IL-6誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞分泌IL-10的機制研究

，，，　，

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 南充 637000)

白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)作為經(jīng)典的促炎癥細(xì)胞因子，可介導(dǎo)組織局部微環(huán)境及全身的炎癥免疫應(yīng)答，在感染性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[1-2]。有文獻(xiàn)證實，在腫瘤中IL-6的表達(dá)和分泌水平明顯增加，并通過其相應(yīng)的受體直接作用于腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)其分泌基質(zhì)金屬蛋白或上皮間質(zhì)化，從而有利于腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[3-4]。此外，IL-6還可以作用于初始CD4+細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化成熟為Th17細(xì)胞，進(jìn)而通過其效應(yīng)因子IL-17促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分泌促血管因子VEGF-A，誘導(dǎo)新生血管的形成[5]。然而，IL-6在腫瘤中的生物學(xué)特性仍未完全闡明。早期研究發(fā)現(xiàn)，IL-6能夠誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)[6]，提示IL-6可經(jīng)IL-10參與介導(dǎo)免疫抑制微環(huán)境的形成。在鼻咽癌中，腫瘤細(xì)胞可高表達(dá)IL-6的受體并分泌IL-10[7-8]?；贗L-10在腫瘤免疫抑制中的主導(dǎo)地位，那么，IL-6是否能夠誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞產(chǎn)生IL-10，進(jìn)而影響腫瘤的進(jìn)程呢？本研究擬體外培養(yǎng)鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞并利用IL-6進(jìn)行刺激，探討IL-6是否參與誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞分泌IL-10，并初步闡明其可能的分子機制。

1　材料與方法

1.1　材料

重組人細(xì)胞因子IL-6購自美國Peprotech公司，IL-10 ELISA檢測試劑盒購自深圳達(dá)科為公司，抗IL-6R抗體購自美國Biolegend公司，mRNA提取試劑盒購自美國invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Real-time PCR Master Mix購自日本Toyobo公司，NF-κB抑制劑(BAY 11-7082)、PI3K抑制劑Wortmannin、p38/MAPK抑制劑(SB203580)、JNK抑制劑(SP600125)、MEK1/2抑制劑(U0126)和STAT3抑制劑(FLLL32)購自美國MedChem Express公司，DMSO購自美國Sigma公司(所有抑制劑均用DMSO進(jìn)行溶解)，RPIM 1640培養(yǎng)基、胎牛血清以及胰酶均購自美國Hyclone公司，PBS購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)CNE-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞刺激CNE-2細(xì)胞以5×105個/孔鋪于12孔板中，加入不同濃度的重組人細(xì)胞因子IL-6進(jìn)行刺激(0、0.1、1、10 ng/mL)，或加入5 μg/mL的抗IL-6R抗體或10 μM的BAY 11-7082(NF-κB組)、Wortmannin(PI3K組)、SB203580(p38/MAPK組)、SP600125(JNK組)、U0126(MEK1/2組)、FLLL32(STAT3組)或DMSO(與抑制劑中的DMSO含量相當(dāng)，DMSO組)以及培養(yǎng)基(對照組)預(yù)孵育1 h，然后清洗掉孔中的培養(yǎng)基，再加入新的1640培養(yǎng)基并利用10 ng/mL的IL-6進(jìn)行刺激，收集CNE-2細(xì)胞及其培養(yǎng)上清，用于RT-PCR及ELISA檢測IL-10的水平。

1.2.3RT-PCRCNE-2細(xì)胞經(jīng)RNA提取試劑盒抽提mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后分別利用IL-10的引物對(上游引物：5’AGAACCT GAAGACCCTCAGGC-3’，下游引物：5’CCACGGCCTTGCTCTTGTT-3’)和β-actin的引物對(上游引物：5’-TTCCTTCCTGGGCATGGAGTCC-3’，下游引物：5’-TGGCGTACAGGTCTTTGCGG-3’)進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，然后以95 ℃變性5 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s的模式反應(yīng)40個循環(huán)，使用IQ5定量PCR儀上的軟件，以β-actin作為參考基因，采用2-△△Ct法分析IL-10的表達(dá)差異。

1.2.4ELISA根據(jù)IL-10的ELISA檢測試劑盒操作指南，檢測CNE-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-10水平。

1.3　統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1　IL-6誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-10的檢測

