沈曼曼，曲亮，竇套存，馬猛，郭軍，盧建，胡玉萍，李永峰，王克華

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇揚州 225125）

0　引言

【研究意義】提高家禽的抗病力，進行抗病育種是家禽育種工作者研究的熱點。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，已鑒定出了影響雞經(jīng)濟性狀的諸多 QTL區(qū)域，對抗病力的研究也在持續(xù)進行。脾臟是家禽重要的免疫器官，是機體對外界抗原起免疫反應(yīng)的主要場所，常用于衡量家禽免疫機能的重要指標(biāo)[1]，動物隨著年齡和機體免疫狀態(tài)脾臟大小也有很大的變化。2010年伊莎公司提出了“100周齡500個蛋”的計劃[2]，目前在下韋爾特一個農(nóng)場讓這一計劃成為現(xiàn)實，每只母雞100周齡產(chǎn)蛋數(shù)達500.5個[3]。蛋雞產(chǎn)蛋周期的延長可以降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效益，而產(chǎn)蛋后期母雞的健康狀況將是影響這一目標(biāo)實現(xiàn)的重要因素[4-5]。因此研究母雞產(chǎn)蛋后期的免疫器官分子標(biāo)記，對蛋雞產(chǎn)蛋持久性具有間接的影響作用，可為產(chǎn)蛋后期母雞的生存狀況提供重要的理論指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M展】張磊等[6]利用 60K芯片技術(shù)對北京油雞100日齡脾臟進行GWAS分析，發(fā)現(xiàn)16個SNP位點與脾臟重顯著相關(guān)，分布于8條染色體上，并將鑒定到 JAK1、ZDHHC8、VAV3、SATB1候選基因。TER?I?等[7]利用 QTL作圖對由體重雙向選擇構(gòu)建的資源群體的F3代55日齡脾臟重進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響脾臟重的區(qū)域位于5號染色體13 cM位置?！颈狙芯壳腥朦c】不同研究者對雞脾臟重的研究多采用青年雞，目前尚無對成年雞產(chǎn)蛋后期脾臟重的GWAS進行分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】基于 1 501只由東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和白來航蛋雞構(gòu)建的F2代資源群體，利用600 K SNP芯片進行基因型檢測，對72周齡母雞脾臟重進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定影響脾臟重的QTL區(qū)域，并基于基因芯片分析脾臟重的遺傳參數(shù)，以期為提高母雞雞產(chǎn)蛋后期的健康狀況提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

試驗在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院江蘇省家禽科學(xué)研究所進行，血液DNA的提取在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)進行，600 K SNP基因芯片分析在Affymetrix公司進行。F2代母雞群體飼養(yǎng)至72周時屠宰取脾臟稱重。

1.1　試驗動物

以揚州翔龍禽業(yè)發(fā)展有限公司飼養(yǎng)的東鄉(xiāng)綠殼蛋雞和單冠白來航雞為親本構(gòu)建的 F2代母雞群體為試驗素材，資源群體構(gòu)建及來源參見文獻[8]。構(gòu)建方式主要為以下方式：F0代由白來航公雞（WL）和東鄉(xiāng)綠殼蛋雞母雞（DX）進行正反交雜交產(chǎn)生F1代，F(xiàn)1代共計1 581只，其中正交（DX♂×WL♀）后代552只，反交（WL♂×DX♀）后代1 029只。以F1代為基礎(chǔ)組建49個家系，其中25個家系以父系半同胞方式組建，交配的公雞和母雞間為半同胞關(guān)系并避免全同胞，分別有12個和13個家系來自于正交群體和反交群體；另外24個家系要求與配公母無血緣關(guān)系，來自于正交群體和反交群體的家系分別為11個和13個。同批出雛F2代3 749只，其中公雞1 856只，母雞1 893只。各代均有詳細(xì)的系譜記錄，三代共統(tǒng)計有2 447個個體，其中用于本試驗統(tǒng)計的F2代群體母雞為1 501只。試驗過程中飼養(yǎng)管理條件一致，自由采食和飲水，產(chǎn)蛋期單籠飼養(yǎng)，按常規(guī)程序免疫，健康狀況良好。采翅下靜脈血ACD抗凝用于DNA提取。72周齡統(tǒng)一屠宰，取脾臟后稱重。

