趙　露，楊雪梅，李　俊，劉　霞，許永華

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118)

白屈菜(ChelidoniummajusL.)是罌粟科白屈菜屬多年生草本植物，全草入藥，富含多種生物堿，有止咳、抗炎、止痛等多方面藥理作用，[1-6]是止咳、胃腸消炎及止痛類中藥制劑的重要原料[7].在對白屈菜馴化栽培的研究中發(fā)現(xiàn)，白屈菜對生態(tài)環(huán)境有比較廣泛的適應(yīng)性，對土壤酸堿性、強光和蔭蔽環(huán)境、干旱及溫度變化的適應(yīng)性較強，特別是抗寒凍性極強，在冬季氣溫-50℃以下的地區(qū)(如內(nèi)蒙古根河市)，其蓮座狀叢生葉及當(dāng)年種子萌發(fā)的幼苗可以自然越冬，并在翌年初春冰雪尚未完全融化時，葉片由水漬狀回復(fù)成正常狀態(tài)開始生長，是冬性植物.白屈菜極強的耐寒凍特性機理目前在國內(nèi)外尚未見報道.

植物抗寒性研究表明，環(huán)境因素和物種生物學(xué)特性是影響植物抗寒凍性的關(guān)鍵因素，環(huán)境因素主要是溫度、光周期、水分狀況[8]；物種生物學(xué)特性主要由植物遺傳背景、發(fā)育和生長時期以及植物對低溫脅迫的保護機制所決定[9].植物在適應(yīng)寒凍脅迫過程中，啟動抗寒凍機制以減少低溫造成的損傷，出現(xiàn)一些顯著的生理生化變化：保護性物質(zhì)增多，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透性并降低冰點溫度[10-15]；含水量下降，呼吸代謝減弱[16]；激素調(diào)控系統(tǒng)發(fā)生變化，如內(nèi)源激素中IAA、GA濃度下降，ABA濃度升高，以抑制生長促進休眠[17]；細(xì)胞質(zhì)膜氧化性發(fā)生變化等[17-19].目前，對植物感知低溫信號的研究表明，組蛋白H2A.Z可能參與擬南芥的溫度感知；三磷酸肌醇(IP3)介導(dǎo)的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能在低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起決定作用；磷脂酶D、脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶以及肌醇多磷酸磷酸酶基因FRY1等與低溫信號感知有關(guān).[17]對低溫脅迫應(yīng)答的分子機制研究表明，C-復(fù)制-結(jié)合因子/脫水反應(yīng)元素結(jié)合因子(CBF/DREB1，C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding factor1)調(diào)控途徑具有保守性，在多種雙子葉和單子葉植物中均發(fā)現(xiàn)了該關(guān)鍵基因參與的調(diào)控，[17]揭示在單子葉植物中存在類似于擬南芥的CBF/DREB1 調(diào)控機制[20].此外，植物中還存在其他的低溫信號傳遞通路[17].

迄今，有關(guān)白屈菜抗寒凍性的研究未見報道，其應(yīng)答低溫脅迫的生理生化反應(yīng)以及低溫應(yīng)答分子機制尚不清楚，因此，本文對此開展了相關(guān)研究，以探究其超強抗凍性的生理基礎(chǔ)和分子機制.

1　材料與方法

1.1　實驗材料

1.1.1采樣

野生白屈菜采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)野生白屈菜1號觀測樣地，樣地的地理位置為北緯43°48′33″、東經(jīng)125°24′21″，海拔230 m；夏季林間郁閉度在85%左右，木本植物有銀中楊、紅皮云杉，草本植物有紫花地丁、早開堇菜.8月初白屈菜莖枯萎、根盤萌發(fā)新的基生葉，待基生葉長到8 cm左右開始采樣，持續(xù)到12月末氣溫降至-20℃以下.夏秋季采樣溫度范圍10℃～28℃，林下日照時間8～12 h，采樣時間為當(dāng)日14：00，即日間溫度最高時段.秋冬季采樣溫度范圍-25℃～10℃，林下日照時間0～8 h(積雪覆蓋后越冬苗日照時間為0 h)，以每日最低溫連續(xù)3 d達(dá)到采樣低溫時開始采樣，采樣低溫設(shè)定為5℃，0℃，-5℃，-10℃，-15℃，-20℃，采樣時間為當(dāng)日8：00.分別從3株植株采集葉片.

