李睿，安建平，由春香，王小非，郝玉金

（山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院/作物生物學國家重點實驗室/農業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，山東泰安 271018）

0　引言

【研究意義】磷是植物生長發(fā)育過程中必需的營養(yǎng)元素，其不僅參與植物體內重要化合物（磷脂、ATP和核酸等）的形成[1]，而且在植物生命活動過程（光合作用、呼吸作用和信號轉導等）中發(fā)揮著重要作用[2]。然而，多數(shù)土壤中磷元素分布不均，并且多以植物難以利用的有機磷形式存在，植物因此常常受低磷脅迫影響[3]。在生產中，人們通過施用磷肥來改善土壤有效磷含量不足的狀況提高作物產量，但卻導致了一系列環(huán)境污染問題[4]。因此，通過分子生物學手段發(fā)掘優(yōu)質基因，通過轉基因手段提高作物磷吸收能力對減少化肥使用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】紫色酸性磷酸酶（purple acid phosphatases，PAP）主要由植物在低磷條件下分泌產生，能夠在有機磷底物上水解磷酸基團，產生有效磷供植物吸收利用[5-6]。目前，許多植物的PAP已被鑒定出來，如擬南芥[7]、煙草[8]、番茄[9]、玉米[10]、水稻[11]、和大豆[12]等，并且許多PAP的轉錄與翻譯明顯受低磷條件的誘導。在擬南芥中，一共發(fā)現(xiàn) 29個AtPAP，在多個方面影響擬南芥的生長發(fā)育，其中AtPAP10是根表面最主要的酸性磷酸酶，并且atpap10突變體對磷的吸收明顯受到抑制，長勢弱于野生型[13]；AtPAP15在種子和花粉萌發(fā)時期磷酸鹽的利用過程發(fā)揮重要作用[14]；AtPAP23在花器官中明顯積累，可能參與了花器官的發(fā)育[15]；atpap26突變體葉片衰老延遲，可能參與植物體內磷元素的回收利用過程[16]。在水稻中，存在26個OsPAP，可分為3個家族和7個亞家族，其中有4個基因（OsPAP10a、OsPAP10b、OsPAP10c和OsPAP10d）與AtPAP10同源性最高。OsPAP10a和OsPAP10c明顯受低磷誘導，并且在轉錄水平上均受OsPHR2、OsPHO2和OsSPXI的調控。進一步研究表明，過表達OsPAP10a和OsPAP10c增加水稻的分蘗數(shù)，并且提高水稻在低磷條件下的磷含量[17]。而OsPAP26在蛋白水平受缺磷誘導和衰老調控，但在轉錄水平對缺磷沒有響應[18]?！颈狙芯壳腥朦c】蘋果作為多年生木本果樹，磷元素的豐缺對果樹生長和產量具有重要影響。雖然目前關于紫色酸性磷酸酶（PAP）已有大量研究，但主要集中在擬南芥和水稻等草本植物，而 PAP在蘋果中的研究尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究以‘嘎啦’蘋果（Malus×domestica‘Royal Gala’）為材料，通過基因克隆獲得蘋果紫色酸性磷酸酶基因MdPAP10，并對其表達模式及基因功能進行研究，運用分子生物學手段驗證 MdPAP10在蘋果響應低磷過程中所起到的重要作用。

1　材料與方法

1.1　材料收集與處理

本試驗所用到的植物材料有‘嘎啦’（Malus×domestica‘Royal Gala’），蘋果‘王林’（‘Orin’）愈傷組織。11年生自根‘嘎啦’蘋果種植在山東果樹科學研究所的果樹試驗田（山東泰安）。于2016年5月開始，分別對‘嘎啦’蘋果當年新生根、幼莖、新生葉、初花時的花和花后30 d的幼果取樣，取樣后迅速放入液氮中，于-80℃保存。

‘王林’蘋果葉片誘導的愈傷組織用來進行遺傳轉化。愈傷組織放置在繼代培養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基+1.0 mg·L-12,4-D+1.0 mg·L-16-BA）室溫（24℃）暗培養(yǎng)。并且每隔15 d繼代一次。

