陸地棉GhWOX4轉(zhuǎn)錄因子的克隆與生物信息學分析

楊衛(wèi)軍， 呂有軍，，3， 趙蘭杰， 張永山

(1.安陽工學院，河南安陽 455000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，河南安陽 455000；3.棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽 455000)

WOX(WUSCHEL-related homeobox)基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白在植物的生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[1-3]。該家族蛋白含有1段能夠與DNA序列特異結(jié)合的由60～66個氨基酸組成的同源異型結(jié)構(gòu)域(home domain，簡稱HD)，具有調(diào)控植物干細胞分裂分化、胚發(fā)育、側(cè)生器官發(fā)育、頂端分生組織分化和花器官形成等多種重要功能[4-8]。

不同植物中WOX基因的生物學功能不同，在植物生長發(fā)育過程中各自扮演著重要的角色。目前已有報道發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組中存在15個WOX，各個WOX成員在擬南芥中的功能不同[9]。AtWUS基因與莖尖頂端分生組織發(fā)育相關(guān)，同時也參與花藥和子房發(fā)育過程[10-12]；AtWOX3基因調(diào)控擬南芥花瓣的發(fā)育[13]，AtWOX13和AtWOX14基因除了參與擬南芥花器官發(fā)育外，還影響擬南芥根發(fā)育[14]；AtWOX11和AtWOX12基因共同參與外植體根器官發(fā)育[15]。水稻基因組中OsWOX1是參與調(diào)控不定根生長發(fā)育的主要基因，對激活冠狀根的生長發(fā)育具有重要作用[16]。此外，在玉米、茄子、番茄、楊樹和高粱等植物中也有關(guān)于WOX基因的報道[9，17-18]。棉花是世界上一種重要的經(jīng)濟作物，其生長發(fā)育經(jīng)歷多個階段。迄今為止，棉花WOX基因在棉花生長發(fā)育過程中的功能未知。本研究以中69-11165為試驗材料，采用反轉(zhuǎn)錄PCR(簡稱RT-PCR)技術(shù)克隆GhWOX4基因的cDNA全長序列，并進行生物信息學分析，從基因及蛋白結(jié)構(gòu)、序列比對、系統(tǒng)進化樹等方面分析該基因的結(jié)構(gòu)和功能，為進一步揭示W(wǎng)OX轉(zhuǎn)錄因子在棉花生長發(fā)育過程中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1植物材料陸地棉(GossypiumhirsutumL.)中69-11165由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所中熟課題組提供，種植在中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所東場試驗站。從田間植株摘取葉片，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取。

1.1.2試劑材料RNA提取使用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒；焦碳酸二乙酯(DEPC)水、氨芐青霉素(AMP)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)大腸桿菌(Escherichiacoli)Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、KOD-Plus-Neo、pEASY-Blunt Cloning Kit載體、Maker Ⅲ購自寶生物工程(大連)有限公司；反轉(zhuǎn)錄酶TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物和DNA測序由蘇州金唯智生物科技有限公司合成及完成。

1.2　方法

RNA提取采用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒，采用ND1000紫外-可見分光光度計測定D260 nm和D280 nm，計算RNA濃度與純度。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。按照轉(zhuǎn)錄酶TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書合成cDNA的第1鏈。

1.2.1棉花GhWOX4基因克隆用擬南芥AtWOX4(AT1G46480)蛋白序列作為探針，在四倍體陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(http：//www.cottongen.org)中通過Blast比對發(fā)現(xiàn)了4個相似性較高的基因Gh_D05G1962、Gh_A05G1768、Gh_D01G1055 和Gh_A01G0998。由于這些基因在棉花中的功能未知，筆者選取其中1個基因Gh_D01G1055作為研究對象，用Primer3設(shè)計擴增開放閱讀框的引物(表1)。以棉花葉片cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系見表2。

表1　引物序列

表2　PCR擴增反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳進行檢測，回收并純化后連接至Peasy-Blunt Cloning Kit載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell感受態(tài)細胞，挑取單菌落，搖菌，將鑒定正確的質(zhì)粒送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

1.2.2GhWOX4基因序列的生物信息學分析用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；用在線HNN軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)在線預(yù)測和分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成形式；用EBL-EBI (http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)和NCBI的BlastP分析氨基酸序列的蛋白質(zhì)保守區(qū)；用IBS 1.0軟件繪制蛋白結(jié)構(gòu)域圖；用SignaIP和WOLF PSORT(http：//psort.hgc.jp/)進行信號肽及亞細胞定位分析；用DNAMAN和Clustal X進行多重序列比對及同源性比對；用MEGA 6.0軟件構(gòu)建進化樹。

2　結(jié)果與分析

2.1　陸地棉GhWOX4基因克隆及序列分析

以擬南芥AtWOX4(AT1G46480)蛋白序列作為探針，在四倍體陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫(http：//www.cottongen.org)中發(fā)現(xiàn)了4個相似性較高的基因Gh_D05G1962、Gh_A05G1768、Gh_D01G1055 和Gh_A01G0998。由于這些基因在棉花中的功能未知，筆者選取其中1個基因Gh_D01G1055作為研究對象，其基因組序列全長為1 962 bp，包含長度為654 bp的開放閱讀框(ORF)，以中69-11165棉纖維cDNA為模板，用特異引物GhWOX4F和GhWOX4R進行RT-PCR擴增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條600 bp左右的目的條帶(圖1)。回收目的片段，測序結(jié)果分析顯示擴增獲得的cDNA序列包含長度為657 bp的開放閱讀框，編碼218個氨基酸，與陸地棉Gh_D01G1055序列相似性為99.27%，氨基酸序列一致性為72.40%，表明陸地棉不同種間核酸序列存在一些差異。鑒于棉花中WOX基因尚未見到相關(guān)研究報道，將其命名為GhWOX4(NCBI登錄號為KX900572)。

