利用高通量測(cè)序法分析中國(guó)北方葡萄園土壤細(xì)菌的多樣性

宋雪潔， 劉　波， 劉天明

(齊魯工業(yè)大學(xué)/山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250353)

葡萄園的地理位置、土壤類型及肥力狀況對(duì)葡萄、葡萄酒的質(zhì)量都有一定影響，尤其是土壤中的某些元素影響著葡萄植株的生長(zhǎng)及果實(shí)產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。葡萄樹(shù)和土壤微生物群落之間有著密切的互生關(guān)系，土壤微生物的種群多樣性和功能多樣性對(duì)維持土壤生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡、促進(jìn)根系營(yíng)養(yǎng)吸收利用起到主要作用，同時(shí)葡萄樹(shù)通過(guò)影響土壤環(huán)境來(lái)影響土壤微生物的結(jié)構(gòu)和多樣性[2]。葡萄作為多年生藤本植物，不可能年年輪作清茬，且施肥與灌溉方式受限，這會(huì)明顯影響土壤微生物的多樣性[3]。因此，研究葡萄園土壤微生物多樣性，對(duì)合理制定土壤管理措施、促進(jìn)根際微生物結(jié)構(gòu)優(yōu)化、實(shí)現(xiàn)葡萄的優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義[4]。另外，葡萄果實(shí)品質(zhì)的形成與生態(tài)因子、配套農(nóng)業(yè)技術(shù)密切相關(guān)，目前，有關(guān)溫度、降水等生態(tài)因素及灌溉方式、整形架式、施肥措施等農(nóng)業(yè)耕作制度對(duì)葡萄生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)的影響已有大量報(bào)道[5-7]，而不同生態(tài)地域葡萄園土壤微生物的多樣性研究相對(duì)較少，葡萄根際微生物菌群數(shù)量、結(jié)構(gòu)變化與土壤肥力、地上葡萄果實(shí)品質(zhì)、釀酒品質(zhì)的相關(guān)性研究相對(duì)更少。探討不同地域、不同深度的根際微生物群落差異性，對(duì)合理指導(dǎo)和完善施肥制度、合理改良土壤肥力、釀造優(yōu)質(zhì)的葡萄酒同樣有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)意義。

基于形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)等傳統(tǒng)方法研究微生物群落的多樣性已取得較多的科研成果，但由于土壤中絕大部分微生物是不可培養(yǎng)的，傳統(tǒng)的分離鑒定方法只能區(qū)分環(huán)境微生物種類中的0.1%～10%，而變性梯度凝膠電泳(DGGE)也僅能夠反映有限的優(yōu)勢(shì)微生物類群，這導(dǎo)致對(duì)環(huán)境微生物群落多樣性的認(rèn)識(shí)受到限制[8]，有可能會(huì)低估土壤微生物的物種組成，并高估其豐度。李橋利用高通量技術(shù)研究細(xì)菌群落對(duì)鹽生植被演替的響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，盡管取樣地點(diǎn)不同，但處于相同生境中的微生物類群有相似性，不同植被類型的土壤主要微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯不同[9]。本研究采用以宏基因高通量測(cè)序技術(shù)為導(dǎo)向的細(xì)菌鑒定和檢測(cè)方法，能快速、全面、準(zhǔn)確地探究葡萄根際微生物的群落種類、數(shù)量，可獲取更加豐富的微生物多樣性信息，對(duì)傳統(tǒng)培養(yǎng)法難于觀察到的微生物種類及功能研究提供了可行性。

1　材料與方法

1.1　樣品采集

2015年8月，從甘肅省蘭州市和武威市威龍基地、寧夏回族自治區(qū)銀川市永寧縣、河北省懷來(lái)縣、山東省德州市和東營(yíng)市用孔徑為4 cm的滅菌打孔器采集16年生葡萄樹(shù)根際土壤，各采樣點(diǎn)的取樣深度及園區(qū)概況見(jiàn)表1。葡萄越冬方式均為下架埋土，施肥耕作深度為20～40 cm，采用渠灌方式補(bǔ)水；每個(gè)土樣由同一果園8個(gè)采集點(diǎn)的土壤進(jìn)行混合，取適量裝入土袋中，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室[10]；無(wú)菌條件下將土壤樣品粉碎，過(guò)孔徑為0.284 cm的篩網(wǎng)；四分法留取土樣，4 ℃條件保存?zhèn)溆肹11]。

表1　土樣采集園葡萄栽培和管理基本概況

1.2　土壤微生物總DNA的提取

采用Omega soil DNA kit試劑盒提取13個(gè)土壤樣品中的微生物基因組DNA。

1.3　細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增及測(cè)序

13個(gè)樣本分別用不同的序列標(biāo)簽條碼進(jìn)行區(qū)分，引物添加長(zhǎng)度為8 bp。采用特異性引物為F515：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′、R907：5′-CCGTCAATTCMTTTR AGTTT-3′[12]對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為Q5 DNA聚合酶0.25 μL，5×擴(kuò)增緩沖液5 μL，5×GC緩沖液5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，模板DNA 1 μL，10 μmol/L正向、反向引物各1 μL，水11.25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環(huán)25～27次；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，20 min)檢測(cè)，用美國(guó)產(chǎn)Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段，樣品送上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.4　序列獲取與分析

