基于COⅠ基因的美國白蛾與近似種類分子檢測技術(shù)研究

錢　路，馬麗娜 ，吳　晶 ，李　健 ，安榆林 ，郝德君

（1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.常州出入境檢驗檢疫局，江蘇 常州213001；3.南京出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 211106；4.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210000）

美國白蛾Hyphantria cunea是一種食性廣、危害大的世界性檢疫害蟲。原產(chǎn)北美，傳入并廣泛分布于南美洲大部分地區(qū)[1]。其成蟲具有趨光性，可飛行380多米，可隨貨物及交通工具的運輸進行遠距離擴散[2]。美國白蛾于1940年傳入歐洲，先后侵入匈牙利、羅馬尼亞、保加利亞、奧地利、原蘇聯(lián)、波蘭和法國，并于1945年后先后傳入日本、韓國、朝鮮。1979年從遼寧丹東傳入我國后，先后擴散至陜西、河北、北京、天津、河南、山東、安徽和江蘇等省市，造成重大經(jīng)濟損失和生態(tài)環(huán)境的破壞[3-4]。由于美國白蛾具有食性雜、食量大、繁殖能力強、適生性廣、傳播速度快、危害嚴重等特點，已經(jīng)成為我國最具危險性的外來入侵物種之一，被國家林業(yè)局列為全國林業(yè)檢疫性有害生物[5]。因此，嚴格防控美國白蛾已成為維護我國生態(tài)安全和林木資源的重要任務(wù)。

美國白蛾與楊毒蛾Leuoma candida、榆毒蛾Lvela ochropoda、星白雪燈蛾Spilosoma menthastri、稀點雪燈蛾Spilosoma urticae和白雪燈蛾Spilosoma niveus等種類不僅成蟲的體色和形態(tài)上非常相似，不易鑒別，而且卵、幼蟲、蛹也難以區(qū)分。由于美國白蛾的成蟲、幼蟲和蛹等不同蟲態(tài)均可隨果品及包裝材料遠距離傳播擴散，出入境口岸截獲后僅僅依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法很難做出快速準確的識別和鑒定。而相比形態(tài)分類學(xué)方法，近些年發(fā)展起來的DNA條形碼(DNA barcode) 檢測技術(shù)簡便易操作、快速且準確率高，因而在生物分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等遺傳分析研究中的應(yīng)用日漸增多[7-9]。其中線粒體DNA由于具有提取技術(shù)簡單、母系遺傳、無重組、單拷貝、進化速率較核基因快等特點，常被選做DNA條形碼技術(shù)中的分子標記[10-11]。線粒體細胞色素氧化酶 C 亞基Ⅰ( mt DNACOⅠ) 基因是目前背景研究最為清楚的基因之一，其結(jié)構(gòu)相對保守但種間變異較大，能夠提供較全的系統(tǒng)發(fā)育信息，在昆蟲近緣種間的系統(tǒng)進化研究及分類鑒定等方面都有較廣泛的應(yīng)用，也為出入境檢疫部門快速、準確地檢疫鑒定截獲的昆蟲提供了新方法[12-15]。

關(guān)于分子標記技術(shù)如AFLP、RAPD和微衛(wèi)星位點等方法在美國白蛾的種群遺傳結(jié)構(gòu)方面已有研究[16-19]，但是利用分子標記方法比較分析美國白蛾與近緣種或相似種的種間鑒定技術(shù)的研究尚未見報道。因此，本研究以美國白蛾及其形態(tài)相似的8種蛾類的COⅠ基因為模板，設(shè)計美國白蛾特異性熒光探針，建立快速、高效、可靠的美國白蛾快速分子鑒定技術(shù)，以期可以對成蟲、蛹、幼蟲和卵不同蟲態(tài)實現(xiàn)快速、準確的鑒定效果，為出入境口岸和森防部門檢疫、監(jiān)測美國白蛾具有十分重要的實踐意義。