‘嘎啦’組培苗生長于繼代培養(yǎng)基（MS 培養(yǎng)基+0.2 mg·L-1IAA+0.8 mg·L-16-BA），其生長條件為14 h光照/10 h黑暗，溫度24℃。選擇繼代20 d長勢一致的‘嘎啦’蘋果組培苗，轉移到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+1 mg·L-1IAA）進行生根處理。30 d后選擇生根一致的10棵蘋果苗進行低磷脅迫處理。將5棵蘋果苗置于低磷營養(yǎng)液（50 μmol·L-1Pi）中，分別于 0、3、6、12和48 h取樣；另外5棵蘋果苗作為對照置于正常磷含量（1.25 mmol·L-1Pi）營養(yǎng)液中，分別于0、3、6、12和48 h取樣。

正常磷含量營養(yǎng)液（+Pi）：MS營養(yǎng)液[19]；

低磷營養(yǎng)液（-Pi）：KH2PO4含量為正常 MS營養(yǎng)液的1/25，另加入0.6 mmol·L-1K2SO4，其他成分含量不變[20]。

1.2　MdPAP10的克隆、蛋白質結構域分析和同源性分析

以擬南芥AtPAP10氨基酸序列在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，獲得同源性最高的基因（MDP0000272096）。根據(jù)檢索到的基因序列設計引物，以‘嘎拉’組培苗的cDNA[21]為模板進行PCR擴增。PCR擴增反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，35次循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，回收目的條帶后連接到 pMD18-T克隆載體上進行測序。以MDP0000272096的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi. nlm. nih. gov/）中進行檢索和蛋白質結構預測，下載對應的其他物種的氨基酸序列。通過MEGA5.0軟件構建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹。

表1　本研究中所用的引物Table 1　Primers used in this study

1.3　總RNA的提取及實時熒光定量PCR分析

試驗材料的 RNA提取采用康為世紀科技有限公司的全能型植物RNA提取試劑盒（DNase I）。反轉錄采用連寶生物公司 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒。選取MdActin（GenBank accession number CN938024）為內參基因。使用Ultra SYBR Mixture（with ROX）試劑盒（康為世紀）進行實時熒光定量PCR分析。熒光定量PCR儀器型號為BIO-RAD IQ5，所有PCR反應都設3次生物學重復。PCR反應體系為：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上游引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，下游引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR反應程序為：94℃預變性10 min，94℃變性15 s，56℃退火15 s，65℃延伸10 s，40個循環(huán)；每次循環(huán)第2步進行熒光采集。試驗結果采用2-??CT法對數(shù)據(jù)進行分析。

1.4　載體構建及蘋果愈傷轉化和鑒定

通過限制性內切酶分別對 pBI121表達載體和pMD18-T中間載體進行酶切反應，將酶切產物回收后在16℃進行連接反應。連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞。成功篩選到陽性克隆，獲得 MdPAP10-pBI121植物過表達載體。

將構建的 MdPAP10過表達載體轉化農桿菌LBA4404，然后用篩選到的陽性農桿菌侵染繼代10 d左右處于指數(shù)生長期的蘋果‘王林’愈傷組織。浸泡15 min后過濾掉菌液，并用無菌水清洗2—3次。將愈傷組織轉移至固體繼代培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d，再轉移至含300 mg·L-1頭孢霉素和30 mg·L-1卡那霉素的繼代培養(yǎng)基篩選一個月以上，獲得具有抗性的愈傷組織，并在抗性培養(yǎng)基上繼代多次獲得穩(wěn)定的抗性愈傷組織，提取DNA，用于PCR鑒定。

1.5　BCIP染色及愈傷表面酸性磷酸酶活性檢測

低磷條件會誘導植物分泌酸性磷酸酶。附著在植物材料表面的酸性磷酸酶可以與 BCIP反應，并生成藍色產物?？梢砸罁?jù)產物顏色的深淺判斷酸性磷酸酶活性的高低[22]。

