曾憲冬 曾灼祥 陳興會

摘 要：本研究以核酸適配體為識別元件實(shí)現(xiàn)對赭曲霉毒素A（OTA）的高選擇性識別，以及采用金納米粒子做為比色探針，建立了適用于OTA快速檢測的比色適配體傳感器。研究結(jié)果表明，該比色傳感器對OTA具有較高的靈敏度和特異性，操作簡單快速，能用于實(shí)際食品樣品中OTA的快速篩查檢測；該比色傳感器在520nm和650nm下吸光度的比值（A520/A650）與OTA濃度在0.05～5μM的范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，檢測限為0.02μM。

關(guān)鍵詞：核酸適配體 金納米粒子 比色傳感器 赭曲霉毒素A

前言

赭曲霉毒素是由多種曲霉和青霉菌產(chǎn)生的一類化合物，包括赭曲霉毒素A、B、C、D，4種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中毒性最大、與人類健康關(guān)系最密切、對農(nóng)作物的污染最重、分布最廣的是赭曲霉毒素A（OTA）[ 1 ]。OTA以污染糧谷類農(nóng)作物為主，但相繼有報(bào)道指出，許多其他種類的食品中也檢測出了OTA，如水果、葡萄酒、啤酒、咖啡、可可和巧克力、中草藥、調(diào)味料等多種植物產(chǎn)品和食品。由于生物蓄積作用，如許多動物性食品尤其是腎臟、肝臟、肌肉、血液，以及乳和乳制品中常有OTA檢出[ 2 ]。

OTA在食品中的含量通常較低，但較低含量時(shí)就可危害人體健康，因此建立一種具有一定靈敏度與專一性，且簡便實(shí)用，便于推廣的OTA快速檢測方法具有重要意義。目前應(yīng)用最廣泛的OTA檢測方法是高效液相色譜法（HPLC）及高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[ 3 ]，但這些方法存在著前處理復(fù)雜，樣品提取繁瑣、凈化過程及檢測周期長、儀器昂貴、檢測成本高等缺點(diǎn)，而無法用于大量樣本的快速篩查。

核酸適配體是新近發(fā)展起來的一類由指數(shù)富集配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選產(chǎn)生的單鏈DNA或RNA片段，能特異性地結(jié)合小分子蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)物、金屬離子等各種配體，其作為識別分子在醫(yī)療診斷、環(huán)境檢測、基礎(chǔ)分析等多種技術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用。金納米粒子具有獨(dú)特的光學(xué)特性，小粒徑金納米粒子（10～100nm）水溶膠一般呈紅色，當(dāng)金納米粒子由于外在的作用發(fā)生聚集時(shí)，其吸收峰將變寬并發(fā)生紅移，其顏色也由紅色變?yōu)樗{(lán)紫色。依據(jù)這一現(xiàn)象，將以核酸適配體為識別元件與以金納米粒子為比色探針相結(jié)合，構(gòu)建的適配體比色探針廣泛地用于各種生化檢測，檢測目標(biāo)包括生物大分子、癌細(xì)胞、金屬離子以及有機(jī)小分子[4]。

本研究開發(fā)了一種“雙鏈復(fù)合物”模式的比色探針，通過核酸適配體將金納米粒子連接在一起發(fā)生團(tuán)聚，隨著OTA與核酸適配體的結(jié)合，DNA鏈發(fā)生解鏈，連接在一起的金納米粒子由于靜電作用重新分散于溶液中，溶液顏色相應(yīng)發(fā)生改變，從而實(shí)現(xiàn)食品中OTA的快速靈敏檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

UV-2450紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；XS105DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q純水機(jī)（美國Millipore公司）。

氯金酸（HAuCl4）為分析級，購自于美國Sigma公司；赭曲霉毒素A購自于美國Romer公司；甲醇（HPLC級，德國Merck公司）；其余試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水是超純水（>18 MQ）。

包含核酸適體的DNA寡聚核苷酸（連接鏈）和兩條與之部分互補(bǔ)的DNA寡聚核苷酸（分別在3端和5端進(jìn)行巰基修飾）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列如下：

連接鏈（粗斜體為OTA適配體部分）：5-ACTCATCTGTGAAGA？GATCGGGTGTGGGTGGCG TAAAGGGAGCATCGGACA -3；5端巰基化DNA：5-HS-CACCCGATCTCT-3；3端巰基化DNA：5-TCACAGATGAGTA10-SH-3；使用前3種DNA鏈分別用水溶解，配制成100μM的溶液。

1.2 金納米粒子的制備

利用檸檬酸鈉還原法合成實(shí)驗(yàn)用的金納米粒子。具體方法如下：將100mL新鮮配制的1mM的HAuCl4溶液加入到錐形瓶中，于恒溫電磁攪拌器上加熱沸騰2min，然后迅速加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌，加熱保持沸騰10min，使溶液的顏色由淡黃色變?yōu)榫萍t色，停止加熱，攪拌使其冷卻至室溫，然后將制備的納米金溶液裝入棕色試劑瓶中，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?img src="https://cimg.fx361.com/images/2018/04/09/qkimagesspaqspaq201803spaq20180327-1-l.jpg"/>

1.3 核酸適配體-金納米粒子探針的制備

取5端巰基化DNA以及3端巰基化DNA的溶液各100μL加入10mL納米金溶液中，攪拌均勻后，在室溫下放置12h，使DNA鏈通過Au-S鍵結(jié)合到納米金表面，再加入100μL的包含核酸適配體連接鏈溶液，混合均勻后，將溶液加熱至94℃ 2min，快速冷卻至30℃，保持30min，使包含核酸適配體連接鏈與納米金表面結(jié)合的DNA雜交。然后在16000rpm下離心15min，以去除多余的、沒有和納米金結(jié)合的DNA鏈，加水清洗后再次離心，將制備的核酸適配體-金納米粒子探針用10mL濃度為20mM pH=8.5的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）分散，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 核酸適配體-金納米粒子比色探針對OTA的檢測

