7種可食藻提取物對食品致病菌的抑菌效果

羅愛國， 馮　佳， 胡變芳， 呂俊平， 劉　琪， 謝樹蓮

(1.山西大學生命科學學院，山西太原 030006； 2.山西藥科職業(yè)學院食品工程系，山西太原 030031；3.晉中學院生物科學與技術學院，山西晉中 030619)

隨著世界經濟的高速發(fā)展和人類生活水平的不斷提高，食品安全越來越受到關注。全球食品安全事件的頻發(fā)，給社會和人類造成了重大的安全問題與沉重的經濟負擔。在全球已報道的250多種食源性疾病中，食品致病菌引起的食物中毒事件約占到2/3[1]。同時在各類疾病發(fā)生率中，食源性疾病高居第二位[2]。我國僅在2007年到2013年間就有3 950起食源性疾病事件發(fā)生[3]。食品致病菌已成為食品安全控制必須面對的首要危害。

添加食品防腐劑是食品工業(yè)中解決食源性疾病及減少食品腐敗變質的主要手段之一。然而化學合成防腐劑(如山梨酸、苯甲酸等)的使用，易引起致癌、致畸及食物中毒等問題[3]，使得天然防腐劑的開發(fā)利用受到人們的青睞。一些植物、動物、微生物資源因富含殺菌、抑菌活性物質而被關注，成為食品工業(yè)等研究的熱點[4-9]。

藻類植物是一類具有光合作用、能夠自養(yǎng)的低等生物。由于多變的生活環(huán)境和原始的進化地位，使其擁有許多結構獨特的抑菌活性物質，如藻藍蛋白、巖藻多糖、酚類、酯類、類胡蘿卜素、鹵化物及含硫化合物等[10-11]。自20世紀40年代開始，隨著人們對藻類植物的抗菌活性成分不斷研究，逐步認識到藻類是一類具有抑菌潛力的寶貴天然生物資源。一些研究者將藻類中的天然抗菌成分提取出來，應用于醫(yī)藥抗菌消炎、化妝洗浴用品及食品防腐保鮮等[10-17]，不僅可以較好地起到抗菌功效，同時還能減少對人類健康及環(huán)境的危害，更好地迎合消費者對綠色、安全的需求。另一方面藻類易培養(yǎng)，隨著工業(yè)培養(yǎng)技術的發(fā)展，藻類進行規(guī)模生產已成為現實。因此，藻類作為天然抗菌劑的來源具有廣闊的應用前景。

本研究對7種可食藻的活性成分進行了提取，測定了其水提物和醇提物對7種食品常見致病菌的抑菌圈直徑及最小抑菌濃度(MIC)，以期為天然食品抑菌劑開發(fā)新資源提供參考資料。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1藻類地木耳(Nostoccommune)購于山西省汾陽市迅達土特產品有限責任公司，海白菜(Ulvapertusa)、海帶(Laminariajaponica)、螺旋藻(Spirulinaplatensis)、裙帶菜(Undariapinnatifida)、小球藻(Chlorellavulgaris)、壇紫菜(Porpyrahaitanensis)均購于山東濱州天健生物科技有限公司。藻類材料在室溫下自然干燥15 d，經粉碎后過80目篩，得到藻粉，在4 ℃下貯藏備用。本試驗實施時間為2016年7月至2017年5月。全部試驗過程在山西大學生命科學學院實驗室完成。

1.1.2受試菌種革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC 25923)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus，ATCC 14579)、單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，ATCC 19115)；革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC 25922)、沙門氏菌(Salmonellaenterica，ATCC 13076)；真菌：白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC 10231)、黃曲霉(Aspergillusflavus，ATCC 26949)，均購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2　方法

1.2.1水提物制備及其抑菌液的配制采用反復凍融法提取[18]。稱取10 g藻粉，加入15 mL蒸餾水，置于冰箱中 -15 ℃ 保持30 min，取出后研磨，反復冷凍—研磨3次，加入無菌蒸餾水到200 mL，60 ℃水浴中提取1 h，后在7 500 r/min下離心5 min，收集上清液并真空濃縮至約20 mL，置冷凍干燥器內干燥，得到提取物，加蒸餾水定容到10 mL，制成濃度為1 g/mL的水提物原溶液，在4 ℃保存?zhèn)溆?。以不加藻粉的提取劑經過相同的提取與處理作為對照。