1　材料與方法

1.1　供試蟲源

本實驗選取了美國白蛾及其形態(tài)近似的8種蛾類，蟲樣形態(tài)特征見圖1。該實驗蟲樣分別采自安徽、江蘇、浙江、河北等地，具體信息見表1。蟲樣保存于5 mL離心管中，用無水乙醇浸泡，于－20 ℃冰箱保存，供實驗用。

圖1　蟲樣的形態(tài)Fig.1　The morphologic pictures of sample insect

1.2　實驗方法

1.2.1　總DNA提取

樣品DNA的提取采用GenMagBio動物細胞組織/細胞基因組DNA 磁珠提取試劑盒。

1.2.2　PCR引物

參考Herbert的研究，用通用引物L(fēng)epF1和LepR1[19]對供試樣本進行PCR反應(yīng)擴增COⅠ基因并測序。具體見表2。

表1　實驗用蟲樣信息Table 1　Information of insect in experiment

表2　PCR擴增所用到的引物Table 2 The primers of polymerase chain reaction (PCR)

1.2.3　PCR擴增COⅠ基因片段

在PCR儀(Epgradient S)上以25 μL的體系：2 μL MgCl2（25 mmol/L），2.5 μL 10×Buffer，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，1 U Taq DNA polymerase，0.5 μL LepF1/LepR1（Genscript）進行擴增，蟲樣的總DNA模板1 μL，后加dd H2O至終體積25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 1 min， 5個循環(huán)的預(yù)擴增（94 ℃40 s，45 ℃ 0 s，72 ℃ 1 min）加 35 個循環(huán)（94 ℃40 s，51 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min），最后在 72 ℃下延伸5 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物，采用1.5 %凝膠電泳分析檢測（Agarose gel electrophoresis）。將含有目的條帶的PCR產(chǎn)物直接送到南京金斯瑞有限公司雙向測序。

1.2.4　美國白蛾COⅠ基因特異性引物設(shè)計

根據(jù)測序比對結(jié)果，找出美國白蛾的特異性堿基位點，設(shè)計美國白蛾特異性引物HC-F和HC-R（500 nmol/L），引物序列見表3。

表3　美國白蛾特異性引物Table 3 The specific primers of Hyphantria cunea

在引物HC-F和HC-R擴增片段之間再尋找美國白蛾的特意堿基位點設(shè)計MGB探針，探針的核酸序列為AAGTATGGTAATAGCTC，5’末端標記有熒光報告基團FAM，3’末端標記有熒光淬滅基團NFQ，濃度為250 nmol/L。

引物HC-F、HC-R和MGB探針在COⅠ基因上的大致位置見圖2。

圖2　特異性引物探針位置Fig.2　Location sketch map of speci fic primer probe

1.2.5　實時熒光PCR

PCR反應(yīng)體系（20 μL）：0.5 U Taq DNA polymerase ，2 μL 模板 DNA，10 μL TaqMan mix，從100 nmol/ L ～ 1 000 nmol/ L以50 nmol/ L遞增的引物HC-F/HC-R及濃度從50 nmol/L ～500 nmol/L以25 nmol/ L遞增的MGB探針，對引物和探針濃度進行不同的配比試驗。根據(jù)Ct值和曲線形態(tài)，確定最佳濃度以及配比。

針對ABI 7500型實時熒光定量PCR儀，對退火溫度、循環(huán)參數(shù)進行了優(yōu)化試驗，以期達到最佳擴增效率。

2　結(jié)果與分析

2.1　美國白蛾與近似種COⅠ基因的獲得

用通用引物L(fēng)epF1和LepR1[9]對供試樣本進行PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物的電泳圖如圖3。從圖3可以看出，各供試樣本PCR產(chǎn)物在700 bp左右均有條帶出現(xiàn)。將美國白蛾P(guān)CR產(chǎn)物測序結(jié)果與NCBI上的序列進行比對，相似度達100%，說明本方法的PCR產(chǎn)物確實為美國白蛾的COⅠ序列。