1.2　方法

1.2.1性狀表型值處理進行GWAS分析的數(shù)據(jù)需要符合正態(tài)分布，因此首先對脾臟重利用 SAS的univariate模塊進行Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗。

1.2.2基因組 DNA提取及質(zhì)控經(jīng)翅靜脈采集所有F2代個體血液，ACD抗凝后利用酚-氯仿法提取基因組DNA。基因組DNA利用 600 K Affymetrix Axiom Chicken Genotyping Array[9]進行基因分型。利用APT軟件（http://affymetrix.com/）對數(shù)據(jù)篩選進行下一步分析，進行分型前的質(zhì)量控制分析，采用axiom_dishqc_DQC進行質(zhì)控，保留DQC≥0.82進行后續(xù)SNP分型；刪除call rate小于97%的個體。SNP初步質(zhì)控后，然后利用PLINK1.90[10]軟件包進行數(shù)據(jù)前處理分析，剔除檢出率＜95%，次等位基因頻率＜0.01、偏離哈代溫伯格P＜10-6的SNP標(biāo)記。BEAGLE v4.0[11]進行基因型填充分析，選擇 R2＞0.5的 SNPs進入填充。最終得到1 501只個體和435 867個SNPs進行后續(xù)分析。

1.2.3全基因組關(guān)聯(lián)分析為了消除群體分層可能導(dǎo)致的假陽性出現(xiàn)，在全基因組關(guān)聯(lián)分析前，首先利用PLINK通過獨立配對法對所有SNPs進行多維度主成分分析。利用PLINK軟件計算成對SNP的r2值，高于0.2則剔除1個標(biāo)記，計算內(nèi)部成對SNP的r2值，并以5個SNPs為單位進行步移檢測，以前5個主成分作為協(xié)變量加入到全基因組關(guān)聯(lián)分析模型中。利用R腳本程序“simpleM”方法[12]計算由于各SNPs位點獨立檢驗估計，共得到59 308個indepSNPs，然后進行 bonferroni校正，計算出基因組顯著水平和潛在顯著水平閾值分別為8.43×10-7（1/59308）和1.69×10-5（0.05/59308）。

利用GEMMA軟件[13]進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。利用單變量混合線性模型對脾臟重進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，計算公式如下：

式（1）中，y代表所有個體的表型性狀的n×1向量值；W指協(xié)變量矩陣（指包括一列向量1和5個主成分的固定效應(yīng)），α為包括截距在內(nèi)對應(yīng)系數(shù)的一列向量，Wα代表群體結(jié)構(gòu)效應(yīng)；x為標(biāo)記基因型向量，β標(biāo)記位點效應(yīng)的大小，xβ代表SNP的效應(yīng)；u為個體的隨機效應(yīng)向量，u～N（0, KVg），K代表由 SNP標(biāo)記計算出的已知的 n×n遺傳關(guān)系矩陣，Vg多基因加方差；ε代表n×1隨機誤差向量，符合ε～N（0, IVe）分布，I代表n×n身份矩陣，Ve代表殘差組分。

本次研究中主要利用Wald測驗作為GWAS分析顯著統(tǒng)計指標(biāo)。

為了判斷有無假陽性的出現(xiàn)，利用 R軟件包GenABEL[14]計算基因膨脹系數(shù)λ。由于λ隨著群體樣本規(guī)模的增加而增大，因此通過樣本規(guī)模1000來計算校正的λ值。

式（2）中 Ti2代表 Wald估計值在零假設(shè)下漸近符合自由度為1的卡方分布，0.455是在零假設(shè)下假設(shè)沒有關(guān)聯(lián)的期望中位數(shù)。

式（3）中n代表總樣本量，λ代表總樣本量的估計值。

全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖和QQ圖R軟件中由“gap”和“qqman”并修改相應(yīng)參數(shù)繪制完成[15]。

1.2.4連鎖不平衡分析由于基因間的連鎖關(guān)系導(dǎo)致在一個區(qū)間內(nèi)許多SNPs在全基因組關(guān)聯(lián)分析中被檢測均具有顯著效應(yīng)。為了區(qū)分由于連鎖不平衡造成的假陽性，將候選SNP位點的基因型作為協(xié)變量，重復(fù)1.2.3中GWAS分析。經(jīng)條件分析后，原先顯著的SNP位點均不顯著時即將該位點作為候選位點篩選候選基因。