OTA標(biāo)準(zhǔn)溶液：用甲醇將OTA溶解配制成1mM的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，臨用前用PBS稀釋成不同濃度的測試液。

實(shí)際樣品中OTA的提取：將不含OTA的玉米樣品徹底粉碎后，加入不同濃度的OTA樣品，充分混勻。稱取5g加標(biāo)樣品，加入20mL 80%的甲醇水溶液作為提取液，渦旋混勻后震蕩提取30min，離心后將上清液用氮?dú)獯蹈?，加?00μL甲醇溶解后，加PBS緩沖溶液稀釋至1mL，通過0.45μm的微孔濾膜過濾后作為測試液。

OTA測定：將500μL核酸適配體-金納米粒子探針加入測試管中，再加入500μL待測液，用振蕩器混勻，靜置反應(yīng)15min分鐘，即可用肉眼觀察顏色變化，實(shí)現(xiàn)對OTA的快速定性檢測，用紫外可見分光光度計(jì)掃描反應(yīng)后的溶液，利用加入OTA后吸光度的變化，實(shí)現(xiàn)對OTA的快速定量檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測原理

本研究制備的“雙鏈復(fù)合物”模式的比色探針的基本原理如圖1所示：

通過兩條末端巰基化且與OTA核酸適配體部分互補(bǔ)的DNA鏈對金納米粒子進(jìn)行功能化處理，OTA核酸適配體鏈作為連接鏈，與兩條部分互補(bǔ)鏈雜交，使功能化的金納米粒子發(fā)生聚集，當(dāng)溶液中加入OTA時(shí)，OTA與核酸適配體的結(jié)合，使其DNA構(gòu)象發(fā)生改變，從而造成適配體鏈與互補(bǔ)的DNA鏈發(fā)生解鏈，團(tuán)聚的金納米粒子由于靜電作用重新分散于溶液中，顏色由藍(lán)紫色變成紅色。基于這一原理，可以構(gòu)建一種比色法來快速靈敏地檢測食品中赭曲霉毒素A。

利用投射電子顯微鏡（TEM）對核酸適配體-金納米粒子探針加入OTA前后的微觀形態(tài)進(jìn)行表征，從圖1可以看出，通過DNA雙鏈的形成，在探針溶液中金納米顆粒形成團(tuán)聚物，加入OTA后，由于核酸適配體鏈與OTA的結(jié)合，DNA雙鏈入OTA濃度的升高，溶液逐漸變成酒紅色，根據(jù)顏色變化，可以實(shí)現(xiàn)對OTA的定性及半定量檢測。而在探針溶液中加入較高濃度（10μM）的赭曲霉毒素B（OTB）后，溶液顏色仍然為藍(lán)色，這一結(jié)果說明核酸適配體-納米粒子探針對于OTA具有良好的特異性。

2.3 定量檢測OTA

核酸適配體-納米粒子探針溶液對OTA響應(yīng)過程的顏色結(jié)構(gòu)被破壞，團(tuán)聚的金納米粒子由于靜電作用在溶液中變回分散態(tài)。

2.2 目測比色法快速檢測OTA

利用核酸適配體-納米粒子探針溶液的顏色變化，可以對樣品中的OTA毒素進(jìn)行快速檢測。如圖2所示，在核酸適配體-金納米粒子探針溶液溶液中，團(tuán)聚的金納米粒子使溶液呈藍(lán)色，加入0.5μM的OTA后，溶液變成紫紅色，隨著加變化可以通過分光光度計(jì)來測定。金納米粒子的團(tuán)聚使核酸適配體-納米粒子探針溶液在650nm左右有較寬的吸收峰，隨著OTA與核酸適配體的結(jié)合，金納米顆粒重新分散在溶液中，其吸收光譜在520nm處出現(xiàn)一個特征吸收峰，隨著OTA濃度的升高，650nm下的吸光度（A650）不斷降低，而520nm下的吸光度（A520）不斷增大，兩個波長下的吸光度比值A(chǔ)520/A650與OTA的濃度在0.05～5μM的范圍內(nèi)，呈線性相關(guān)，線性相關(guān)系數(shù)為0.996。以空白溶液的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)，OTA的檢出限為0.02μM。對于加標(biāo)濃度分別為5、10、50μg/kg的玉米粉進(jìn)行加標(biāo)測定，回收率在75%～102%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.8%～9.6%之間。

3 結(jié)論

本研究基于核酸適配體作為生物識別元件，金納米粒子作為比色探針，建立了一種適用于OTA檢測的比色適配體傳感器，本實(shí)驗(yàn)方法操作簡單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，根據(jù)溶液顏色變化，肉眼觀察即可對樣品中OTA進(jìn)行靈敏檢出，通過分光光度計(jì)對溶液吸收光譜的變化可以對OTA進(jìn)行準(zhǔn)確地定量檢測，實(shí)際樣品分析檢測表明該方法可用于食品中快速篩查檢測。參考文獻(xiàn)：

[1] 疏秀林，施慶珊，歐陽友生.赭曲霉毒素的產(chǎn)生及鑒別[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，10：2183-2185.

[2] 李鳳琴，計(jì)融.赭曲霉毒素A與人類健康關(guān)系研究進(jìn)展衛(wèi)生研究[J].2003，32（2）：172-175.

[3] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB5009.96-2016.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中赭曲霉毒素A的測定.2016.

[4] Song S， Wang L， Li J， Zhao J， Fan C. Aptamer-based biosensors[J]. Trends in Analytical Chemistry. 2008， 27： 108-117.