蛋白激酶的活化，抑制肝細(xì)胞變性及凋亡，改善肝臟功能[16]。hUC-MSCs還可調(diào)控免疫炎癥穩(wěn)態(tài)，有研究報(bào)道其可促進(jìn)肝臟血紅素加氧酶的表達(dá)以降低炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介質(zhì)-6和單核細(xì)胞趨化因子-1表達(dá)，減輕機(jī)體系統(tǒng)性和肝臟組織局部炎癥反應(yīng)，從而修復(fù)肝功能損傷的作用[17]。此外，干細(xì)胞亦可具有旁分泌效應(yīng)分泌各種體液因子以促進(jìn)肝細(xì)胞再生和功能改善[18]。在本實(shí)驗(yàn)中采用hUC-MSCs對NAFLD模型大鼠進(jìn)行治療，治療組較模型組大鼠肝功谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶降低、胰島素抵抗指數(shù)降低，光鏡和電鏡下觀察顯示肝組織病理改變改善，尤其是電鏡下可見肝細(xì)胞漿內(nèi)脂肪滴、細(xì)胞核擠壓、線粒體結(jié)構(gòu)模糊及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫等病變好轉(zhuǎn)，肝組織 TNF-α、IL-6、8-OHdG、TLR4 和 NF-κB 蛋白表達(dá)均降低、SOD增高。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示hUC-MSCs可能通過抑制TLR4/NF-κB炎癥通路及氧化應(yīng)激機(jī)制對NAFLD大鼠受損肝臟功能具有改善作用。