李嘉琛，吳華偉，陳曉春，鄧 永，曹明慧，韓 爽，夏業(yè)才

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京 100081)

豬傳染性胃腸炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種高度接觸傳染性腸道疾病[1]。所有年齡豬群均為易感機體，2周齡以內(nèi)仔豬最為易感，被感染機體臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉等癥狀，死亡率高達100%，但5周齡以上仔豬的死亡率較低。1946年Doyle和Hutchings首次在美國報道該病，隨后大多數(shù)國家均報道了該病的發(fā)生[2]。近年來，TGE在我國的發(fā)病率呈上升趨勢，疫區(qū)逐步擴大[3]，甘肅、黑龍江及上海等均有TGEV病例的報道[4-6]，并且臨床樣品中經(jīng)常監(jiān)測到與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)和豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus, PoRV)的混合感染病例，是嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要腹瀉病原之一。對疑似感染豬傳染性胃腸炎的臨床糞便樣品在ST細胞進行傳代培養(yǎng)，成功分離出一株豬傳染性胃腸炎病毒(命名為TGEV NMG株)，并進行了純凈性和特異性檢驗，為開展豬傳染性胃腸炎疫苗和診斷試劑的研究奠定基礎。

1　材　料

1.1病料內(nèi)蒙古地區(qū)某豬場豬腹瀉糞便樣品。

1.2細胞豬睪丸(ST)細胞，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測室保存。

1.3主要試劑DMEM、0.25%胰酶，GIBCO公司；青霉素、鏈霉素、慶大霉素，Solarbio公司；TRIzol Reagent，Invitrogen公司；One-step RT-PCR kit，TAKARA公司；豬傳染性胃腸炎快速抗原檢測試劑盒，BioNote公司；豬傳染性胃腸炎病毒FA試劑，VMRD公司；豬傳染性胃腸炎病毒單陽性血清(中和效價1∶512)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒制品檢測室保存。

1.4引物設計參照TGEV(GenBank No.EU074218)、PEDV(GenBank No.AF353511)和PoRV(GenBank No.JQ343835)序列，分別設計引物特異性擴增TGEV N基因、PEDV M基因和PoRV VP7基因 (表1)，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1　特異性引物序列Tab 1　Primers used for amplifying the target gene

2　方　法

2.1樣品處理將腹瀉仔豬糞便樣品用DMEM培養(yǎng)液2倍稀釋，加入青、鏈霉素(終濃度200 U/mL)和慶大霉素(終濃度100 μg/mL) 于4 ℃過夜，3000 r/min離心20 min后取上清，以0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，置-70 ℃保存。

2.2樣品鑒定

2.2.1膠體金檢測試劑盒檢測采用豬傳染性胃腸炎病毒膠體金抗原檢測試劑盒對糞便樣品進行檢測，操作步驟以及結果判定參照說明書。

2.2.2RT-PCR檢測將處理的糞便樣品用TRIzol試劑進行RNA提取，One-step RT-PCR kit以表1中TGEV、PEDV和PoRV引物進行RT-PCR檢測，反應程序：50 ℃反轉錄30 min；95 ℃預變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共進行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2.3病毒的分離將鑒定為TGEV陽性的病料，按10%的比例接種已長成單層的ST細胞，37 ℃吸附1 h，吸棄接種物，加含10 μg/mL胰酶的DMEM營養(yǎng)液，置37 ℃培養(yǎng)72 h。細胞病變達75%以上時，收獲病毒液。如無細胞病變出現(xiàn)，繼續(xù)盲傳。

2.4TCID50測定將F5～F10代細胞培養(yǎng)物分別進行10倍系列稀釋，接種至長成單層的ST細胞96孔板，每個稀釋度接種8孔，每孔100 μL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，記錄CPE情況，按Reed-Muench法計算病毒TCID50。

2.5純凈性鑒定將TGEV的F5代細胞培養(yǎng)物，按照《中國獸藥典》方法[7]分別進行無菌檢驗、支原體檢驗和外源病毒檢驗。

2.6特異性鑒定

2.6.1病毒中和實驗將F5代細胞培養(yǎng)物用DMEM培養(yǎng)液稀釋成200 TCID50/0.1mL，與等體積的TGEV陽性血清混勻后置37 ℃中和1 h，分別接種至已長成良好單層ST細胞24孔板，同時設置陽性對照和陰性對照。置37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h。

