解修超， 賈少杰， 彭 浩， 鄧百萬*

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院， 陜西 漢中 723000；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心， 陜西 漢中 723000)

靈芝(Ganodermalucidum)又名紅芝、木靈芝，隸屬于多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(Ganoderma Karst)，作為珍貴的中藥材在我國已有2000多年的歷史。靈芝具有養(yǎng)心安神、止咳平喘、延年益壽的功效，對食欲不振、心悸、神疲乏力、高血壓等疑難雜癥均有顯著療效，是常用的滋補強壯、扶正固本的中藥[1]。

目前，從靈芝子實體、菌絲體、孢子中分離多糖已達200余種?，F代研究證實，靈芝多糖有抗氧化、調節(jié)免疫力、抗腫瘤和降血糖等藥理作用[2-4]。野外采集和人工栽培是獲得靈芝的傳統(tǒng)途徑。野生靈芝極少，采集代價高昂；而人工栽培易受外界環(huán)境影響，導致靈芝品質參差不齊，且對自然環(huán)境和資源消耗巨大。近年來，液體發(fā)酵技術以其周期短、易操作、成本低等優(yōu)點在植物、食品加工、大型食藥用菌等領域廣泛應用。液體發(fā)酵技術與發(fā)酵動力學相結合被認為是提高靈芝多糖的主要途徑。

本文結合國內外對靈芝多糖的液體發(fā)酵調控及其藥理作用的研究進展進行綜述，旨在為靈芝多糖的合理開發(fā)和綜合利用奠定基礎。

1 靈芝多糖液體發(fā)酵調控

相比較液體發(fā)酵技術，靈芝傳統(tǒng)椴木栽培和袋料栽培成本較高，對自然資源消耗和破壞極大。雖然有學者對椴木栽培和袋料栽培方式進行了改進和創(chuàng)新，但效果甚微。近年來，液體發(fā)酵技術以其易操作、周期短、成本低、產量大等優(yōu)點迅速成為研究熱點。采用液體深層發(fā)酵技術培養(yǎng)靈芝，可在短時間內制備大量優(yōu)質菌種，可大大降低成本，有利于工業(yè)化生產，克服了靈芝栽培和野生靈芝采收的局限性。目前，對液體發(fā)酵技術研究集中在培養(yǎng)基和條件的優(yōu)化、外源物質對代謝產物的影響和發(fā)酵動力學等方面。

1.1 靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

培養(yǎng)基的優(yōu)化是靈芝產業(yè)化生產的第一步，合適的液體發(fā)酵培養(yǎng)基可以使菌絲生物量成倍增長。培養(yǎng)基的優(yōu)化包括對其組分的篩選和含量的研究，不同的碳氮源對菌絲生物量和多糖含量有影響。

1.1.1 碳源優(yōu)化

碳源是機體生長所必須的元素之一，按照能否水解將其分為單糖、雙糖和多糖。靈芝液體培養(yǎng)基中一般使用的碳源有葡糖糖、蔗糖、玉米粉、可溶性淀粉等，研究發(fā)現，不同的碳源對靈芝菌絲體的生長速度、形態(tài)及胞內多糖含量有很大影響。楊靜靜等[5]以添加不同質量分數的玉米粉作為碳源，研究其對靈芝液體發(fā)酵菌絲體和多糖的影響，結果表明玉米粉的質量分數在4%之內時，質量分數越大菌絲球的直徑越小，有利于多糖的積累，同時不同質量分數的玉米粉對靈芝多糖的分子量大小無明顯影響。于海洋等[6]研究了不同碳源對靈芝液體發(fā)酵菌絲生物量和胞外多糖的影響，以可溶性淀粉為唯一碳源時，生物量達到2.805 g/L，多糖達到0.909 g/L，菌絲對可溶性淀粉的利用率最高，蔗糖最低。此外，混合碳源以及碳源的質量分數對菌絲體和多糖合成也具有促進作用，不同比例的混合碳源可增加菌絲生物量。

1.1.2 氮源優(yōu)化

真菌的生長離不開氮源，有機氮源在提供給真菌合成蛋白質等生命物質的同時還能提供一些微量元素，對多糖等代謝產物的合成也有促進作用。常見的有機氮源有豆餅粉、蛋白胨、酵母等，與無機氮源相比，真菌對有機氮源的吸收利用更高。馮杰等[7]在使用葡萄糖作為唯一碳源的情況下，研究了不同氮源對靈芝菌絲生物量的影響，使用添加量為3 g/L的酵母自溶粉為氮源時，菌絲生物量最高；以魚粉蛋白胨為氮源時，生物量次之，但容易導致培養(yǎng)基細菌污染。此外，不同的氮源會使多糖的分子量有一定差異。碳源與氮源的不同比例(碳氮比)也會對靈芝液體發(fā)酵代謝產物產生影響，m(碳源)∶m(氮源)=(20～25)∶1是比較適宜的碳氮比。