體外培養(yǎng)的CNE-2細(xì)胞經(jīng)IL-6刺激后，檢測IL-10的mRNA表達(dá)及分泌水平，結(jié)果顯示：IL-6不僅可以刺激CNE-2細(xì)胞上調(diào)表達(dá)IL-10(圖1a)，而且能夠誘導(dǎo)IL-10的大量分泌(圖2)，且IL-10的表達(dá)和分泌水平隨IL-6刺激劑量的增加而增加。CNE-2細(xì)胞經(jīng)IL-6刺激培養(yǎng)24 h后，IL-6刺激組(0.1、1、10 ng/mL)中IL-10的水平分別是(31.5±12.3)、(62.6±23.5)、(151.4±25.2)pg/mL，而未刺激組中IL-10的水平是(26.7±11.2)pg/mL。進(jìn)一步利用10 ng/mL的IL-6刺激CNE-2細(xì)胞，并在不同的時間點檢測IL-10的表達(dá)和分泌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著IL-6刺激時間的延長，IL-10的mRNA表達(dá)及分泌水平也逐漸增加(圖1b、表1)，由此提示IL-6可誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞上調(diào)表達(dá)并分泌免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子IL-10，且具有劑量和時間依賴性。

a:IL-6在不同濃度(0、0.1、1、10 ng/mL)下刺激CNE-2細(xì)胞24 h后IL-10的mRNA表達(dá)水平；b:10 ng/mL的IL-6在不同時間點刺激CNE-2細(xì)胞表達(dá)IL-10的mRNA水平*：P<0.05;#：P<0.01

圖1IL-6刺激CNE-2細(xì)胞表達(dá)IL-10的mRNA水平比較

*：P<0.05；#：P<0.01

表1不同時間的IL-6(10ng/mL)刺激CNE-2細(xì)胞分泌IL-10的水平比較(pg/mL)

時間 0h6h12h24h未刺激組 24.1±8.521.6±12.226.2±11.828.5±14.2IL-6(10ng/mL)25.2±12.755.4±10.6*108.9±18.2#146.7±20.7#

*：與第0 h及第6 h未刺激組比較，P<0.05；#：與未刺激組及第6 h刺激組比較，P<0.01

2.2　IL-6經(jīng)IL-6R/NF-κB信號途徑參與調(diào)控IL-10的分泌

根據(jù)IL-6可誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞分泌IL-10，我們進(jìn)一步探討其可能的機制。結(jié)果顯示：在IL-6刺激的條件下，若加入抗IL-6R抗體阻斷IL-6與其相應(yīng)受體結(jié)合，IL-10的表達(dá)和分泌顯著下降，差異具有極顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。此外，利用NF-κB抑制劑BAY 11-7082、PI3K抑制劑Wortmannin、p38/MAPK抑制劑SB203580、MEK1/2抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125和STAT3抑制劑FLLL32進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IL-6刺激的條件下，NF-κB抑制劑BAY 11-7082組中IL-10的表達(dá)和分泌水平顯著低于未加抑制劑組，差異具有極顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。而加入其他抑制劑組則與未加抑制劑或DMSO組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此提示IL-6通過IL-6R/NF-κB信號通路誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞分泌IL-10。

a:抗IL-6R抗體阻斷后對IL-6誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞表達(dá)IL-10 mRNA水平的影響；b:抗IL-6R抗體阻斷后對IL-6誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞分泌IL-10的影響*：P<0.01

圖3抗IL-6R抗體阻斷后對IL-6誘導(dǎo)IL-10表達(dá)和分泌的效果

3　討論

目前，IL-6在腫瘤中的生物學(xué)功能得到廣泛的研究和探討[9]。文獻(xiàn)報道腫瘤微環(huán)境中惡變的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及多個炎癥免疫細(xì)胞均可上調(diào)誘導(dǎo)IL-6的表達(dá)，而IL-6則進(jìn)一步通過其相應(yīng)的受體以自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮促腫瘤功能[10-11]。一方面，IL-6可直接增強腫瘤干細(xì)胞的干性特征，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和轉(zhuǎn)移；另一方面，IL-6能夠誘導(dǎo)其他炎癥因子的釋放，進(jìn)而級聯(lián)放大IL-6的促炎作用，導(dǎo)致腫瘤的不斷進(jìn)展[12]。鼻咽癌及其他癌癥患者外周血中的IL-6水平顯著增加，并與患者的疾病進(jìn)展呈顯著正相關(guān)，而患者經(jīng)放射治療后血清中的IL-6則明顯下降[13-15]，提示IL-6很可能與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，IL-6在鼻咽癌中的生物學(xué)功能特別是其抗腫瘤免疫抑制的作用機制尚未完全闡明。

a:NF-κB抑制劑BAY 11-7082、PI3K抑制劑Wortmannin、JNK抑制劑SP600125、p38/MAPK抑制劑SB203580、MEK1/2抑制劑U0126和STAT3抑制劑FLLL32預(yù)處理對IL-6誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞表達(dá)IL-10 mRNA水平的影響；b:NF-κB抑制劑BAY 11-7082、PI3K抑制劑Wortmannin、JNK抑制劑SP600125、p38/MAPK抑制劑SB203580、MEK1/2抑制劑U0126和STAT3抑制劑FLLL32預(yù)處理對IL-6誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞分泌IL-10的影響*：與未刺激組和NF-κB組比較，P<0.01