1.1.2控制降溫條件下的實驗材料

控制條件下生長的白屈菜，是將上述1號觀測樣地的白屈菜苗及根際周圍土壤一起移植到營養(yǎng)缽中，放入人工氣候箱，25℃、16 h光照8 h黑暗適應(yīng)培養(yǎng)1周后，將培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為25℃，20℃，15℃，10℃，5℃，0℃，每一溫度點維持3 d，在各溫度點采樣.-5℃，-10℃處理在冰箱中進行，全黑暗，每個溫度點維持3 d.采樣時分別從3株植株取葉片.

1.1.3轉(zhuǎn)錄組測序及基因驗證材料

材料來源及采樣方法同1.1.1，采樣溫度為0℃，-10℃，-20℃，分別命名為A、B、C三組，每組分別從3株野生白屈菜植株上取葉片.基因驗證用測序的3份平行材料.

1.2　實驗方法

1.2.1主要生理指標(biāo)測定

細(xì)胞膜滲透性——相對電導(dǎo)法；游離脯氨酸——酸性茚三酮比色法；丙二醛——硫代巴比妥酸法(TCA法)；可溶性糖——蒽酮乙酸乙酯比色法；可溶性蛋白——考馬斯亮藍(lán)法；葉綠素含量——比色法.每份樣品取白屈菜葉片0.3 g，3次重復(fù).采用IBM SPSS Statistics22軟件對生理實驗數(shù)據(jù)進行差異性分析.

1.2.2轉(zhuǎn)錄組測序

委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進行測序及數(shù)據(jù)庫比對.測序平臺：IlluminaHiSeqTM 2500測序儀，文庫質(zhì)檢：Agilent 2100分析儀；每樣本數(shù)據(jù)量為6 G，數(shù)據(jù)解析包括非冗余數(shù)據(jù)庫(NR，non-redundant)、真核生物同源蛋白數(shù)據(jù)庫(KOG)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(SWISSPROT)、基因數(shù)據(jù)庫(GO，gene ontology)、基因與基因數(shù)據(jù)庫(KEGG，Kyoto encyclopedia of genes and genomes)等5個數(shù)據(jù)庫比對及差異表達(dá)基因篩選.

1.2.3基因表達(dá)驗證

采用實時定量PCR法進行基因表達(dá)驗證.RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑采用Vazyme公司生產(chǎn)的試劑盒(產(chǎn)品代碼R223-01)，熒光定量PCR試劑采用Qiagen公司生產(chǎn)的定量PCR試劑盒(QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit)；儀器：LightCycler? 480 ⅡPCR儀(Roche).

2　結(jié)果與分析

2.1　野生白屈菜低溫應(yīng)答過程中主要生理指標(biāo)變化趨勢

植物感受低溫刺激啟動生理應(yīng)答，細(xì)胞內(nèi)抗寒凍性物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖(蔗糖、葡萄糖)、可溶性蛋白含量增加，細(xì)胞滲透性改變、葉綠素含量降低[21].測定秋冬季野生白屈菜應(yīng)答低溫的主要生理指標(biāo)、各化合物含量以及電導(dǎo)率的變化可反映在降溫過程中白屈菜的生理狀況.

野生白屈菜在降溫過程中，與低溫應(yīng)答相關(guān)的主要生理指標(biāo)的變化趨勢見圖1.其中，細(xì)胞內(nèi)抗寒凍性物質(zhì)，如脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等，在5℃～0℃寒害發(fā)生時含量開始升高；在0℃～-5℃時，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量急劇升高，-5℃時幾乎達(dá)到最大值.與此同時，由于脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量增加，細(xì)胞內(nèi)自由水含量降低，細(xì)胞的相對電導(dǎo)率顯著降低，在-5℃時達(dá)到最低值，即細(xì)胞滲透性最低，表明細(xì)胞已經(jīng)完成低溫馴化，獲得了抗凍性.在-5℃～-20℃時，植物代謝水平降低，脯氨酸和可溶性糖含量降低，細(xì)胞內(nèi)溶液濃度降低，相對電導(dǎo)率呈上升趨勢，細(xì)胞滲透性增大，提示可能由于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙冰晶形成造成膜損傷，導(dǎo)致電導(dǎo)率升高.在-5℃～-20℃時，細(xì)胞中可溶性蛋白含量升高，達(dá)到12 mg/g，推測可能是0℃以下低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗凍蛋白.