選取生長狀態(tài)一致的野生型和過表達 MdPAP10的轉基因愈傷，分別平鋪在正常磷含量培養(yǎng)基和低磷培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d。將BCIP溶液（含有0.01% BCIP（w/v）和0.5%瓊脂（w/v））放入微波爐中加熱，沸騰數(shù)次后冷卻至45—50℃[23]。將冷卻的BCIP溶液均勻覆蓋正常和低磷培養(yǎng)的愈傷組織，1 h后觀察拍照。將染色后的愈傷組織取出，放入1.5 mL離心管中，加入1 mL DMSO，震蕩混勻，12 000 r/min離心2 min取上清，測定A635[24]。

正常磷含量培養(yǎng)基（+Pi）：MS培養(yǎng)基+1.0 mg·L-16-BA+1.0 mg·L-12,4-D；低磷培養(yǎng)基（-Pi）：KH2PO4含量為正常MS培養(yǎng)基的1/25，其他成分含量不變，添加 0.6 mmol·L-1K2SO4、1.0 mg·L-16-BA、1.0 mg·L-12,4-D。

1.6　愈傷組織磷含量測定

稱取1 g左右愈傷組織，在液氮中充分研磨，加入100 μL磷提取液混勻，轉入1.5 mL離心管中。再加入900 μL 1%冰乙酸，上下顛倒混勻，于42℃反應30 min。12 000 r/min離心5 min，吸取300 μL上清提取液到700 μL顯色液中，上下顛倒混勻，于42℃反應30 min后測定A820。依據(jù)標準曲線計算磷含量[25]。

磷提取液（1 L）：1 mol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）10 mL，0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）2 mL，NaCl 5.844 g，P-巰基乙醇 700 μL，100 mmol·L-1PMSF（現(xiàn)用現(xiàn)加）10 mL。

顯色液（100 mL）：(NH4)6Mo7O2·4H2O 0.35 g，98%硫酸2.339 mL，抗壞血酸1.4 g，滴定水定容到100 mL。

1.7　數(shù)據(jù)分析

使用DPS 7.05數(shù)據(jù)分析軟件，進行顯著性分析。不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（P＜0.05）。所有試驗均重復3次。

2　結果

2.1　MdPAP10的克隆、蛋白質結構域分析、基因結構分析和同源性分析

以‘嘎拉’組培苗的cDNA為模板，克隆得到一條約1 300 bp的條帶，與預期結果一致。對克隆到的片段進行回收測序分析。結果表明，目的基因片段含有完整的開放閱讀框，長度為1 332 bp，編碼443個氨基酸和一個終止子，命名為MdPAP10。結構域分析表明，MdPAP10包含有一個信號肽和一個磷酸酶結構域，與擬南芥中的AtPAP10結構相似（圖1-A），證明 MdPAP10屬于磷酸酶基因家族。基因結構分析顯示，MdPAP10包含5個外顯子和4個內含子（圖1-B）。

將蘋果 MdPAP10的氨基酸序列與白梨、桃、草莓和擬南芥等10種不同植物的MdPAP10氨基酸序列進行比對，構建 Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹。進化樹分析結果表明，蘋果MdPAP10與白梨PbPAP10的同源性最高，親緣關系最近（圖1-C）。

圖1　MdPAP10蛋白質結構域分析（A）、基因結構分析（B）及進化樹分析（C）Fig. 1　MdPAP10 functional domain analysis (A) , gene structure analysis (B) and phylogenetic tree analysis (C)

2.2　蘋果MdPAP10基因的分析

采用qRT-PCR分析MdPAP10在11年生自根‘嘎啦’蘋果不同器官中的表達情況。結果表明，MdPAP10在蘋果根中的表達量最高，在葉中的表達量次之，在果實中的表達量最低（圖2-A）。分別在正常和低磷條件下，處理長勢一致的‘嘎啦’蘋果苗，檢測MdPAP10在蘋果根和葉中的表達情況。結果表明，MdPAP10在根中隨低磷處理時間的延長表達量逐漸升高，在6 h的時候達到最高值，而后逐漸下降（圖2-B）。在低磷條件下，MdPAP10在葉中表達量明顯低于正常條件，但表達量比較穩(wěn)定，沒有明顯波動（圖2-C）。