圖3　美國白蛾及其近似種樣品PCR擴增產(chǎn)物的電泳（部分樣品）Fig.3　Ampli fication of PCR product about Hyphantria cunea and other allied species

用MEGA7.0軟件對測序獲得的美國白蛾COⅠ和其他近源種的COⅠ進行構(gòu)建進化樹分析，1 000次重復(fù)結(jié)果，分析無誤的序列上傳至Genbank，見圖4。結(jié)果表明，從不同地區(qū)采集的美國白蛾Hyphantria cunea位于進化樹同一分支上，說明它們來自于相同的祖先。進化樹分析表明凈雪燈蛾Spilosoma album和凈污燈蛾Spilarctia album位于同一分支上，作者分析認為凈雪燈蛾和凈污燈蛾可能是同物異名。另外，進化樹結(jié)果顯示來自不同地區(qū)的相同物種（人紋污燈蛾、八點灰燈蛾、紅緣燈蛾和楊雪毒蛾）均能分別聚集到同一分支，說明地域的差異并沒有引起他們COⅠ基因的改變，顯示出其在進化上的保守性。

2.2　美國白蛾COⅠ基因?qū)崟r熒光PCR體系的建立

反應(yīng)體系最終確定為：總體系20 μL，各組分加入量分別為：TaqMan mix 混合反應(yīng)液10 μl，上游引物HC-F為0.5 μL，下游引物HC-R為0.5 μL，MGB 探針為 0.25 μL，模板 2 μL，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL (5 U/μL)，加 ddH2O 補足到 20 μL。反應(yīng)程序為：50 ℃ 2 min，95 ℃預(yù)變性10 min；進入循環(huán)，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共 40個循環(huán)。

結(jié)果見圖5，美國白蛾的4個樣本都出現(xiàn)了熒光信號，而楊雪毒蛾、紅緣燈蛾、八點灰燈蛾、人紋污燈蛾、凈雪燈蛾、凈污燈蛾、星白雪燈蛾、白雪燈蛾的DNA擴增產(chǎn)物沒有熒光信號，表明該引物探針和熒光PCR方法能夠?qū)γ绹锥赀M行特異性的擴增。

圖4　鄰接法基于COⅠ基因構(gòu)建的美國白蛾及近似種系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4　Neighbor-joining phylogenetic tree of COⅠgene of Hyphantria cunea and other allied species

圖5　實時熒光PCR特異檢測美國白蛾熒光Fig.5　Fluorescence diagram of Hyphantria cunea by qRT-PCR

2.3　美國白蛾COⅠ基因熒光PCR循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化

采用實時熒光PCR檢測其靈敏度，具體結(jié)果見圖6。美國白蛾的所有測試濃度都出現(xiàn)熒光檢測信號，Ct值與DNA模板濃度相關(guān)。模板濃度為2.5 ng/μL、0.25 ng/μL、25 pg/μL、2.5 pg/μL、0.25 pg/μL時，擴增的Ct值分別為18.1，21.8，25.4，29.2，32.8。在0.25 pg/μL的濃度下熒光PCR擴增曲線明顯，兩個平行樣間的Ct值分別為33.1和32.7，體現(xiàn)了良好重復(fù)性，表明該方法的檢測下限在0.25 pg/μL以下。上述結(jié)果說明，采用引物HC-F/HC-R和探針HC-TZ能夠?qū)?.25 pg/μL以上濃度的樣本進行穩(wěn)定的擴增，重復(fù)性實驗結(jié)果相一致，表明采用上述引物和探針對美國白蛾的檢測靈敏度為 0.25 pg/μL。

圖6　實時熒光PCR檢測美國白蛾的靈敏度結(jié)果Fig.6　Sensitivity analysis of Hyphantria cunea by qRT-PCR