1.2.2醇提物制備及其抑菌液的配制采用回流提取法。取10 g藻粉，加入200 mL 70%的乙醇，在75 ℃溫度下回流提取2 h。醇提物經真空旋轉蒸發(fā)(RE-52AA 型，上海亞榮生化儀器廠)濃縮至浸膏，加70%的乙醇定容到10 mL，制成濃度為1 g/mL的醇提物原溶液，在4 ℃保存?zhèn)溆?。以不加藻粉的提取劑經過相同提取處理過程作為對照。

1.2.3菌懸液的制備(1)菌種活化：將菌種接入到事先備好的斜面試管(15 mm×150 mm)，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)活化(細菌37 ℃ 24 h，真菌28 ℃ 48 h)。(2)菌懸液的配制：在無菌條件下，勾一環(huán)單菌落于50 mL新配制的相應培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)(細菌37 ℃ 24 h，真菌28 ℃ 48 h)，制成菌懸原液。采用10倍稀釋法將菌懸原液稀釋至10-1～10-8倍的菌懸液，選取合適濃度的菌懸液涂平板，通過平板菌落計數法確定菌懸液濃度，并配制濃度為1×106CFU/mL的菌懸液備用。

1.2.4抑菌試驗采用瓊脂孔注入法[19]。取20 mL滅菌的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿制成平板，冷卻10 min，吸取0.1 mL菌懸液均勻涂布于平皿表面，靜置10 min，用直徑為6 mm打孔器在平板表面打孔，每板3個孔(1個對照，2個平行處理)，分別加入80 μL無菌水或濃度為1.0 mg/mL藻提取液，將平皿置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細菌在37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌在28 ℃培養(yǎng)48 h后，采用直字交叉法測定抑菌圈直徑，取平均值為作抑菌圈直徑。試驗在不同時間重復3次。

1.2.5藻類提取物最低抑菌濃度(MIC)的測定MIC的測定采用微量肉湯稀釋法[20]。先在96孔細胞培養(yǎng)板加入 100 μL 滅菌的肉湯培養(yǎng)基，在第一列加入100 μL濃度為 0.4 g/mL 藻提取液，通過二倍稀釋法稀釋到第七列，從第七列棄去100 μL，再在每孔中加入100 μL菌懸液(106CFU/mL)，使抑菌液最終濃度為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg/mL。第八列不加藻提取液和菌液，作空白對照，第九列為將藻提取液用相應的溶劑替代，作陰性對照，同時每列的下一行用滅菌的生理鹽水替代菌液作為相應的吸光度校正組。將培養(yǎng)板置于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)(細菌為37 ℃培養(yǎng)12 h，真菌為28 ℃培養(yǎng)24 h)，后用肉眼觀察各孔內澄清無菌生長，則為最低抑菌濃度，并在波長為595 nm處測定吸光度，當相鄰兩孔菌液的吸光度差異極顯著(P<0.01)時，確定為MIC濃度(mg/mL)。試驗重復3次。

2　結果與討論

2.1　藻類水提物的抑菌效果

7種可食藻的水提物對常見食品致病菌的抑菌效果見表1。與對照組相比，螺旋藻水提物均表現出顯著的抑制作用(P<0.05)，其抑菌性具有一定的廣譜性，小球藻、海帶及海白菜對3種革蘭氏陽性菌(S.aureus、B.cereus和L.monocytogenes)和2種革蘭氏陰性菌(E.coli和S.enterica)均有抑制作用(P<0.05)，但地木耳、裙帶菜及壇紫菜的水提物對7種致病菌均無抑制作用(P>0.05)。對金黃色葡萄球菌(S.aureus)，4種藻的水提物具有顯著抑制作用(P<0.05)，其抑菌活性順序依次為螺旋藻>海白菜>海帶>小球藻，其中螺旋藻作用最強，抑菌圈直徑為13.83 mm。對蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)，4種藻的水提物具有顯著抑菌作用(P<0.05)，其抑菌能力強弱依次為小球藻>螺旋藻>海白菜>海帶，其中小球藻活性最強，抑菌圈直徑為18.35 mm。對于單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)，4種藻的水提物具有顯著抑菌作用(P<0.05)，其作用強弱依次為小球藻>螺旋藻>海白菜>海帶，小球藻的作用最強，抑菌圈直徑為9.32 mm。對于大腸桿菌(E.coli)，4種藻的水提物具有顯著抑菌作用(P<0.05)，其作用強弱依次為螺旋藻>小球藻>海帶=海白菜，其中螺旋藻作用最強，抑菌圈直徑為 10.11 mm。對于沙門氏菌(S.enterica)，4種藻的水提物具有顯著抑菌作用(P<0.05)，其活性強弱依次為螺旋藻>小球藻>海帶>海白菜，其中螺旋藻的抑菌圈為9.16 mm。對于白色念珠菌(C.albicans)和黃曲霉(A.flavus)，只有螺旋藻水提物具有顯著作用(P<0.05)，其抑菌圈直徑分別為 6.54 mm 和19.58 mm。