1.1.3 無機鹽

靈芝菌絲體的生長離不開鎂、鉀等無機鹽離子。靈芝可以將對人體有益的無機態(tài)硒、鋅元素富集和轉化為人體更易吸收的有機態(tài)。不同的無機鹽在靈芝菌絲體生長過程中作用不同。鎂離子的缺少會導致靈芝代謝分子量較大的多糖，胞外多糖的產量與磷酸鹽有關[8]。

1.2 液體發(fā)酵條件的研究

對液體發(fā)酵條件的研究主要集中在pH、時間、接種量、轉速、溶氧量等方面。不同的食用菌最適pH不同，靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基的pH一般在5～6.5之間。溫度對機體酶促反應有極大影響，因此，溫度對靈芝菌絲體生長和代謝物的積累至關重要，靈芝生長溫度在27～30 ℃之間。Fang Q H[9]等探究了不同pH條件下對靈芝液體發(fā)酵代謝物產量的影響，結果表明，pH在3.5～7.0之間時，對菌絲生物量和代謝產物均有顯著影響。靈芝液體發(fā)酵代謝產物隨著發(fā)酵時間的增加先增加后減少，時間越長越不利于代謝物的積累。Chen Y L[10]等研究了發(fā)酵時間對靈芝液體發(fā)酵的影響，在不同的發(fā)酵時間段內，靈芝代謝產物會先增加后減少。此外，接種量也可以影響代謝產物的積累，采用保濕法可以明確靈芝發(fā)酵的最適接種量。接菌量過多不利于有機物的積累且增加耗氧量，接菌量過少會影響菌絲體的生長速率，使其速度過慢，發(fā)酵周期增長。

1.3 外源物質對液體發(fā)酵的影響

外源物質是指非機體內產生的有機物或無機物，包括金屬離子、中藥材提取物、生長因子、誘導劑等。研究表明，外源物質可增強機體的抗性，提高機體內有效成分的含量。近年來，外源物質不僅在植物萌發(fā)、代謝、抗逆性、生產等方面應用廣泛，而且在大型真菌液體發(fā)酵中對代謝產物的影響方面起著重要作用。

1.3.1 金屬離子在靈芝液體發(fā)酵中的應用

金屬離子是靈芝菌絲體生長過程中不可或缺的物質，在液體發(fā)酵中發(fā)揮著重要作用。某些低質量濃度的金屬離子可促進菌絲體生長，但質量濃度過高則會抑制其生長。不同的金屬離子對其代謝產物影響不同，某些金屬離子可阻礙靈芝代謝產物的產生。王詩然等[11]以產漆酶靈芝菌株為試驗材料，通過低能N+束注入技術得到突變高產菌株，對其產生的漆酶性質進行了分析，金屬離子Fe2+對漆酶活性的表達具有極強的阻礙作用，而Co2+和Cu2+對酶有明顯的激活作用，Zn2+和Na+則對酶活性的影響不大。Ye S Q等[12]在靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同種類的金屬離子，研究了其對代謝產物的影響，K+、Mg2+、Fe2+均可使靈芝菌絲體的生物量增加，當Fe2+的添加量為0.2%時，可提高靈芝多糖的含量。此外，稀土金屬元素也可以影響靈芝發(fā)酵產物。Yao Q等[13]探討了5種稀土元素La3+、Ce3+、Nd3+、Pr3+、Er3+對靈芝液體發(fā)酵中多糖產量的影響。添加一定質量濃度的稀土元素可明顯提高靈芝液體發(fā)酵過程中多糖的代謝量。

1.3.2 中草藥提取物在靈芝液體發(fā)酵中的應用

中草藥提取物可提高液體發(fā)酵中代謝產物的積累。趙小瑞等[14]在靈芝發(fā)酵液中添加了4種中藥材，研究了其對代謝產物的影響，4種中藥材均對菌絲生長和代謝產物的積累有顯著促進作用。雙向發(fā)酵技術近年來也被運用于靈芝發(fā)酵中，辛燕花等[15]使用了銀杏靈芝雙向發(fā)酵技術探究了其對靈芝多糖的影響，雙向發(fā)酵可以增加靈芝多糖的積累，并顯著增強其抗氧化的能力。不同種類的中草藥對發(fā)酵代謝產物影響不同。