圖2　MdPAP10在蘋果不同器官（A）、不同磷條件下根（B）和葉（C）中的相對表達量Fig. 2　Relative expression of MdPAP10 in different organs, root (B) and leaf (C) under different phosphorus condition of apple

2.3　載體構建與轉基因蘋果愈傷鑒定

通過限制性內切酶分別對pBI121表達載體和pMD18-T中間載體進行酶切反應，將酶切產物回收后進行連接，隨后將連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，獲得MdPAP10-pBI121植物過表達載體（圖 3-A）。將構建的 MdPAP10-pBI121過表達載體轉化農桿菌LBA4404后，侵染蘋果愈傷組織。通過35S啟動子和MdPAP10的篩選引物PCR鑒定得到MdPAP10轉基因蘋果愈傷（L1和L2）（圖3-B），進而通過qRT-PCR檢測MdPAP10在轉基因蘋果愈傷中的表達水平（圖 3-C），結果表明轉基因愈傷MdPAP10表達量高于野生型。

圖3　MdPAP10-pBI121結構示意圖（A）、轉基因蘋果愈傷鑒定（B）和MdPAP10表達水平檢測（C）Fig. 3　Schematic diagram of the MdPAP10-pBI121 structure (A), identification of transgenic apple calli (B) and detection of MdPAP10 expression in transgenic apple calli (C)

圖4　野生型和轉基因蘋果愈傷BCIP染色（A）和酸性磷酸酶活性測定（B）Fig. 4　BCIP staining (A) and the measurement on acid phosphatase activity of wild type and transgenic apple calli

2.4　過量表達 MdPAP10促進了蘋果愈傷酸性磷酸酶在低磷條件下的分泌

將生長狀態(tài)一致的野生型蘋果愈傷與 MdPAP10轉基因愈傷同時放于正常磷含量（+Pi）和低磷含量（-Pi）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，之后用BCIP溶液進行染色。結果表明，在正常磷含量條件下 MdPAP10轉基因愈傷有少量染色痕跡（圖 4-A），存在少量酸性磷酸酶的分泌；而在低磷條件下，MdPAP10轉基因愈傷相比于野生型著色更深（圖4-A），酸性磷酸酶活性更高（圖4-B）。說明在低磷條件下，過表達MdPAP10能夠促進酸性磷酸酶的分泌。

2.5　過量表達 MdPAP10促進蘋果愈傷對低磷脅迫的耐受性

既然 MdPAP10能夠促進蘋果在低磷條件下酸性磷酸酶的分泌，為驗證MdPAP10是否能夠提高蘋果對低磷脅迫的耐受性，將MdPAP10過表達愈傷與野生型愈傷放置于正常磷含量（+Pi）和低磷含量（-Pi）的培養(yǎng)基中長時間培養(yǎng)20 d，觀察愈傷組織的生長狀況。結果表明，在正常條件下，轉基因愈傷與野生型相比并無明顯差異；而在低磷條件下，轉基因愈傷的生長量明顯大于野生型（圖5-A、B）。進一步檢測愈傷組織中的磷含量，發(fā)現(xiàn) MdPAP10轉基因愈傷能夠在低磷條件下明顯促進磷吸收（圖5-C）。

圖5　野生型和轉基因蘋果愈傷生長狀況（A）、鮮重（B）和磷含量測定（C）Fig. 5　Growth status (A) and the measurement on fresh weight (B) and Pi content (C) of wild type and transgenic apple calli

2.6　過量表達 MdPAP10促進蘋果愈傷中磷相關基因的表達

為進一步深入研究MdPAP10促進磷吸收的分子機理，通過qRT-PCR檢測低磷條件下MdPAP10轉基因蘋果愈傷中磷相關基因（MdPHT1.1、MdPT2、MdPS2、MdPS3、MdRNS1和MdPHO1）的表達情況。結果表明，這些磷相關基因的表達量均明顯上調（圖6）。說明低磷條件下 MdPAP10可能通過影響磷相關基因的表達，促進蘋果對磷的吸收。