圖4不同信號通路抑制劑對IL-6誘導(dǎo)IL-10表達(dá)和分泌的比較

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6刺激CNE-2細(xì)胞后可檢測到IL-10的mRNA表達(dá)和蛋白分泌水平顯著增加，并隨著其刺激劑量的增加或者刺激時間的延長而增加，其誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-10的水平也逐漸增加。因此，這些結(jié)果表明IL-6不僅可以調(diào)控細(xì)胞因子IL-10的轉(zhuǎn)錄，而且能夠介導(dǎo)IL-10轉(zhuǎn)錄后的翻譯?；贗L-10已被公認(rèn)為免疫抑制性的細(xì)胞因子，能夠誘導(dǎo)免疫抑制性T細(xì)胞的產(chǎn)生并抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的抗腫瘤功能[16-17]，由此表明IL-6不僅利用其誘導(dǎo)組織炎癥的能力促使上皮細(xì)胞發(fā)生炎癌轉(zhuǎn)化，而且可以誘導(dǎo)IL-10的分泌促使抗腫瘤免疫的下降，進(jìn)一步放大其促瘤作用。那么，IL-6誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-10的機制是什么呢？IL-6R是傳遞IL-6信號的唯一受體，當(dāng)IL-6與細(xì)胞膜表面的IL-6R結(jié)合后，可與細(xì)胞內(nèi)的gp130亞基形成復(fù)合物，進(jìn)而激活下游級聯(lián)信號[18]。早期的研究已經(jīng)證實，IL-6R可表達(dá)于HNE1、HONE1及CNE1等多個鼻咽癌細(xì)胞系表面[7]，IL-6與這些細(xì)胞表面相應(yīng)的IL-6R結(jié)合后，能夠誘導(dǎo)金屬基質(zhì)蛋白酶MMP2和MMP9的表達(dá)和分泌，進(jìn)而降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，有助于鼻咽癌細(xì)胞的侵襲與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。然而，CNE-2鼻咽癌細(xì)胞系是否表達(dá)IL-6R并經(jīng)此調(diào)控IL-6的生物學(xué)功能并不清楚。因此，本研究利用抗IL-6R的抗體阻止IL-6與其相結(jié)合，結(jié)果觀察到IL-6刺激CNE-2細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-10的水平顯著下降?；贗L-6R是IL-6的唯一受體，由此提示CNE-2細(xì)胞表達(dá)IL-6R，可用于體外研究IL-6對鼻咽癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。

目前，已有文獻(xiàn)報道IL-6與IL-6R結(jié)合后，多個信號通路轉(zhuǎn)錄因子參與介導(dǎo)其下游的生物學(xué)調(diào)控[19-20]。那么，IL-6是通過什么信號途徑誘導(dǎo)CNE-2表達(dá)和分泌IL-10呢？因此，本研究分別加入多個信號轉(zhuǎn)錄途徑的抑制劑對CNE-2細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在IL-6的刺激下，預(yù)先加入NF-κB信號抑制劑BAY 11-7082的處理組中，CNE-2細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-10的水平顯著低于未加信號抑制劑組，而PI3K抑制劑Wortmannin、p38/MAPK抑制劑SB203580、STAT3抑制劑FLLL32、MEK1/2抑制劑U0126和JNK抑制劑SP600125處理組中IL-10的表達(dá)和分泌水平則與未加抑制劑組無明顯差異，由此證實IL-6與其相應(yīng)的受體IL-6R結(jié)合后，可激活NF-κB信號，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-10的轉(zhuǎn)錄和翻譯。其他信號通路包括PI3K、STAT3、p38/MAPK、MEK1/2和JNK等被報道可被IL-6激活，但是這些信號很可能不參與調(diào)控IL-6誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)和分泌。因此，盡管IL-6可經(jīng)其受體活化多個下游信號通路，調(diào)控大量的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，但是針對某一個特定基因如IL-10的表達(dá)很可能由單一的信號轉(zhuǎn)錄因子參與介導(dǎo)，而并非多個信號同時參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控其表達(dá)和分泌。在腫瘤組織中，IL-10是經(jīng)典的抗腫瘤免疫抑制性因子，IL-10的大量分泌可導(dǎo)致抗腫瘤免疫細(xì)胞的功能顯著下降，進(jìn)而有利于腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。因此，在鼻咽癌中，IL-6可能通過刺激鼻咽癌細(xì)胞上調(diào)表達(dá)和分泌IL-10，參與誘導(dǎo)鼻咽癌抗腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成，進(jìn)而促進(jìn)鼻咽癌的不斷進(jìn)展。

綜上，IL-6可通過IL-6R及其下游NF-κB信號途徑誘導(dǎo)鼻咽癌CNE-2細(xì)胞表達(dá)和分泌IL-10，進(jìn)而導(dǎo)致抗腫瘤免疫抑制的形成。因此，本研究為全面闡明IL-6在鼻咽癌微環(huán)境中的促瘤作用提供了新的實驗證據(jù)，并將為臨床設(shè)計靶向阻斷鼻咽癌中IL-6的腫瘤免疫治療提供新思路。

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