2.6.2直接免疫熒光鑒定將F5代細胞培養(yǎng)物，進行10倍梯度稀釋(10-1～10-8)，接種至長滿單層的ST細胞96孔板，每稀釋度8孔，每孔100 μL，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，棄上清，用80%冷丙酮2～8 ℃固定30 min后，按照VMRD TGE FA試劑說明書進行直接免疫熒光檢測。

2.6.3N基因的克隆與序列分析用表1中TGEV N-F/R引物，對TGEV的F5代細胞培養(yǎng)物進行RT-PCR擴增，并將擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序，然后利用DNAStar軟件與GenBank上參照序列(表2)進行比對分析。

表2　TGEV 參考毒株及序列信息Tab 2　Reference strains of TGEV and their sequence information

3　結果與分析

3.1樣品鑒定采用豬傳染性胃腸炎病毒膠體金抗原檢測試劑盒對糞便樣品進行檢測，結果為陽性，RT-PCR可擴增出1215 bp 目的條帶(圖1A)，與預期大小相符，而PEDV和PRoV未擴增出相應特異性條帶(圖1B和1C)，表明該樣品為僅含有TGEV，無PEDV和PoRV污染。

3.2病毒的分離培養(yǎng)結果將樣品接種ST細胞連續(xù)傳至第10代，結果盲傳至第5代開始均出現(xiàn)細胞圓縮、聚集，并出現(xiàn)脫落、崩解(圖2A)等典型TGEV病變，而細胞對照正常(圖2B)。

3.3TCID50測定F5～F10代TCID50測定結果見表3。隨著傳代次數(shù)增加，病毒滴度逐漸升高，說明該分離毒株已逐步適應ST細胞。

3.4純凈性鑒定結果將F5代細胞培養(yǎng)物，參照《中國獸藥典》方法[7]進行檢驗，結果顯示無菌生長、無支原體且無外源病毒污染。

3.5特異性鑒定結果

3.5.1病毒中和試驗結果圖3結果顯示，病毒對照組出現(xiàn)CPE，病毒中和組和空白對照組細胞均正常，證明分離毒株為TGEV。

3.5.2直接免疫熒光檢測結果將TGEV的F5代細胞培養(yǎng)物進行直接免疫熒光染色，可觀察到TGEV特異性熒光，而ST細胞對照無熒光(圖4)。

3.5.3N基因的克隆與序列分析RT-PCR結果表明，F(xiàn)5代細胞培養(yǎng)物可擴增出1215 bp特異性條帶(圖5)，擴增結果清晰，無雜帶，與預期目的條帶一致。

A.TGEV鑒定結果　　　　　　　 B.PEDV鑒定結果　　　　　　　C.PoRV鑒定結果　M. DNA Marker; 1,4,7. 糞便樣品; 2,5,8. 陰性對照(RNA-free H2O)；3. TGEV陽性對照; 6. PEDV陽性對照; 9. PoRV陽性對照M. DNA Marker; 1,4,7. Feces samples; 2,5,8. Negative control(RNA-free H2O); 3. Positive control of TGEV; 6. Positive control of PEDV; 9. Positive control of PoRV圖1　RT-PCR鑒定結果Fig 1　Identification by RT-PCR

A：接種TGEV 72h；B：ST細胞對照A：72h after inoculated TGEV；B：ST control圖2　分離株TGEV接種ST細胞的CPE(100×)Fig 2　CPE of ST cell after inoculated TGEV(100×)

表3　TGEV-NMG株不同代次的TCID50Tab 3　TCID50 of TGEV-NMG different generations

A：病毒中和組；B：病毒對照組；C：細胞對照組A：Virus neutralization；B：Virus control；C：Cell control圖3　TGEV中和試驗觀察結果(200×)Fig 3　TGEV neutralization test (200×)

M：DNA Marker；1-3：F5代；4：陰性對照M：DNA Marker；1-3：F5；4：Negative control圖5　TGEV NMG株 RT-PCR鑒定結果Fig 5　Identification of TGEV NMG strain by RT-PCR

3.5.4N基因的同源性及進化樹分析使用DNAStar中的MegAlign對TGEV NMG株以及13株TGEV參考毒株的N基因進行了比對分析。結果顯示，NMG株N基因全長1149 bp，與13株參考毒株的同源性在98.1%～100%之間，其中與H16、JS2012、Miller M6同源性最高，達100%(圖6)。TGEV N基因的進化分析表明，NMG與TS、JS2012、H16、attenuated H、Miller M6、Miller M60的親緣關系較近，處于同一分群(圖7)。