3　小結(jié)和討論

基因克隆以及分子標記等技術(shù)是開展入侵遺傳學(xué)、昆蟲毒理等研究必不可少的手段之一，其在昆蟲的分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)、種群動態(tài)與遺傳關(guān)系、入侵等分析中起到了重要的作用。毛珊珊等[20]利用cDNA末端快速擴增(RACE)方法擴增松墨天牛ERP基因，并結(jié)合實時熒光定量PCR的方法研究了其防御相關(guān)機制，揭示了其免疫與分子毒理之間的相互作用。此外昆蟲基因組研究中，高效的多態(tài)性分子標記技術(shù)應(yīng)用越來越多，如隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPDs）、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、微衛(wèi)星等；另外可以利用單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的分子標記技術(shù)檢測基因中保守的遺傳變異情況[21]。DNA條形碼技術(shù)由于具有簡便、準確、高效的特點，因此在昆蟲鑒定中的作用日漸加強，目前許多國家將DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用到外來物種的鑒定之中[22-23]。而其中基于COⅠ基因的DNA條形碼鑒定技術(shù)應(yīng)用更加廣泛，尤其在形態(tài)學(xué)難以鑒定的蚧蟲、實蠅、小蠹蟲、舞毒蛾等分類中的應(yīng)用較多[24-26]，解決了非成蟲蟲態(tài)、復(fù)合種、隱存種、近緣近似種、不同地理種等鑒定疑難問題，為重大的檢疫性害蟲的鑒定監(jiān)測提供了技術(shù)支持。

本研究通過生物信息學(xué)分析和PCR技術(shù)測定了美國白蛾及星白雪燈蛾、白雪燈蛾、楊雪毒蛾、紅緣燈蛾、八點灰燈蛾、人紋污燈蛾、凈雪燈蛾、凈污燈蛾等8個近似種的線粒體COⅠ基因片段，進行了DNA條形碼比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示除了凈雪燈蛾、凈污燈蛾外，其它DNA條碼都為各物種所獨有，不存在物種之間的共享，提示該條碼在美國白蛾及其近似種中有很好的識別能力，可以用于美國白蛾的物種鑒定。DNA條碼也為凈雪燈蛾和凈污燈蛾為同物異名提供了分子證據(jù)。同時篩選得到美國白蛾的特異性DNA序列，并以此設(shè)計出針對美國白蛾快速鑒定的MGB探針，應(yīng)用熒光PCR方法能夠?qū)γ绹锥赀M行特異性的擴增。本項目的研究結(jié)果為美國白蛾的口岸檢疫鑒定、森防部門的監(jiān)測和除治提供了新型技術(shù)手段。

參考文獻：

[1]Gomi T. Geographic variation in critical photoperiod for diapause induction and its temperature dependence inHyphantria cuneaDrury (Lepidoptera: Arctiidae)[J]. Oecologia, 1997, 111(2): 160-165.

[2]李明陽,菅利榮,劉 禮. 紫金山風(fēng)景林外來入侵物種潛在適生性評價[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2007,27(1):99-103.

[3]蘇茂文, 張鐘寧. 外來有害生物美國白蛾人侵、危害和治理[J]. 生物學(xué)通報, 2008,43(12): 1-2.

[4]林 曉, 邱立新, 曲 濤, 等. 美國白蛾發(fā)生現(xiàn)狀及治理策略探討[J]. 中國森林病蟲, 2016, 35(5): 41-42.

[5]徐 明, 徐福元, 吳小芹, 等. 蘇云金桿菌與滅幼脲混劑對美國白蛾幼蟲圍食膜的破壞研究[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2016, 40(3): 52-56.

[6]梅麗娟, 尤德康, 蘇宏鈞, 等. 美國白蛾國家級工程進展及治理對策[J]. 中國森林病蟲, 2002, 21(2): 42-44.

[7]Hebert PD, Cywinska A, Ball SL,et al.Biological identi fications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences, 2003, 270 ( 1512) : 313-321.