丙二醛是逆境脅迫時植物細(xì)胞膜脂被活性氧氧化的產(chǎn)物，其含量高低反映細(xì)胞膜脂過氧化以及細(xì)胞膜損傷的程度.丙二醛能引起細(xì)胞膜功能紊亂，破壞細(xì)胞中酶、蛋白質(zhì)以及核酸等分子結(jié)構(gòu).白屈菜在25℃～0℃的降溫過程中，丙二醛含量顯著提高，25℃時丙二醛含量是0.002 μmol/g，而0℃時是0.020 μmol/g，是前者的10倍.在-5℃和-15℃時，丙二醛含量分別是0.020 0和0.017 9 μmol/g，表明白屈菜低溫應(yīng)答過程中細(xì)胞膜氧化程度顯著提高.而-20℃時，丙二醛含量顯著下降，推測可能與抗凍蛋白增加有關(guān).

葉綠素含量降低是植物應(yīng)答低溫的普遍規(guī)律.白屈菜在25℃～-20℃的降溫過程中，葉綠素含量呈下降趨勢，反映出光合色素分解、光合作用減弱直至停止的生理狀態(tài).

以正常生長溫度25℃樣本組為對照，對各溫度組野生白屈菜的生理指標(biāo)進行了差異顯著性分析，結(jié)果表明，脯氨酸含量25℃組與其他各溫度組有極顯著差異，25℃組以外的各溫度組間沒有極顯著差異.可溶性糖含量25℃組與0℃，-5℃，和-10℃組間存在極顯著差異；0℃組與-5℃，-10℃組間也存在極顯著差異，說明0℃以下的低溫對可溶性糖的積累影響顯著.可溶性蛋白含量25℃組與-5℃，-10℃，-15℃，-20℃組間均存在極顯著差異.細(xì)胞相對電導(dǎo)率5℃組與-5℃，-10℃，-15℃組間存在極顯著差異.丙二醛含量25℃組與0℃，-5℃，-10℃，-15℃組間均有極顯著差異.葉綠素含量25℃組與-20℃組間有極顯著差異.

圖1　低溫應(yīng)答時野生白屈菜主要生理指標(biāo)變化趨勢

2.2　白屈菜應(yīng)答低溫生理反應(yīng)的實驗驗證

在固定光照強度、光照時間的人工氣候箱中，控制降溫，測定白屈菜在此過程中主要生理指標(biāo)的變化情況，并與野生白屈菜在降溫過程中生理指標(biāo)的變化進行比較分析，以確定白屈菜低溫應(yīng)答過程的生理狀態(tài)，結(jié)果見圖2.

在15℃～0℃的低溫馴化階段，人工控制栽培的白屈菜抗寒凍性物質(zhì)脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量開始增加(見圖2(a)—(c))，但增加幅度較小，如可溶性糖增加幅度小于野生白屈菜在這一溫度區(qū)間的變化值.在0℃～-5℃時，栽培白屈菜脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量變化趨勢與野生白屈菜相同，-5℃時幾乎均達(dá)到最大值，分別是0.721 5，49.043 1，3.648 9 mg/g，但絕對值小于野生白屈菜.-5℃～-10℃時，脯氨酸和可溶性蛋白含量呈下降趨勢，而可溶性糖含量略有升高，在這一區(qū)間，脯氨酸的變化趨勢與野生白屈菜相同，可溶性糖和可溶性蛋白的變化趨勢與野生白屈菜相反.

栽培白屈菜相對電導(dǎo)率在25℃～5℃降溫階段變化比較平穩(wěn)，變化范圍在6.920 8%～3.183%之間(見圖2d)，與脯氨酸的變化趨勢相關(guān)，反應(yīng)在這一溫度區(qū)間滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸對相對電導(dǎo)率的影響較大.0℃時，相對電導(dǎo)率升高到8.978 7%，此時脯氨酸雖略有升高但可溶性糖含量較之前顯著下降，表明隨著溫度降低白屈菜的光合作用減弱甚至停止，糖分積累減少，顯著影響細(xì)胞質(zhì)濃度，導(dǎo)致相對電導(dǎo)率升高.-5℃～-10℃階段，處于周期性光照、無保護的葉片受到冷凍損傷，細(xì)胞相對電導(dǎo)率急劇升高，達(dá)到31.990 9%，此時滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和抗凍蛋白含量升高，但可溶性蛋白含量顯著小于無光照條件下的野生白屈菜，提示光照可能影響0℃以下低溫對抗凍蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).

在固定的光周期和控制降溫條件下，丙二醛在15℃～-10℃降溫階段含量變化范圍為0.007 708～0.011 692 μmol/g，是正常生長溫度時的1.5～2.0倍，表明細(xì)胞膜氧化性提高.控制降溫過程中，盡管維持一定的光照周期，但隨著溫度降低，葉綠素含量呈下降趨勢，這種變化與野生白屈菜相同.