1.3.3 誘導因子在靈芝液體發(fā)酵中的應用

液體發(fā)酵中除了一些必須的營養(yǎng)元素外，添加誘導因子如脂肪酸、水楊酸、木質素等可對代謝產物有顯著影響。研究發(fā)現，脂肪酸可以促使某些真菌在液體發(fā)酵過程中產生并積累代謝產物。裴海生等[16]研究發(fā)現，在靈芝菌絲體生長過程中添加適量的木質素，可以顯著提高生長速度，同時使多糖的含量增加。葉麗云等[17]以靈芝J-7和AL-2菌株為研究對象，在液體發(fā)酵中加入10 mmol/L鈣離子誘導，多糖含量比對照提高34%。在發(fā)酵液中加入150 μmol/L水楊酸誘導，多糖含量提高57.54%。

1.4 靈芝發(fā)酵動力學研究

發(fā)酵動力學主要是研究液體發(fā)酵不同影響因子對代謝產物的影響作用。構建恰當的動力模型，可明顯增加靈芝多糖的含量。一般情況下，將發(fā)酵動力模型分為細胞生長模型、產物合成模型和底物消耗模型三種。目前，已有模型被用于細胞生長動力學的描述，Logistic和Monod是現階段最為常用的動力學方程。Monod方程一般不考慮由于菌絲體質量濃度增加而阻礙菌絲體生長的理論化簡單模型。王國瑞等[18]以生物量和胞內多糖為主要指標對72株靈芝菌株的液體發(fā)酵進行了研究，并對其中3株高產菌株構建了發(fā)酵動力學模型。Lian R L等[19]采用DPS軟件觀察搖瓶和罐內分批發(fā)酵過程中靈芝的動力學特征。結果表明，構建的菌絲生長動力學模型與Logistic方程基本一致。采用發(fā)酵動力學結合液體發(fā)酵技術提取代謝產物制備前體物質。Bilal M等[20]在構建動力學模型后，從靈芝IBL-05中分離出錳過氧化物酶(Manganese peroxidase MnP)，通過硫酸銨沉淀和透析將粗MnP提取物純化。使用戊二醛作為交聯(lián)劑，將酶制劑包封在明膠基質上。最佳條件為：明膠20%(W/V)，戊二醛0.25%(V/V)，活化時間2 h，蛋白質量濃度0.6 mg/mL。明膠包封的MnP在pH 6.0、溫度60 ℃呈現最大活性。Feng J等[21]對藥用真菌靈芝液體深層發(fā)酵的胞外多糖動力學進行研究。在Logistic和Luedeking-Piret方程基礎上，開發(fā)了動力學模型，通過Runge-Kutta遺傳算法對模型的參數進行優(yōu)化，所得的模型對靈芝液體深層發(fā)酵在工業(yè)生產中的應用是非常有用的。

2 靈芝多糖藥理研究進展

目前，從靈芝中分離得到的靈芝多糖約有200種，一般多糖的分子量越大其藥理活性越高，但也有研究發(fā)現，某些小分子量的多糖具有極強的藥理作用。

2.1 抗氧化作用

靈芝多糖具有抗氧化的作用，其抗氧化能力強弱與多糖分子量的大小和質量濃度存在密切關系。張志軍等[22]采用鐵氰化鉀還原法測定靈芝多糖的抗氧化能力，靈芝多糖具有抗氧化的作用和清除自由基的能力。Kan等[3]研究發(fā)現，在不同分子量的GLP80、GLP60、GLP40和GLP靈芝多糖中，GLP80抗氧化性最好。這表明靈芝多糖的分子量大小直接影響了其抗氧化能力的強弱。Utami W等[23]研究了靈芝乙醇提取物的還原能力，同時探究了對脂質過氧化的抑制作用。靈芝醇提物有抗氧化能力和抑制脂質過氧化作用，且均與質量濃度有關。乙酸乙酯分離物的還原能力與維生素E相當。同時，各分離物和維生素E對脂質過氧化的抑制作用沒有顯著差異。