1.2.5基于SNP數(shù)據(jù)的遺傳參數(shù)計算將質(zhì)控后的SNPs數(shù)據(jù)利用PLINK處理成GCTA v1.24[16]處理格式。然后利用GCTA v1.24軟件的單性狀REML方法估計脾臟重的遺傳參數(shù)。同時計算候選SNP位點對性狀表型方差的貢獻率（CPV）以及各染色體對脾臟重解釋的表型方差。

1.2.6基因注釋將分析得到的顯著 SNP位點查找Ensembl和NCRI上Galgal4 assembly序列，按照SNP突變位點所在區(qū)間選擇候選基因，以“有義突變”、“cds區(qū)”、“外顯子區(qū)”、“UTR”、“內(nèi)含子區(qū)”、“下游上游”的原則順序選擇候選基因進行分析[17-18]。

2　結(jié)果

2.1　脾臟重表型值和遺傳力統(tǒng)計

脾臟重的型值和基于芯片計算的遺傳力見表 1。由表知脾臟重的平均值在 1.64 g，其變異系數(shù)為48.36%，說明在 72周齡老雞的脾臟重存在很大的差異。其遺傳力為0.236，為低遺傳力性狀。

表1　脾臟重表型數(shù)據(jù)和遺傳參數(shù)Table 1　Descriptive statistics and hertibilty for spleen weight in the F2population

2.2　全基因組關(guān)聯(lián)分析

對脾臟重進行全基因組關(guān)聯(lián)分析后發(fā)現(xiàn)達到基因組顯著水平的SNP位點共412個，見表2和圖1。分別有383個和29個位于1號和28號染色體上，同時這兩條染色體上分別有242個和34個潛在性顯著水平。在4號和16號染色體上分別有3個和2個潛在性SNP位點。λ是判斷群體是否存在分層的參數(shù)，一般在1.05以上說明群體存在分層，不適宜進行全基因組關(guān)聯(lián)分析。由本研究圖1-B的QQ圖知，群體的λ值為1.042，說明所有個體均勻分布，不存在群體分層現(xiàn)象。

圖1　脾臟重全基因組關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖和QQ圖Fig. 1　Manhattan plot and QQ-plot of genome-wide association

表2　與脾臟重顯著和潛在顯著關(guān)聯(lián)SNP位點信息Table 2　Number and distribution of significant and suggestive SNPs association with spleen weight

染色體1號和28號上鑒定出的較多SNP位點可能是由于連鎖不平衡造成，而通常有義突變更容易造成較大的表型改變，因此首先以SNP位點在CDS區(qū)間作為候選基因，通過查找 glagal4參考基因組序列后，顯著和潛在顯著的 SNPs沒有位于編碼區(qū)序列。而UTR區(qū)域的突變可以改變順式調(diào)控元件，從而影響mRNA翻譯和轉(zhuǎn)錄效率的穩(wěn)定性[19]，本研究因此選擇了1號和28號染色體上位于UTR-3區(qū)域的SNPs作為候選位點在1號染色體上發(fā)現(xiàn)有4個SNPs位點位于UTR-3區(qū)（表3），分別位于基因CCDC122、KCTD4、SLC25A30和SUCLA2區(qū)間內(nèi)。28號染色體為1個SNP位點位于PCASP2基因的UTR-3區(qū)，因此選擇這5個SNP位點作為候選位點進行初步分析。同時將4號和28號的潛在顯著性SNPs參照參考基因組，篩選距離最近的基因作為候選基因。

對1號和28號的5個SNP位點以及4號和16號的潛在顯著性位點進行位點CPV計算，結(jié)果見表3，由表知以1號染色體上顯著位點解釋的CPV均最大，最高的是位點rs314001986，解釋了5.91%的表型方差，因此將rs314001986作為1號染色體的候選位點進行條件分析。同時對28號染色體上位點rs312729296進行條件分析。以判斷在各位點之間的顯著性是否由連鎖不平衡造成，對1號和28號染色體以rs314001986和rs312729296候選位點進行條件分析后結(jié)果顯示原先顯著的位點均不顯著（圖2）。對4號和16號染色上潛在的顯著位點進行連鎖不平衡分析結(jié)果見圖3，由圖知4號和16號上潛在性顯著位點均存在著較強的連鎖不平衡狀態(tài)。

