張 婧 ，潘 娟，嚴(yán) 鳳，吳劍平，李丹妮

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines，TCs) 是一種廣譜抗菌素，因其抗菌性好、價格低廉，這類藥物常被用于畜禽疾病的預(yù)防和治療。獸醫(yī)臨床上常用的主要有四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、土霉素(OTC)、多西環(huán)素(DOTC)等[1-2]。目前我國僅批準(zhǔn)金霉素和土霉素可以作為飼料添加劑使用，而四環(huán)素和多西環(huán)素不允許作為飼料添加劑使用[3]。但是，一些養(yǎng)殖戶為了追求經(jīng)濟(jì)效益，長期違規(guī)或超標(biāo)使用此類抗生素，造成藥物殘留[4-5]。這不僅會影響獸藥的治病療效，也給食用者的身體健康帶來嚴(yán)重危害[6-7]。我國針對四環(huán)素、金霉素、土霉素三種四環(huán)素類藥物規(guī)定了在禽蛋中的最大殘留限量為200 μg/kg[8]，針對多西環(huán)素規(guī)定了在產(chǎn)蛋雞上禁用，但是，目前我國并沒有發(fā)布雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留檢測方法的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，因此，制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)尤為重要。目前國內(nèi)外有關(guān)檢測雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留的方法大多集中為高效液相色譜法[9-10]。多數(shù)前處理方法較為繁瑣，耗時較長，無法適應(yīng)當(dāng)前快速篩選檢測的要求。由于國內(nèi)大部分檢測機(jī)構(gòu)還缺乏昂貴的串聯(lián)質(zhì)譜儀，因此，使得已有報道的HPLC-MS/MS檢測方法[11-12]的應(yīng)用在大多數(shù)基層實驗室內(nèi)難以推廣。本文結(jié)合PRiME HLB快速通過式的前處理方式，開發(fā)了雞蛋中4種四環(huán)素類藥物的高效液相快速篩選檢測的方法。該方法步驟簡單、檢測快速，能夠靈敏地篩選并檢測雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留，以期為雞蛋中四環(huán)素類藥物的標(biāo)準(zhǔn)制修訂提供參考和依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑Waters高效液相色譜儀(Waters e2695-2998，Empower 3工作軟件)；PRiME HLB固相萃取柱(Waters Oasis，3cc/60mg)；PL202-L感量為0.01 g電子天平、pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；AB135-S感量為0.00001 g電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)； 漩渦混合器(美國Talboys公司)；TARGIN VX-Ш多管渦旋振蕩器(北京踏棉科技有限公司)。Allegra TMX-22R Centrifuge高速冷凍離心機(jī)(美國BECKMAN COULTER公司)；N-EVAP112氮吹儀(美國Orangaomation公司)；Milli-QA10 超純水機(jī)(美國Millipore)；0.22 μm親水PTFE過濾膜(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；乙二胺四乙酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鹽酸、氫氧化鈉(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；三氟乙酸(色譜純，99.5%，美國Tedia公司)。標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸金霉素(純度94.1%)、鹽酸土霉素(純度88.8%)、鹽酸四環(huán)素(純度97.5%)、鹽酸多西環(huán)素(純度85.2%)均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2藥品和試劑的配制標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別精密稱取鹽酸金霉素、鹽酸土霉素、鹽酸四環(huán)素、鹽酸多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容至10 mL，配制成濃度為1 mg/mL的土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：分別準(zhǔn)確量取金霉素、土霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為10 μg/mL的土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

混合標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制：精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用流動相稀釋，制得土霉素、四環(huán)素、金霉素和多西環(huán)素濃度為50、100、200、400、1000、2000、5000 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)的制備：取21.01 g檸檬酸用水定容至1000 mL，制成0.1 mol/mL檸檬酸溶液。取71.63 g磷酸氫二鈉定容至1000 mL制成0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液。將1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液和625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液混勻，用鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)pH至4.0，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的制備：將乙二胺四乙酸鈉60.5 g加入至1625 mL Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)中，超聲溶解，混勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3色譜條件色譜柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為50 μL，流速1 mL /min，檢測波長為350 nm，0.01 mol/L三氟乙酸溶液-乙腈(75:25，V/V)作為流動相。