2.2　GhWOX4基因編碼蛋白生物信息學分析

從GhWOX4基因cDNA序列推測GhWOX4蛋白包含218個氨基酸殘基，用ProtParam預(yù)測GhWOX4蛋白的基本理化性質(zhì)。結(jié)果表明，GhWOX4蛋白分子式為C1119H1 762N336O311S9，理論分子量為25.19 ku，理論等電點(pI)為10.04，酸性氨基酸(Asp+Glu)有19個，堿性氨基酸(Arg+Lys)有36個；含量最豐富的氨基酸有Leu(9.2%)、Lys(9.2%)和Gly(8.3%)；脂肪系數(shù)為63.99，總平均親水性為0.913，不穩(wěn)定系數(shù)為58.61，為不穩(wěn)定蛋白。采用HNN在線預(yù)測分析GhWOX4蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，該蛋白主要由α-螺旋、延伸直鏈和無規(guī)則卷曲3種結(jié)構(gòu)形式構(gòu)成，其中α-螺旋包含71個氨基酸，約占32.57%，延伸直鏈包含28個氨基酸，約占12.84%，無規(guī)則卷曲包含119個氨基酸，約占39.86%?？梢?，無規(guī)則卷曲是該蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

為了進一步確定GhWOX4基因是否屬于WOX家族，用EBL-EBI在線分析，結(jié)合NCBI 中的BlastP比對，對該基因氨基酸序列進行蛋白質(zhì)保守區(qū)分析，發(fā)現(xiàn)GhWOX4基因具有1個同源異型HD(第74位至第147位氨基酸)結(jié)構(gòu)域，該基因?qū)儆诘湫偷腤OX家族成員，其位置如圖2所示。采用SignaIP分析GhWOX4蛋白信號肽并預(yù)測信號肽位點表明，其平均分小于0.500，最大Y值預(yù)測表明GhWOX4蛋白不存在信號肽及切割位點，屬于非分泌蛋白(圖3)。由WOLF PSORT軟件在線預(yù)測該蛋白的亞細胞定位情況表明，GhWOX4蛋白主要定位在細胞質(zhì)和過氧化物酶體上，在線粒體基質(zhì)中有少量分布。

2.3　GhWOX4蛋白多重序列比對和蛋白進化樹分析

為了解棉花GhWOX4蛋白與其他植物WOX蛋白的親緣關(guān)系，用DNAMAN軟件將GhWOX4氨基酸序列與NCBI上公布的其他植物的WOX蛋白進行多重序列比較，結(jié)果表明棉花GhWOX4與GenBank中桑樹、番茄等植物的蛋白序列相似性均較低，與擬南芥和可可樹相似性較高，與陸地棉 Gh_D01G1055 氨基酸序列相似性最高，其同源區(qū)域主要集中在同源異型HD結(jié)構(gòu)域，進一步確定該基因?qū)儆赪OX家族成員，如圖4所示?；诿藁℅hWOX4及其他植物WOX基因蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析結(jié)果表明，棉花GhWOX4基因同陸地棉Gh_D01G1055基因、擬南芥AtWOX4基因、可可樹TcWOX4基因、番茄SlWOX4基因等在同一個進化分支上，屬于WOX4亞家族，如圖5所示。

3　結(jié)論與討論

與其他植物相比，棉花中大多數(shù)的WOX基因仍未被克隆及研究，本試驗通過RT-PCR技術(shù)克隆了陸地棉中1個WOX基因GhWOX4。氨基酸序列分析和蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，GhWOX4基因含有典型的HD同源異型結(jié)構(gòu)域，并且與擬南芥AtWOX4基因、可可樹TcWOX4基因等具有很高的序列同源性，因此屬于WOX基因家族。

系統(tǒng)樹分析表明，GhWOX4基因?qū)儆赪OX基因家族的Ⅰ類亞家族成員，與陸地棉中Gh_D01G1055蛋白、擬南芥AtWOX4、可可樹TcWOX4、番茄SlWOX4等在同一個進化分支上。有研究表明，擬南芥AtWOX4基因在維管束形成層和原形成層表達，促進形成層和原形成層分化，影響植物的次生生長[19]。沉默OsWOX4后，水稻莖尖分生組織發(fā)育異常，植株矮小，株型異常，葉片失綠發(fā)黃[20]。OsWOX4除了參與維管束發(fā)育，在花的分生組織和花序中也有很高的表達水平[20]。番茄中過表達SlWOX4，其篩管和導管數(shù)量明顯增多[21]。經(jīng)高溫脅迫處理后番茄通過相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導途徑抑制了SlWOX4的表達水平，表明番茄可能通過調(diào)節(jié)SlWOX4在器官組織中的表達水平來調(diào)控其發(fā)育進程來響應(yīng)高溫干旱環(huán)境[18]。

通過其他植物WOX4基因功能研究發(fā)現(xiàn)，WOX4不僅參與維管束及花器官發(fā)育，同時對逆境脅迫具有一定的應(yīng)答機制。本研究表明，GhWOX4基因?qū)儆赪OX轉(zhuǎn)錄因子家族，具體功能有待利用分子生物學手段進行進一步分析驗證，最終為闡明WOX轉(zhuǎn)錄因子在棉花生長發(fā)育中的功能和機制奠定基礎(chǔ)。

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