綜合上述分析，最終以rs314001986、rs312729296、rs315270535和 rs314065899作為候選 SNPs進行基因注釋分析。根據(jù)參考基因組glagla4可知，這4個位點分別位于基因KCTD4（potassium channel tetramerisation domain containing 4，鉀離子聚合結(jié)構(gòu)域）、PCASP2（mucosa associated lymphoid tissue lymphoma translocation gene 1-like，黏膜相關(guān)性淋巴樣組織）UTR-3區(qū)域內(nèi)、以能LDB2（LIM domain binding 2，LIM 結(jié)構(gòu)域結(jié)合基因）和 HEP21（hen egg protein 21，卵清組成蛋白）內(nèi)含子區(qū)域內(nèi)。

表3　脾臟重顯著和潛在性SNP位點信息Table 3　Information of significant and suggestive mutations association with spleen weight

圖2　1號和28號染色體顯著位點條件分析Fig. 2　Regional plot for conditional analysis about significant loci on GGA1 and GGA28

圖3　4號和16號染色體上潛在性顯著位點LD分析Fig. 3　LD analysis about suggestive loci on GGA4 and GGA16

分別對 1號和 28號染色上候選 SNPs位點rs314001986和 rs312729296在各個體上的基因型對應(yīng)的表型分析見圖4。由圖4可知兩個SNP的純合子基因型 G/G對脾臟重均具有增重效應(yīng)。rs314001986位點 3種基因型對應(yīng)的表型之間存在極顯著差異，rs312729296三種基因型為兩個純合子存在極顯著差異。

2.3　染色體遺傳力

利用GCTA軟件對染色體的遺傳力和染色體長度進行分析結(jié)果見圖 5。每條染色體的遺傳力和其長度的相關(guān)系數(shù)為 R2=0.386，為中等極顯著相關(guān)（P=1.50×10-4），1號染色體的遺傳力最大為9.25%，其次為28號染色體為4.55%（圖5-A）。將用于條件分析的位點SNPs作為協(xié)變量后重新計算染色體遺傳力，1號染色體的遺傳力變?yōu)?4.03%，28號染色體變?yōu)?.05%（圖5-B），而其他染色體的遺傳力均幾乎未變。

圖4　rs314001986和 rs312729296在各個體上基因型與表型關(guān)聯(lián)分析Fig. 4　Relationship between genotype and phenotype on rs314001986 and rs312729296

3　討論

前人利用關(guān)聯(lián)分析或 QTL定位對脾臟重進行研究，多以青年雞為研究對象[6,20]。隨著“100周齡500個蛋”的計劃實現(xiàn)，研究母雞產(chǎn)蛋后期的健康狀況尤為重要。本研究首次利用600 K高密度基因芯片對母雞產(chǎn)蛋后期的脾臟重進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，研究發(fā)現(xiàn)4個QTL區(qū)域與脾臟重顯著或潛在性關(guān)聯(lián)。其中有412個顯著性SNP位點和281個潛在性SNP位點，在1號、28號、4號和16號染色體上均有分布，其中以1號染色體上分布最多，且 1號染色體的遺傳力為9.23%。PARK等[20]研究對 70日齡雞脾臟重的 QTL定位發(fā)現(xiàn)，10號和11號染色體對脾臟重解釋遺傳力在分別為3.9%和2.8%，均較本研究中4、16和28號染色體上區(qū)域要高，而低于本研究中1號染色體的顯著區(qū)域的遺傳力（圖5-B）。1號染色體上與脾臟重顯著關(guān)聯(lián)的區(qū)域在165—173 Mb區(qū)間，在本研究群體發(fā)現(xiàn)也是影響蛋重、卵巢重和飼料消耗[8,21-22]的重要區(qū)域，而在其他研究也發(fā)現(xiàn)與體重具有重要關(guān)系[23-24]，說明1號染色體170 Mb左右的區(qū)間是影響雞生長的重要QTL區(qū)域。張磊等[6]研究發(fā)現(xiàn)影響100日齡脾臟重的顯著性 SNP位點分布于 1、2、3、4、13、18、19和25號染色體上。本研究中所定位到的關(guān)聯(lián)區(qū)域與上述不同，代表了新的影響脾臟重的QTL區(qū)域或位點，然不同品系間以及不同時期可能會表現(xiàn)出不同的病原免疫應(yīng)答反應(yīng)[25]，本研究中所得到的QTL區(qū)域需要進一步進行功能驗證篩選。