1.4樣品前處理取均質(zhì)雞蛋樣品2 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，精密加入Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液3 mL，渦旋1 min，精密加入乙腈溶液7 mL，充分振蕩10 min，9000 r/min離心5 min。精密量取上清液4 mL過PRiME HLB固相萃取柱，收集濾液于40 ℃下氮氣吹干。用1 mL流動相復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，高效液相色譜法測定。

2　結(jié)果與分析

2.1線性范圍四環(huán)素、金霉素、土霉素和多西環(huán)素的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用流動相配制，各出峰時間如圖1所示，四種藥物的線性范圍為50～5000 ng/mL，線性回歸情況如表1。

圖1　四環(huán)素類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖(400 ng/mL)Fig 1　Chromatogram of the mixed Tetracycline standards (400 ng/mL)

表1　四環(huán)素類藥物的線性回歸情況Tab 1　Linear regression of tetracyclines

2.2回收率與精密度實驗采用空白雞蛋，分別添加四環(huán)素、金霉素、土霉素、多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，制成含4種四環(huán)素類藥物濃度為100、200、400 μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)試樣，進(jìn)行回收率實驗?？瞻纂u蛋基質(zhì)色譜圖如圖2所示。每個批次同一添加水平做6次平行實驗，重復(fù)3個批次，測定結(jié)果見表2。由實驗結(jié)果可知，雞蛋中四環(huán)素的回收率達(dá)59.4%～80.5%，金霉素的回收率達(dá)42.6%～63.3%，土霉素的回收率達(dá)37.1%～66.7%，多西環(huán)素的回收率達(dá)80.6%～94.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<30%，表明該方法滿足快速篩選的分析要求[13]。

2.3檢測限和定量限本方法以信噪比S/N≥3確定雞蛋中4種四環(huán)素類藥物的最低檢測限為50 μg/kg，以S/N≥10確定雞蛋中4種四環(huán)素類藥物的定量限為100 μg/kg。

圖2　空白雞蛋基質(zhì)色譜圖Fig 2　Chromatogram of the blank matrix

表2　雞蛋中添加四環(huán)素類藥物回收率實驗結(jié)果Tab 2　Tetracyclines results of recovery test in egg

3　討論與小結(jié)

3.1提取液的選擇根據(jù)四環(huán)素類藥物的理化特性和相關(guān)文獻(xiàn)報道[14]，此類藥物大都含有堿性的氨基和酸性的酚羥基和烯醇基，為酸堿兩性化合物，在酸性溶液(pH<7)、中性或堿性溶液(pH>7)中易與金屬離子、蛋白質(zhì)絡(luò)合，一般在弱酸溶液中較穩(wěn)定。目前國內(nèi)外提取方法大多以弱酸性的含有金屬絡(luò)合劑的Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液(pH 4.0)提取禽蛋中四環(huán)素類藥物，提取效果滿意[11-12,14]。已有報道的提取液還有0.1%甲酸乙腈[15]、5%高氯酸溶液[16]的混合液等。通過比較發(fā)現(xiàn)，Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液(pH4.0)作為提取劑時回收率最高，0.1%甲酸乙腈混合液提取時回收率結(jié)果較低。5%高氯酸溶液提取時回收率較高，同時因凈化效果好可直接取上清液上機(jī)檢測，因此提取過程耗時短，但是，高氯酸溶液的強(qiáng)腐蝕性易腐蝕色譜柱，不適合長期大量的實際檢測?；诖?，本實驗提取液選用Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液(pH 4.0)。此外，由于需要沉淀雞蛋中含量較高的蛋白質(zhì)，并且PRiME HLB固相萃取柱要求備用液中含有高比例有機(jī)相，所以，提取液最終選擇Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液(pH 4.0)和乙腈溶液。