1.4.1優(yōu)質(zhì)序列的獲取高通量測(cè)序建庫(kù)過(guò)程中PCR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生嵌合體序列，測(cè)序過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生點(diǎn)突變等測(cè)序錯(cuò)誤，故運(yùn)用Qiime 1.9.0軟件進(jìn)行序列過(guò)濾[13]，運(yùn)用mothur 1.31.2軟件中uchime方法去除嵌合體序列[14-15]，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，得到可用于后續(xù)分析的優(yōu)質(zhì)序列。

1.4.2基于操作分類單元(OTU)的分析對(duì)河北省懷來(lái)縣5個(gè)不同土層深度的土樣基于操作分類單元(OTU)進(jìn)行分析，使同一單元序列的相似度≥97%。

1.4.3稀釋性曲線的制作對(duì)河北省懷來(lái)縣5個(gè)不同土層深度、相似度≥97%的土樣細(xì)菌序列，以隨機(jī)抽取的短序列(reads)數(shù)目為橫坐標(biāo)，以該數(shù)目下聚類后得到的OTU數(shù)目為縱坐標(biāo)制作稀釋性曲線，如果reads數(shù)據(jù)增加過(guò)程中曲線趨于平行，則表明隨reads數(shù)目的增加，OTU數(shù)目不會(huì)有較多的增加，此時(shí)已達(dá)到足夠的測(cè)序數(shù)據(jù)量[16]。

1.4.4群落結(jié)構(gòu)分析基于“門”分類單元，對(duì)河北省懷來(lái)縣5個(gè)土層土樣的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，基于“屬”分析其分布和豐度情況；對(duì)甘肅蘭州市等7個(gè)地區(qū)施肥、未施肥土壤的微生物物種數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)果與分析

2.1　優(yōu)質(zhì)序列的獲取

由表2可知，河北省懷來(lái)縣5個(gè)不同土層深度土樣的優(yōu)質(zhì)序列占有效序列[15]的比例在86.98%以上，涵蓋大部分土壤微生物的基因序列。由圖1可見(jiàn)，土樣的優(yōu)質(zhì)序列長(zhǎng)度為225 bp左右。

表2　不同土層深度土樣的序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2　基于操作分類單元(OTU)的分析

由表3可知，隨土層采樣深度的增加，10～70 cm土層微生物種類由多到少依次遞減，0～10 cm近地表土層的微生物種類明顯少于土層10～40 cm的微生物種類，與深度40～50 cm 土層的微生物種類相近，10～30 cm土層的微生物種類相對(duì)最多。由圖2可見(jiàn)，在23 382個(gè)基于“門”分類單元中，有1 384個(gè)是5個(gè)不同深度土層共有的，占5.9%，土樣Hd1、Hd2、Hd3、Hd4、Hd5中各自特有的分類單元分別有41、502、215、74、4個(gè)，這表明不同深度土壤分布的微生物，絕大多數(shù)種類在各層間有差異，不論從哪個(gè)分類水平看，特有種類分類單元主要分布在10～40 cm土層，60 cm下土層的微生物種類數(shù)量急劇減少。

表3　不同土層深度土樣相似度≥97%的分類單元統(tǒng)計(jì)

2.3　稀釋性曲線

高通量測(cè)序所得序列數(shù)量的多少直接決定著不同相似性水平上所能分辨出的系統(tǒng)發(fā)育分類物種數(shù)量的多少[17]。由圖3可見(jiàn)，隨測(cè)得序列數(shù)量的增加，曲線雖趨于平緩，但有微小的上升趨勢(shì)，說(shuō)明Illumina Miseq測(cè)序獲得了樣品中絕大部分細(xì)菌序列，但仍處于不飽和狀態(tài)。分析表明，在97%相似性水平上，5個(gè)不同深度土樣的細(xì)菌序列覆蓋度在86.98%～93.81%之間，更直觀說(shuō)明本研究已獲取絕大多數(shù)的樣本信息，基本能夠比較真實(shí)地反映研究區(qū)的細(xì)菌群落組成情況。

2.4　群落結(jié)構(gòu)分析

由圖4、圖5可見(jiàn)，5個(gè)土樣中，占優(yōu)勢(shì)的物種有9個(gè)門，從多到少依次為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠屈撓菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)，占比分別為34.9%、20.1%、13.6%、8.6%、6.5%、3.7%、2.8%、2.7%、2.5%；芽單胞菌門、綠屈撓菌門在0～10 cm的土層中豐度較高，芽單胞菌門從表層土到深層土豐度逐漸減少；放線菌門、擬桿菌門、綠屈撓菌門在10～30 cm土層中豐度較高，放線菌門中的類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)占菌種的2.1%，擬桿菌門中的噬纖維細(xì)菌科占菌種的2.4%；放線菌門、浮霉菌門、疣微菌門在30～40 cm的土層中豐度較高，而硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、浮霉菌門的豐度向上、下2層逐漸遞減；厚壁菌門在40～50 cm土層中豐度較高；60～70 cm土層的微生物群落中，放線菌門、綠屈撓菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門、疣微菌門比其他土層中的豐度有明顯降低，酸桿菌門、變形菌門則明顯升高，酸桿菌門中的iii1-15菌科成為優(yōu)勢(shì)菌種，占 24.6%，變形菌門中的華桿菌科占12.6%、紅螺菌科占5.2%。