表1　7種可食藻的水提物對食品致病菌的抑菌效果

注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

2.2　藻類醇提物的抑菌效果

7種可食藻的醇提物對常見食品致病菌的抑制效果見表2。與對照組相比，海帶與螺旋藻醇提物表現出顯著的抑制作用(P<0.05)，且對7種致病菌均有一定效果，海白菜對3種革蘭氏陽性菌(S.aureus、B.cereus和L.monocytogenes)、2種革蘭氏陰性菌(E.coli和S.enterica)及真菌黃曲霉(A.flavus)均有抑制作用(P<0.05)，但壇紫菜的醇提物對7種致病菌均無抑制作用(P>0.05)。對于金黃色葡萄球菌(S.aureus)和蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)，除壇紫菜外，其他藻的醇提物均有顯著抑菌作用(P<0.05)，其活性強弱順序分別為螺旋藻>裙帶菜=海白菜>海帶>地木耳>小球藻、螺旋藻=海白菜>海帶>裙帶菜>地木耳=小球藻，其中作用最強的均為螺旋藻，抑菌圈直徑分別為21.03 mm和18.37 mm。對于單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)，3種藻的醇提物具有顯著抑菌作用(P<0.05)，其作用強弱依次為螺旋藻>海帶>海白菜，其中螺旋藻的活性最強，其抑菌圈直徑為 16.45 mm。對于大腸桿菌(E.coli)，4種藻的醇提物具有顯著抑菌作用(P<0.05)，其作用強弱依次為螺旋藻>海帶>海白菜=裙帶菜，其中螺旋藻的作用最強，抑菌圈直徑為 17.63 mm。對于沙門氏菌(S.enterica)，4種藻的提取物具有顯著的抑菌作用(P<0.05)，其活性強弱依次為海白菜>螺旋藻>海帶>小球藻，海白菜的抑菌圈直徑為12.74 mm。對于白色念珠菌(C.albicans)，海帶與螺旋藻的醇提物均有顯著的抑菌作用(P<0.05)，抑菌圈直徑分別為11.23 mm和 10.87 mm。對于黃曲霉(A.flavus)，3種藻的醇提物具有顯著的抑菌作用(P<0.05)，其作用強弱依次為海帶>螺旋藻=海白菜，海帶抑菌圈直徑為11.51 mm。

表2　7種可食藻的醇提取物對食品致病菌的抑菌效果

從7種可食藻的抑菌效果中，發(fā)現螺旋藻和海帶提取物對食品致病菌的抑菌性較強，抑菌譜較廣。有研究報道螺旋藻的甲醇提取物、正丁醇提取物及揮發(fā)性成分等對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及酵母菌有一定的抑制作用[21-23]。螺旋藻含有活性成分藻藍蛋白，占到總蛋白的40%，而提取的藻藍蛋白對S.aureus和E.coli均有抑制作用[24]?；钚远嗵窃诼菪逯姓嫉?.3%[25]，濃度為20 mg/mL的螺旋藻多糖可有效抑制S.aureus、E.coli和Shigelladysenteriae(志賀痢疾桿菌)等[26]。海帶中也含有大量活性成分，如多糖、多酚，具有一定的抑菌作用，其中多糖含量可達8.64%，能有效抑制S.aureus、E.coli、S.enterica和Enterococcusfaecalis(糞腸球菌)生長[27]，海帶多酚也被證實對S.aureus、E.coli、VibrioParahemolyticus(副溶血性弧菌)和SarcinaLutea(藤黃八疊球菌)具有抑制作用[28]。螺旋藻與海帶的提取物所表現出的抑菌作用與其成分中所含的活性物質如藻藍蛋白、多糖、多酚等有關。