本實驗還優(yōu)化了Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液(pH 4.0)和乙腈溶液的體積比(添加含量為500 μg/kg)，分別為40∶60(V/V)，30∶70(V/V)，20∶80(V/V)，10∶90(V/V)。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)二者比例為30∶70(V/V)時，凈化效果最好，回收率最高(表3)，并且含高比例有機(jī)相的備用液過柱速度及濃縮速度較快，因此，二者比例選為30∶70(V/V)。由于Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液和乙腈溶液直接混合后易變渾濁，因此，提取時先加入Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液3 mL渦旋1 min，再加入乙腈溶液7 mL振蕩。

3.2凈化方法的選擇目前常用的凈化方法包括了固相萃取、QuEChERS等方法。由于PRiME HLB固相萃取和QuEChERS方法相比，傳統(tǒng)的C18粉和HLB固相萃取的凈化方法簡單且耗時短，可以滿足快速篩選檢測的要求。因此，本實驗比較了PRiME HLB固相萃取和QuEChERS兩種新一代的凈化方法。PRiME HLB固相萃取柱是基于HLB填料進(jìn)行的升級產(chǎn)品，屬于反相保留機(jī)理，對于脂肪、磷脂、色素具有很好的吸附作用，可以有效去除蛋白、鹽、磷脂等95%以上的基質(zhì)干擾物。它是簡單的通過式凈化處理，無需任何活化和平衡，使得樣品凈化過程簡單、快速、有效[17]。QuEChERS技術(shù)具備高通量、快速、成本低的特點，由于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域逐步被引入到獸藥殘留檢測領(lǐng)域[18-19]。結(jié)合雞蛋樣品中含水量較高的特點，QuEChERS方法是加入4 g Na2SO4和1 g NaCl作為除水劑，再加入提取液振蕩離心后取上清4 mL于40 ℃氮氣吹干，1 mL流動相復(fù)溶后上機(jī)測定。結(jié)果表明，PRiME HLB凈化方法的回收率比QuEChERS凈化后的回收率更高，因此，選用PRiME HLB作為凈化手段。

表3　Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液與乙腈不同體積比的提取效率研究Tab 3　Research on different volume ratios of Na2EDTA-Mcllvaine and acetonitrile

本實驗還比較了不同規(guī)格大小的PRiME HLB固相萃取柱的回收率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6cc/150mg和3cc/60mg的規(guī)格凈化后的回收率無明顯差異，因此，選用成本更低3cc/60mg的PRiME HLB固相萃取柱。

3.3基質(zhì)效應(yīng)的考察為考察本方法受雞蛋基質(zhì)效應(yīng)的影響，實驗采用了提取后加入法，用流動相配制了濃度為200、400 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測得響應(yīng)值A(chǔ)；同時將空白樣品經(jīng)實驗步驟1.4項處理后，加入混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成濃度為200、400 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，并測得響應(yīng)值B。通過基質(zhì)效應(yīng)計算公式ME%=響應(yīng)值B/響應(yīng)值A(chǔ)×100%，得該方法中雞蛋基質(zhì)效應(yīng)為85%～107%，故認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)可忽略。

本實驗采用Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液和乙腈溶液的提取方法，結(jié)合新一代的PRiME HLB固相萃取柱凈化方法，在確保目標(biāo)藥物篩選回收率的基礎(chǔ)上，建立了簡單、快速的雞蛋中四環(huán)素類藥物的液相篩選方法。該方法大大簡化了前處理步驟，縮短了前處理時間，提高了檢測效率，更廣泛地適用于大多數(shù)基層實驗室。

參考文獻(xiàn)：

[1]王旭丹，劉 靜，王庚南，等. 高效液相色譜法檢測雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留方法研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2016，43(6)：1579-1584.

Wang X D, Liu J, Wang G N,etal. Residue Detection of Tetracyclines in Eggs by High Performance Liquid Chromatography[J].China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2016, 43(6): 1579-1584.

[2]吳寧鵬，班付國，方忠意，等. 雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留量測定的高效液相色譜法研究[J].中國獸藥雜志，2009，43(8)：9-12.