以25℃組樣本做對照，對各溫度組白屈菜的生理指標(biāo)做差異顯著性分析，結(jié)果表明，在完全控制的降溫過程中，脯氨酸含量25℃組與-5℃，-10℃組間存在極顯著差異.可溶性糖含量25℃組與10℃，5℃，-10℃組間存在極顯著差異.可溶性蛋白含量，20℃組與其他溫度組間均存在極顯著差異，而其他各溫度組之間沒有顯著差異.相對電導(dǎo)率-5℃，-10℃組分別與0℃以上(含0℃組)各溫度組間存在極顯著差異.丙二醛含量25℃組與5℃，-10℃組間有極顯著差異.葉綠素含量25℃組與15℃以下(包括15℃組)各組間存在極顯著差異.

圖2　控制栽培白屈菜應(yīng)答低溫時主要生理指標(biāo)變化趨勢

2.3　白屈菜低溫應(yīng)答分子機制分析

如1.1.3方法所述取樣，每個溫度點設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，進行轉(zhuǎn)錄組測序，數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量分析及篩選、數(shù)據(jù)庫比對，共獲得長度300 bp以上的基因序列(Unigene，universal gene)113 504個，平均每組有9 586 個Unigene顯示為差異表達(dá)基因，包括上調(diào)表達(dá)基因4 509個、下調(diào)表達(dá)基因5 077個.與NR、SWISS-PROT、KOG、 KEGG和GO等數(shù)據(jù)庫進行比對，被注釋的Unigene分別為58 302，41 251，34 296，14 031和36 490個，注釋比例分別為51.37%，36.34%，30.22%，12.36%和32.15%.

與GO數(shù)據(jù)庫比對后，注釋基因分組如圖3所示(圖3為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)自動生成).Unigene被大量注釋到生物過程類別的“細(xì)胞過程”“代謝過程”“生物過程的調(diào)控”，細(xì)胞組分類別的“細(xì)胞組分”“細(xì)胞膜組分”及“細(xì)胞器組分”，分子功能類別的“催化活性”“分子結(jié)合功能”及“轉(zhuǎn)運活性”.

樣本間差異表達(dá)基因分組中“細(xì)胞過程”“代謝過程”“生物過程的調(diào)控”變化與生理指標(biāo)脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量變化趨勢相吻合，“細(xì)胞組分”變化與凍害發(fā)生時可溶性蛋白含量變化趨勢相吻合.“細(xì)胞膜組分”中重要生理指標(biāo)丙二醛也發(fā)生顯著性變化.

圖3　GO注釋統(tǒng)計圖

對A(0℃)、B(-10℃)、C(-20℃)3組樣本間差異表達(dá)基因進行GO富集分析，結(jié)果見圖4(圖4為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)自動生成).由圖4可見，圖4(a)表達(dá)差異顯著的前5類基因分別是質(zhì)外體、細(xì)胞壁、質(zhì)膜、膜的錨定組分、質(zhì)膜的錨定組分；圖4(b)兩樣本間差異顯著的前5類基因分別是質(zhì)外體、細(xì)胞壁、質(zhì)膜、胞外基質(zhì)、胞外區(qū)；圖4(c)表達(dá)差異顯著的前5類基因分別是葉綠體類囊體膜、葉綠體、類囊體、葉綠體類囊體、葉綠體基粒.

樣本B與樣本A比較(見圖4(a))，主要在膜成分上出現(xiàn)差異，提示膜的滲透性、氧化性發(fā)生變化，與生理測定的相對電導(dǎo)率、丙二醛等物質(zhì)的變化趨勢一致；樣本C與樣本A比較(見圖4(b))可見，細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞外區(qū)域發(fā)生顯著變化，與電導(dǎo)率變化趨勢一致，提示植物在凍害脅迫時，可能由于膜損傷細(xì)胞內(nèi)容物滲出導(dǎo)致細(xì)胞外部出現(xiàn)變化.樣本C與樣本B比對(見圖4(c))可見，變化全部顯示在葉綠體及類囊體上，提示凍害脅迫時葉綠體受到損傷，與生理實驗中葉綠素的變化趨勢一致.

(a)樣本B與樣本A的比對結(jié)果；(b)樣本C與樣本A的比對結(jié)果；(c)樣本C與樣本B的比對結(jié)果

2.4　野生白屈菜低溫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)驗證

從樣本間差異表達(dá)基因中選取7個與脯氨酸合成代謝有關(guān)的基因、7個與低溫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因進行基因表達(dá)量的再次驗證，以檢驗轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性及生理生化指標(biāo)變化趨勢的準(zhǔn)確性.篩選的目標(biāo)基因見表1.