3　討論

磷是植物生長發(fā)育所必須的大量元素，而土壤中有效磷的缺乏常常成為影響植物生長的限制因素[3,26]。而紫色酸性磷酸酶作為一類植物吸收磷所依賴的關鍵酶，在植物響應低磷和信號轉導過程中發(fā)揮了重要調控作用[27-29]。隨著分子生物學的進步和基因組數(shù)據(jù)庫的不斷豐富，越來越多的PAP，被不斷的發(fā)現(xiàn)和鑒定，但各PAP的功能并不完全相同。在擬南芥的29個AtPAP中，明顯受低磷誘導的只有 AtPAP10、AtPAP11、AtPAP12、AtPAP17、AtPAP25和AtPAP26[21]。研究顯示，將AtPAP12和AtPAP26突變后，擬南芥酸性磷酸酶活性明顯下調，說明AtPAP12和AtPAP26對植物吸收利用外界有機磷至關重要[30]。而AtPAP17不僅受低磷誘導，而且還受鹽脅迫和ABA的誘導；推測AtPAP17可能在磷脅迫與逆境脅迫的信號轉導過程中起著重要作用[31]。目前，許多PAP具體功能仍不清晰，是否通過其他途徑影響磷的代謝與吸收仍需要進一步研究。對于已鑒定的 PAP研究多集中在功能鑒定方面，只有 AtPAP10研究相對深入一些。目前研究表明，局部信號調控低磷誘導 AtPAP10蛋白的積累和分泌，并且乙烯信號和糖信號可能通過不同途徑影響 AtPAP10的活性。進一步研究顯示，AtMYB2、miR399過表達植株和AtPHO2突變體均能正調控根表面酸性磷酸酶的積累，并且能夠調控AtPAP10的轉錄；說明AtPAP10可能參與到經典的 AtMYB2-miR399-AtPHO2信號通路過程，并且位于AtPHO2下游[13]。但是，AtPHO2影響AtPAP10的分子機制仍不清楚。SUN等[32]研究表明，AtPAP10啟動子中包含有多個P1BS元件，植物低磷響應的關鍵轉錄因子 PHR1及其同源基因AtPHLs能夠結合到AtPAP10啟動子上調控AtPAP10的轉錄。

圖6　磷相關基因表達水平檢測Fig. 6　Detection of phosphorus related gene expression

本研究結果表明，MdPAP10在根部明顯受低磷條件的誘導，而低磷條件下 MdPAP10在葉中表達量較低，說明MdPAP10對低磷脅迫有明顯響應。MdPAP10轉基因愈傷組織在正常條件下能夠分泌少量酸性磷酸酶，而在低磷條件下，能夠顯著促進酸性磷酸酶的分泌，并且促進磷吸收，進而提高了蘋果‘王林’愈傷組織對低磷脅迫的耐受性。說明 MdPAP10很可能存在翻譯后水平的調控。在低磷條件下，可能存在其他酸性磷酸酶相關基因與 MdPAP10共同調控植物對低磷的響應過程。本研究證明在木本植物中PAP與草本植物的PAP具有相似的功能，都能夠促進低磷條件下酸性磷酸酶的分泌；但本文只研究了 MdPAP10對低磷的響應，MdPAP10是否參與了其他逆境響應，是否影響到其他營養(yǎng)元素的吸收與利用仍需要進一步研究。另一方面，MdPAP10促進磷吸收的分子機制仍然不清楚；MdPHR1在蘋果中尚未被鑒定，MdPHR1是否能夠結合MdPAP10的啟動子直接調控MdPAP10的轉錄；是否影響到其他MdPAPs的表達仍需要細致而深入的研究。

4　結論

克隆獲得 MdPAP10，該基因編碼 443個氨基酸。MdPAP10包含有一個信號肽和一個磷酸酶結構域；基因結構分析表明，MdPAP10包含5個外顯子和 4個內含子。進化樹分析顯示 MdPAP10與白梨PbPAP10親緣關系最近。MdPAP10在根中表達量最高，并且對低磷條件有明顯響應。MdPAP10轉基因愈傷在低磷條件下能夠分泌更多酸性磷酸酶，促進磷吸收和磷相關基因的表達，提高對低磷的耐受性。說明 MdPAP10在響應低磷脅迫過程中發(fā)揮著重要的正調控作用。

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