[8]王 鑫, 黃 兵. DNA條形編碼技術(shù)在動物分類中的研究進展[J]. 生物技術(shù)通報, 2006,22(4): 67-72.

[9]趙淑清, 武維華. DNA分子標記和基因定位[J]. 生物技術(shù)通報, 2000, 7(6): 1-4.

[10]Harrison R G. Animal mitochondrial DNA as a genetic marker in population and evolutionary biology[J]. Trends in Ecology &Evolution, 1989, 4(1): 6-11.

[11]Moritz C, Dowling T, Brown W. Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics[J]. Annual Review of Ecology and systematics, 1987,269-292.

[12]Beard, C, Hamm D, Collins F. The mitochondrial genome of the mosquitoAnopheles gambiae: DNA sequence, genome organization, and comparisons with mitochondrial sequences of other insects[J]. Insect molecular biology, 1993(2): 103-124.

[13]潘程瑩, 胡 婧, 張 霞, 等. 斑腿蝗科Catantopidae七種蝗蟲線粒體COⅠ基因的DNA條形碼研究[J]. 昆蟲分類學(xué)報,2006, 28 (2) :103-110.

[14]Nagoshi R N, Brambila J, Meagher R L. Use of DNA barcodes to identify invasive armywormSpodopteraspecies in Florida[J].Journal of Insect Science, 2011, 11(154): 1-11.

[15]陳夢義, 徐 梅, 錢 路, 等. DNA條形碼試劑盒檢測技術(shù)在墨天牛鑒定中的應(yīng)用[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015, 39(6) : 336-343.

[16]Tao J, Ai Y, Luo Y,et al. AFLP analysis of genetic variation ofHyphantria cunea(Drury) populations in Beijing and a nearby site[J]. Forestry Studies in China, 2009, 11(1): 14-19.

[17]闞國仕, 李 雪, 丁建云. 美國白蛾種群遺傳分化的RAPD 分析[J]. 生態(tài)學(xué)雜志,2009,28(10): 2032-2036.

[18]高寶嘉,杜 娟,高素紅, 等. 美國白蛾種群的遺傳多樣性與遺傳分化[J]. 林業(yè)科學(xué), 2010, 46(8): 120-124.

[19]劉 頡, 李 婧, 陳 敏, 等. 中國美國白蛾種群遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2012, 34(4): 107-113.

[20]毛珊珊,吳華俊,林 同.松墨天牛包囊蛋白基因的克隆及表達特性分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報, 2016, 36(1): 107-111.

[21]徐汝梅. 昆蟲種群生態(tài)學(xué)[M]. 北京師范大學(xué)出版社, 1987.

[22]Davis G A, Havill N P, Adelman Z N,et al.DNA barcodes and molecular diagnostics to distinguish an introduced and nativeLaricobius(Coleoptera: Derodontidae) species in eastern North America[J]. Biological Control, 2011, 58(1): 53-59.

[23]劉慎思, 張桂芬, 武 強, 等. 桔小實蠅幼體及成蟲殘體DNA條形碼識別技術(shù)的建立與應(yīng)用[J]. 昆蟲學(xué)報, 2012, 55(3):336-343.

[24]徐 浪, 余道堅, 焦 懿,等. 新菠蘿灰粉蚧及其近似種的DNA條形碼鑒定[J]. 植物檢疫, 2013, 27(3):66-69.

[25]Chang H, Liu Q, Hao DJ,et al.DNA barcodes and molecular diagnostics for distinguishing introducedXyleborus(Coleoptera: Scolytinae) species in China[J]. Mitochondrial DNA, 2013, 25(1): 63.

[26]Lu Qian, Yulin An, Mei Xu,et al.COI gene geographic variation of Gypsy moth (Lepidoptera Lymantriidae) and a TaqMan PCR diagnostic assay[J], DNA Barcodes, 2014, 2(1):2099-1077.