基因相對表達(dá)量驗證結(jié)果如圖5所示.圖5結(jié)果顯示，與脯氨酸合成及代謝相關(guān)的基因在A(0℃)組樣本中表達(dá)量高，在B(-10℃)組樣本中多數(shù)表現(xiàn)為下降，在C(-20℃)組樣本中除脯氨酸脫氫酶和鳥氨酸-氧合酸轉(zhuǎn)氨酶基因外，其他基因表達(dá)量相似或較B組降低，表明脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，主要在低溫脅迫前期發(fā)揮作用.轉(zhuǎn)錄因子CBF4/DREB1d、MYB44、ZAT10等在0℃時表達(dá)量較高，在-10℃，-20℃時表達(dá)量降低，表明其在低溫脅迫早期起調(diào)控作用，而ERF5(ethylene responsive factor 5)、ICE1(inducer ofCBFexpression 1)、WRKY40等在-20℃組表達(dá)量顯著上升，表明其在凍害脅迫時作用活躍，可能與抗凍蛋白的合成密切相關(guān).

表1　目標(biāo)基因名稱及基因庫ID編號

圖5　脯氨酸合成代謝相關(guān)基因、低溫應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子基因相對表達(dá)量驗證

3　討論

植物抗寒性的獲得與溫度、光周期密切相關(guān)[22].野生白屈菜在秋冬季來臨時，林下光照時間逐漸縮短，氣溫在5℃～0℃時，光照時間不足12 h；0℃～-10℃時，光照時間為9～10 h；氣溫降至-15℃～-20℃時，光照時間僅8～9 h，或由于積雪覆蓋，植株完全得不到光照，因此，野生白屈菜在低溫和光周期雙重作用下，較早地啟動低溫應(yīng)答反應(yīng)，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及抗凍物質(zhì)等主要生理指標(biāo)較早發(fā)生變化.而在人工控制條件下生長的白屈菜，盡管溫度不斷下降，但光照周期始終保持在12 h光照、12 h黑暗，且光照強度保持1 500 lx不變.恒定的光照周期及光照強度一定程度上延遲了白屈菜對低溫的響應(yīng)反應(yīng)，與低溫應(yīng)答相關(guān)的主要生理指標(biāo)較野生白屈菜變化要晚.我們的實驗結(jié)果顯示，野生白屈菜大約在5℃即開始啟動抗寒凍機制，生理指標(biāo)變化顯著，比控制生長的白屈菜啟動應(yīng)答溫度要高，在同樣的溫度條件下，脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的含量高于人工氣候箱中生長的白屈菜.這一結(jié)果也證明，在相同的溫度條件下，光照降低了植物的抗寒性，短日照導(dǎo)致植物抗寒能力增強.對其他植物的相關(guān)研究也證明，人為改變短日照為長日照的處理會影響抗凍鍛煉效果，植物抗凍能力下降.-5℃時兩種材料的相對電導(dǎo)率值也證明光照影響植物抗凍性的獲得，造成細(xì)胞損傷.

在控制降溫條件下生長的白屈菜丙二醛含量小于野生白屈菜的，說明在光照條件下，低溫馴化效果被部分消除，葉綠體功能得到恢復(fù)，活性氧被消除，使膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛含量降低.控制條件下生長的白屈菜葉綠素含量范圍高于野生白屈菜，這也可以證明葉綠體沒有完全損傷，功能依然存在.

基因表達(dá)驗證結(jié)果表明，7個與脯氨酸合成及代謝有關(guān)的基因在低溫脅迫的早期及寒害發(fā)生時作用活躍，細(xì)胞組分中脯氨酸含量升高，這一變化趨勢與生理指標(biāo)的測定結(jié)果相吻合.在-20℃時，與低溫應(yīng)答相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如ERF5、ICE1、WRKY40及RAV1的表達(dá)量顯著升高，這些轉(zhuǎn)錄因子在抗凍蛋白的合成中發(fā)揮直接或間接的調(diào)控作用，促進抗凍蛋白的誘導(dǎo)合成，這一結(jié)果與凍害脅迫時細(xì)胞中可溶性蛋白含量升高相吻合.因此，實驗從分子機制上初步闡明了白屈菜抗寒凍性的生理基礎(chǔ).

本文首次報道了白屈菜的抗寒性和應(yīng)答低溫脅迫的生理生化基礎(chǔ)，并首次基于白屈菜應(yīng)答低溫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析、驗證并初步揭示了其低溫應(yīng)答過程的分子機制，為今后發(fā)現(xiàn)并利用有價值的抗寒基因奠定了基礎(chǔ).

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