由表4可見(jiàn)，在施農(nóng)家肥條件下，河北省釀酒葡萄赤霞珠2個(gè)土樣Hs1、Hs2在“屬”分類水平上物種數(shù)量具有相似性，而與同樣來(lái)自河北省種植鮮食葡萄馬奶子的土樣Hn在“屬”分類水平上差異相對(duì)較小，表明施用同樣農(nóng)家肥條件下，品種對(duì)微生物物種的數(shù)量影響相對(duì)較??；甘肅土樣Gh、寧夏土樣Nb、山東土樣Sy這3個(gè)土樣的物種數(shù)量差異相對(duì)較大，表明地域?qū)ξ锓N的數(shù)量影響相對(duì)稍大；未施農(nóng)家肥的甘肅土樣Gl、山東土樣Sd、河北土樣Hd1與施農(nóng)家肥的土樣在“屬”分類水平上物種數(shù)量有明顯差異；比較甘肅土樣Gh、Gl與河北土樣Hn、Hd1的物種數(shù)量發(fā)現(xiàn)，農(nóng)家肥的影響比地域影響更為明顯；無(wú)論鮮食葡萄還是釀酒葡萄，在施農(nóng)家肥條件下土壤中的微生物在屬分類水平上具有相似的群落組成，可聚類到一起(圖5)。

3　結(jié)論與討論

從土層10 cm開(kāi)始，隨著土層的加深，葡萄園土壤中細(xì)菌種類呈下降趨勢(shì)，與李艷麗等在梨上的研究結(jié)論[18]一致；0～10 cm土層的細(xì)菌種類明顯較少，與40～50 cm土層的細(xì)菌種類相當(dāng)；10～30 cm的耕作層即葡萄根系分布區(qū)寄居的細(xì)菌種類數(shù)相對(duì)最多，這與欒麗英等的研究結(jié)論[19]相似；地表和50 cm以下非耕作層細(xì)菌數(shù)相對(duì)減少，這與根際分布規(guī)律和地上、地下深層生態(tài)微環(huán)境相對(duì)應(yīng)，可能是地表冬夏溫濕度變化劇烈，紫外線強(qiáng)烈，外界環(huán)境對(duì)細(xì)菌的影響較大，導(dǎo)致表層土的細(xì)菌種類相對(duì)較少，加之通氣良好，生存著好氧菌和抗逆境的細(xì)菌類型或光合菌類，而50 cm以下土層土壤養(yǎng)分貧瘠、缺氧，可能主要分布著厭氧菌和化能自養(yǎng)菌。10～30 cm土層冬夏溫濕度相對(duì)穩(wěn)定，根際有機(jī)物分泌豐富、肥水豐沛，水、肥、氣、熱等因子有利于多種細(xì)菌的繁衍，聚集著大量好氧、厭氧及兼性厭氧菌。

表4　不同地區(qū)土樣物種數(shù)量統(tǒng)計(jì)

袁瑩瑩等研究認(rèn)為，生物有機(jī)肥施用可提高土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，且有益菌群對(duì)土壤微生物有一定的活化作用[20]。胡可等利用Biolog法研究不同施肥處理下土壤微生物功能多樣性表明，生物有機(jī)肥處理更能提高土壤中微生物的活性[21]。蔡燕飛等研究表明，施用生態(tài)有機(jī)肥可以提高土壤微生物多樣性和土壤質(zhì)量，能調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)土壤有益微生物生長(zhǎng)，在保持微生物多樣性與生態(tài)穩(wěn)定性方面起著重要的作用[22]。羅希茜等研究表明，有機(jī)肥有利于提高微生物群落物種數(shù)量、優(yōu)勢(shì)種的優(yōu)勢(shì)度及各物種的豐度[23]，這可能是由于有機(jī)肥的C/N有利于土壤微生物的生長(zhǎng)。本研究中，施用農(nóng)家肥改變了葡萄園土壤微生物的群落組成，提高了細(xì)菌的生物多樣性。

高通量測(cè)序能夠較為全面和準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，而變性梯度凝膠電泳(DGGE)僅能反映有限的優(yōu)勢(shì)微生物類群，在很大程度上極可能低估土壤微生物的物種組成并高估其豐度[24]。在不同的微生物分類水平上，通過(guò)高通量測(cè)序可檢測(cè)到葡萄園土壤36門102綱141目181科212屬，而這是DGGE技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到的[25]。

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