2.3　藻類提取物的最小抑菌濃度

根據藻提物的抑菌活性試驗，對一種菌，每種溶劑選取1種抑菌活性較強的藻提物，測定其對相應菌株的最小抑菌濃度(MIC值)。可食藻提取物對3種革蘭氏陽性菌的MIC值見圖1。對于菌株S.aureus，螺旋藻水提物和醇提物的MIC值均為12.5 mg/mL。對于菌株B.cereus，小球藻水提物的MIC值為50 mg/mL，螺旋藻醇提物的MIC值為25 mg/mL。對于菌株L.monocytogenes，小球藻水提取物的MIC值>100 mg/mL，螺旋藻醇提物的MIC值為50 mg/mL?？墒吃逄崛∥飳?種革蘭氏陰性菌的MIC值見圖2。對于菌株E.coli，螺旋藻水提物和醇提物的MIC值均>100 mg/mL。對于菌株S.enterica，螺旋藻水提物和海白菜醇提物的MIC值均>100 mg/mL?？墒吃逄崛∥飳?種真菌的MIC值見圖3。對于菌株C.albicans，螺旋藻水提物和海帶醇提物的MIC值均>100 mg/mL。對于菌株A.flavus，螺旋藻水提物的MIC值為25 mg/mL，海帶醇提物的MIC值>100 mg/mL。

在7種可食藻中，螺旋藻的抑菌活性最強，且對7種食品致病菌均有抑制作用，抑菌譜較廣，其次是海帶，再次是海白菜。從整體結果看，可食藻不論抑菌活性還是MIC值，其醇提物較水提物抑菌作用強，其原因可能有2個，一是醇作為溶劑與水相比，更能夠有效破壞藻細胞，有效溶出活性成分，二是與藻類中抑菌活性成分的溶解性有關，抑菌成分大多是脂溶性的。藻類抑菌活性成分的提取、確定及抑菌機理需要進一步探索，以期最大限度地開發(fā)藻類資源作為抑菌劑。

3　結論

螺旋藻、小球藻、海帶和海白菜的水提物表現出抑菌作用。對金黃色葡萄球菌(S.aureus)，抑菌效果依次為螺旋藻>海白菜>海帶>小球藻，對枯草芽孢桿菌(B.cereus)，為小球藻>螺旋藻>海白菜>海帶，對于單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)，為小球藻>螺旋藻>海白菜>海帶，對于大腸桿菌(E.coli)為螺旋藻>小球藻>海帶=海白菜，對于沙門氏菌(S.enterica)為螺旋藻>小球藻>海帶>海白菜，對于白色念珠菌(C.albicans)和黃曲霉(A.flavus)，只有螺旋藻水提物具有顯著效果(P<0.05)。

螺旋藻、小球藻、地木耳、海帶、海白菜和裙帶菜醇提物表現出抑菌作用。對于S.aureus和B.cereus，除壇紫菜外，其他藻的醇提物抑菌活性強弱順序分別為螺旋藻>裙帶菜=海白菜>海帶>地木耳>小球藻、螺旋藻=海白菜>海帶> 裙帶菜>地木耳=小球藻。對于L.monocytogenes，抑用作用強弱依次為螺旋藻>海帶>海白菜。對于E.coli，抑菌作用強弱依次為螺旋藻>海帶>海白菜=裙帶菜。對于S.enterica，抑菌活性強弱依次為海白菜>螺旋藻>海帶>小球藻。對于C.albicans，海帶和螺旋藻醇提物有顯著抑菌作用(P<0.05)。對于A.flavus，抑菌作用強弱依次為海帶>螺旋藻=海白菜。

對于S.aureus，螺旋藻水提物和醇提物的MIC值均為 12.5 mg/mL。對于B.cereus，小球藻水提物的MIC值為 50 mg/mL，螺旋藻醇提物的MIC值為25 mg/mL。對于L.monocytogenes，小球藻水提取物的MIC值>100 mg/mL，螺旋藻醇提物的MIC值為50 mg/mL。對于E.coli，螺旋藻水提物和醇提物的MIC值均>100 mg/mL。對于S.enterica，螺旋藻水提物和海白菜醇提物的MIC值均>100 mg/mL。對于菌株C.albicans，螺旋藻水提物和海帶醇提物的MIC值均>100 mg/mL。對于A.flavus，螺旋藻水提物的MIC值為 25 mg/mL，海帶醇提物的MIC值>100 mg/mL。

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