本研究中，1號染色體中共有383個SNPs位點達到基因組顯著水平，對顯著水平最高的 SNP位點rs314001986進行條件分析后原顯著的位點均不顯著，以rs314001986作為候選位點，該位點位于KCTD基因 UTR-3區(qū)域。KCTD蛋白參與離子運輸過程[26]，KCTD家族中含有26個成員，均具有保守的N端結(jié)構(gòu)和鉀通道四聚化結(jié)構(gòu)域，參與了Wnt/beta-catenin、FGF、PPAR等信號通路，在許多生物過程和疾病中發(fā)揮作用，KCTD4在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤中上表達[27]。對雞的生物學(xué)作用以及參與的免疫調(diào)控尚不清楚，根據(jù)上述170 Mb區(qū)間可能是影響雞各性狀“重量”的區(qū)域，KCTD4有可能是促進脾臟增殖等作用，其作用機理有待于進一步研究。

張磊等[6]發(fā)現(xiàn)影響脾臟重的4號染色體SNP位點在62.8 Mb區(qū)間，本研究得到的76 Mb區(qū)間與其研究不同，本研究對張磊研究中得到的 SNP位點（rs14479254）與本研究中位點rs315270535進行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)兩個位點之間不存在連鎖不平衡（D’=0.5, R2=0.05），可能在4號染色上存在兩個區(qū)域影響脾臟重。本研究中位點rs315270535位于LDB2基因的UTR-3區(qū)域，LDB2 基因能夠與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在腦的發(fā)育和血管形成過程中發(fā)揮重要作用，與人的動脈瘤疾病相關(guān)。吳丹[28]對北就油雞的全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn) LDB2基因下游 108 kb的一個SNP位點與 100日齡體重潛在關(guān)聯(lián)，GU等[29]也發(fā)現(xiàn)LDB2與雞7—12周體重顯著關(guān)聯(lián)并與6—12周平均日增重相關(guān)。在發(fā)生細(xì)胞免疫和體液免疫時，脾臟組織通過脾細(xì)胞增殖功能使淋巴小結(jié)增生或脾索內(nèi)漿細(xì)胞及巨噬細(xì)胞顯著增加進行免疫應(yīng)答，綜上，1號和 4號染色體上發(fā)現(xiàn)的顯著和潛在性顯著SNPs以及相關(guān)候選基因可能均參與了免疫應(yīng)答過程中的脾臟增殖作用。

本研究在16號和28號染色體得到的潛在和顯著性QTL區(qū)域為首次發(fā)現(xiàn)。而其中與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)的大部分主要組織相容性復(fù)合體（MHC）基因位于16號染色體上（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene），可能16號的潛在顯著區(qū)間參與了MHC在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控上發(fā)揮作用，以進一步增強免疫功能。其潛在性SNP位點rs314065899位于HEP21（hen egg protein 21）內(nèi)含子區(qū)間，HEP21卵清組成蛋白[30]，隨著輸卵管發(fā)育成熟而上調(diào)，HEP21同時參與胚胎孵化過程中的一些免疫反應(yīng)[31]，由此推測HEP21可能參與到脾臟的免疫應(yīng)答過程。

28號染色上影響脾臟重的區(qū)域位于 0.47—1.27 Mb區(qū)間內(nèi)，篩選到的 SNP位點 rs312729296位于PCASP2基因UTR-3區(qū)域，PCASP2是MALT家族之一，MALT1（黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤轉(zhuǎn)運蛋白1）基因在人上參與了先天免疫以及炎癥反應(yīng)，參與了NF-кB的激活過程。這個家族常見的有基因PCASP1、PCASP2和 PCASP3，PCASP2在人類基因上已經(jīng)消失，然在雞基因組上仍起作用[32]。本研究推測在雞上PCASP2可能發(fā)揮了與哺乳動物上MALT1一致的作用，具有參與炎癥反應(yīng)的功能。

4　結(jié)論

本研究利用高密度基因芯片，對蛋雞72周齡脾臟重進行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)了412和281個SNPs位點與脾臟重顯著和潛在顯著關(guān)聯(lián)，分別位于1、28、4和 16號染色體上，篩選到 KCTD4、LDB2、HEP21和PCASP2候選基因。并利用生物信息學(xué)分析方法得到1號染色體解釋的遺傳力為9.25%，脾臟重的遺傳力為0.236。

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