圖6　14株TGEV N基因的同源性比較Fig 6　Sequence homology of 14 strains TGEV based on N gene

圖7　14株TGEV N基因序列的進化樹Fig 7　The phylogenetic tree of 14 strains TGEV based on N gene sequences

4　討　論

TGEV的分離較為困難，往往需要選擇較為敏感的細胞(或細胞系)，且需要在培養(yǎng)液中加入胰酶以提高細胞對病毒的敏感性[8]。目前較為常用的細胞為豬腎傳代細胞(PK-15)和豬睪丸傳代細胞(ST)。研究表明，ST細胞對于TGEV初代培養(yǎng)更加敏感[9]。使用ST細胞進行分離培養(yǎng)，且在培養(yǎng)液中添加了終濃度為10 μg/mL的胰酶，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)5代后，出現(xiàn)了較為明顯的細胞病變，且隨著傳代代次的增加，病毒滴度逐漸升高，表明該分離株已逐步適應了ST細胞。但也有研究表明，在TGEV病毒分離時可不添加胰酶，如宋振輝等認為在分離TGEV時添加牛血清有利于病毒的增殖[9]。因此，對于TGEV分離時是否需要添加胰酶，建議在進行分離時可嘗試兩種方法同步進行，以期找到適合分離毒株的最適方法，并節(jié)省時間，提高分離的成功率。

N蛋白為核衣殼蛋白，其在同屬病毒之間同源性較低，但在同種病毒之間具有高度的保守型[10]。TGEV NMG毒株的同源性分析結果印證了此點。從TGEV NMG毒株的同源性比較結果看，該毒株與GenBank中已發(fā)表的13株TGEV N基因的序列同源性為98.1%～100%，且與我國分離的H16、JS2012毒株以及經(jīng)典疫苗毒株Miller M6同源性關高達100%，與近年我國分離的TGEV毒株同源性均在98.1%以上。鑒于N蛋白的保守性，且可在感染的早期就能產(chǎn)生高水平的N蛋白抗體，因此在血清學或病原學的診斷中具有重要意義，這為下一步開展TGE診斷試劑的研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]Jeffrey J, Locke A, Alejandro R,etal. Disease of swine [M]. 10th Edition, 2012：523-525.

[2]Doyle L P, Hutchings L M. A transmissible gastroenteritis in pigs[J]. Journal of the American Veterinary Medical Association, 1946, 108: 257-259.

[3]謝立蘭, 方六榮, 方華為, 等. 免疫學和分子生物學技術在豬傳染性胃腸炎診斷中的應用進展[J]. 中國獸藥雜志, 2016, 50(2): 56-62.

Xie L L, Fang L R, Fang H W,etal. Progress on the application of immunology and molecular biology techniques in diagnosing of transmissible gastroenteritis [J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2016, 50(2): 56-62.

[4]Hu W W, Yu Q H, Zhu L Q,etal. Complete genomic sequence of the coronavirus transmissible gastroenteritis virus SHXB isolated in China[J]. Arch Virol, 2014, 159: 2295-2302.

[5]Hu X L, Li N N, Tian Z G,etal. Molecular characterization and phylogenetic analysis oftransmissible gastroenteritis virus HX strain from China[J]. BMC Veterinary Research, 2015,11:12.

[6]Li J Q，Cheng J, Lan X,etal. Complete genomic sequence of transmissible gastroenteritis virus TS and 3’ end sequence characterization following cell culture[J]. Virologica Sinica, 2010, 25(3): 213-224.

[7]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[S].2010年版三部.

Chinese Committee of Pharmacopoeia for Animal. China Veterinary Pharmacopoeia[S]. 2010, Volume Ⅲ.

[8]Bridger J C. Cell culture techniques for the identification of enteric viruses-present possibilities[M]// Laboratory Diagnosis in Neonatal Calf and Pig Diarrhea. Springer Netherlands, 1981:12-21.

[9]宋振輝, 郭萬柱. 豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及全基因組序列分析[J]. 病毒學報, 2008, 24( 5) : 367.

Song Z H, Guo W Z. Isolation and genomic sequence analysis of porcine transmissible gastroenteritis virus [J]. Chinese Journal of Virology, 2008, 24( 5) : 367.

[10] Hou X L, Yu L Y, Liu J. Development and evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid protein for detection of porcine epidemic diarrhea antibodies[J]. Veterinary Microbiology, 2007, 123(1): 86-92.