2.2 免疫調節(jié)功能

靈芝多糖可以通過調節(jié)白細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞等免疫細胞的應激反應，對機體的免疫功能產生影響。Huang S Q等[24]通過給小鼠添加不同劑量的紫芝多糖來研究其對巨噬細胞信號轉導的影響，在100 mg/(kg·d)時，可提高自然殺傷細胞活性。李文娟等[25]給小白鼠注射不同劑量的黑靈芝多糖，通過測定小白鼠T、B淋巴細胞和血清中IL-2與TNF-α含量等指標，分析對小白鼠免疫力強弱的影響。黑靈芝多糖可提高小白鼠免疫器官指數和T、B淋巴細胞數量，有效增強免疫功能。Carrieri R等[26]研究結果表明，靈芝提取的水溶性異聚糖具有改善免疫調節(jié)能力，異聚糖可以在炎癥狀中發(fā)揮保護作用，并對免疫反應受到抑制的人有益。

2.3 抗腫瘤作用

靈芝多糖分為α型和β型兩種，前者一般不具有藥理活性，而后者具有明顯的藥理活性。目前，靈芝多糖抗腫瘤的機理有阻礙腫瘤細胞分裂，促使其凋亡和增強機體免疫力兩種途徑。靈芝多糖可通過阻礙機體血管生長和降低細胞黏附度達到抗腫瘤作用。靈芝多糖可有效提高機體體液免疫和細胞免疫功能，阻礙腫瘤細胞的轉移，減小其與正常細胞的黏附能力，進而使其凋亡。張曉春等[27]應用雞胚尿囊膜(GAM)血管生成模型觀察靈芝多糖對血管生成的作用。結果表明，靈芝多糖的添加量在0.2～5 μg之間時，可明顯抑制GAM的血管生長，當質量濃度在0.33～33 g/L之間時，則呈現出正相關關系。最新研究表明，靈芝多糖(GLP)通過激活幾種類型的突變型p53而表現出顯著的抗癌活性。因此，GLP與其他化療藥物共同作用于突變型p53被認為是治療癌癥的新方法[28]。

2.4 其他作用

靈芝多糖在降血糖、抑菌等方面具有良好作用。靈芝多糖具有降低由鏈脲佐菌素(STZ)引起的糖尿病小鼠中血糖的作用。Li F等[29]將糖尿病小白鼠隨機分為4組，測量小鼠的體重、空腹血糖(FBG)、血清胰島素和血脂水平。注射GLP治療組的體重和血清胰島素水平顯著高于對照組，而FBG水平則有效降低。此外，靈芝多糖可有效降低膽固醇水平。GLP處理組的甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平下降。GLP對于治療與動脈硬化或高脂血癥有關的糖尿病癥將是一個很大的優(yōu)勢。Eo S K等[30]通過乙醇沉淀法和DEAE纖維素色譜柱從靈芝水溶性物質中分離出中性蛋白結合多糖(NPBP)和酸性蛋白結合多糖(APBP)兩種蛋白質結合多糖。APBP表現出比NPBP更強的抗病毒活性，APBP的抗病毒活性與特異性糖蛋白的結合有關，并且APBP可阻礙病毒與細胞質膜的交互作用。此外，研究表明，靈芝多糖在降血脂、護肝等方面具有一定作用。

3 問題與展望

我國靈芝種質資源豐富，是靈芝資源合理開發(fā)和利用的基礎，但靈芝資源開發(fā)不夠深入，系統(tǒng)研究和實現商品化栽培的靈芝只有少數幾種；靈芝多糖具有良好藥理作用和巨大市場需求，有效成分應用研究一直是國內外熱點。靈芝子實體生長緩慢，周期長，阻礙了其工業(yè)化生產的推廣和應用。液體發(fā)酵是制備液體種的主要手段，更有利于多糖的提?。患尤虢饘匐x子、中草藥提取物及其他誘導因子等外源物質后，靈芝液體發(fā)酵的代謝物的產量得到提高，發(fā)展?jié)摿薮蟆５渲幸恍┩庠次镔|不適宜大規(guī)模工業(yè)化使用，且對技術要求較高。

目前，雖然已經有200余種多糖被分離，但對其結構、活性機理研究尚不明確，靈芝多糖成分分析還有待進一步加強。靈芝多糖分離研究不夠系統(tǒng)，傳統(tǒng)方式能耗高、效率低且提取過程中大量使用有機溶劑，影響多糖的產量和品質?，F階段我國靈芝種繁雜，栽培種問題更為突出，其多糖的活性均有差異，給多糖的活性研究帶來一定阻力。這些問題都嚴重影響了靈芝多糖的開發(fā)和利用。因此，在靈芝多糖液體發(fā)酵、代謝途徑、結構及抗性機理等方面的系統(tǒng)研究將為靈芝多糖的在醫(yī)藥領域的應用奠定基礎。