Wu N P, Ban F G, Fang Z Y,etal. Determination of Tetracyclines Residues in Eggs by HPLC[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2009, 43(8): 9-12.

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第168號.飼料藥物添加劑使用規(guī)范[S].

Announcement of Agriculture Ministry P.R. China, NO. 168, Usage Criterion for Feed Drugs Additives[S].

[4]辜雪冬，陳一資，胡 濱，等. 動物食品中四環(huán)素殘留的研究進(jìn)展[J].肉類研究，2007，3：30-32.

Gu X D, Chen Y Z, Hu B,etal. Study of tetracycline residues in animal food[J]. Meat Research, 2007, 3: 30-32.

[5]李海燕，侯亞莉，郭 平，等. 雞蛋藥物殘留研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，7：92-96.

Li H Y, Hou Y L, Guo P,etal.Study of drug residues in eggs[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2008, 7: 92-96.

[6]楊曉洪，王 娜，葉波平. 畜禽養(yǎng)殖中的抗生素殘留以及耐藥菌和抗性基因研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù)，2014，6：583-588.

Yang X H, Wang N, Ye B P. Research progress of antibiotic residues and resistance bacteria and resistance genes in livestock and poultry breeding[J]. Pharmaceutical Biotechnology, 2014, 6: 583-588.

[7]段留德. 家禽用藥殘留對人體的危害[J].家禽科學(xué)，2014，11：31-32.

Duan L D. The harm of poultry residues on human body[J]. Poultry Science, 2014, 11: 31-32.

[8]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號.動物性食品中獸藥最高殘留限量[S].

Announcement of Agriculture Ministry P.R. China, NO. 235, Veterinary Drug Maximum Residue Limits in the Food of Animal Origin[S].

[9]張銀志, 阮起郡, 孫秀蘭. 高效液相色譜法檢測雞蛋中3種四環(huán)素類抗生素[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36：404- 405.

Zhang Y Z, Ruan Q J, Sun X L. Study on Simultaneous Detection of 3 Tetracyclines Residues in Eggs by High Performance Liquid Chromatography[J]. Journal of Anhui Agri. Sci, 2008, 36: 404- 405.

[10] 閆小峰. 超高效液相色譜法檢測雞蛋中四環(huán)素類藥物殘留方法研究[C]. 第三屆全國獸藥大會-動物藥品分會論文集，2010，61-67.

Yan X F. Determination of Tetracyclies in Eggs by Ultra Performance Liquid Chromatography[C]. China Third Congress of Veterinary Medicine-symposium of the Congress on Animal Medicine, 2010, 61-67.

[11] 李 蕊，郭文欣，金慧然，等. UPLC-MS/MS法檢測禽蛋中四環(huán)素類藥物及其代謝物的殘留量[J]. 中國家禽，2017，39：24-27.

Li R, Guo W X, Jin H R,etal.Determination of Tetracyclines and Its Metabolites in Eggs by UPLC-MS/MS[J]. China Poultry, 2017, 39: 24-27.

[12] 蔣天梅，馮三令，耿士偉，等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中四環(huán)素類藥物的殘留[J].農(nóng)技服務(wù)，2012，29(4)：476-479.

Jiang T M, Feng S L, Geng S W,etal.Determination of tetracycline drugs residue in eggs by Liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Agricultural technology Service, 2012, 29(4): 476-479.

[13] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1896-2010.獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范[S].

Agriculture industry standard of the People's Republic of China, NY/T1896-2010, Criterion on Quality Control of Laboratories of residue analysis of veterinary drugs[S].

[14] 張 鑫，顧 欣，嚴(yán) 鳳，等. 高效液相色譜法檢測畜禽肉中四環(huán)素類藥物殘留的條件優(yōu)化[J]. 化學(xué)分析計量，2010，19：55-57.

Zhang X, Gu X, Yan F,etal. Optimization of conditions for determination of tetracyclines residues in livestock and poultry meat by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2010, 19: 55-57.

[15] 鐘冬蓮，丁 明，湯富彬，等. 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定畜禽糞便中四環(huán)素類抗生素[J].分析科學(xué)學(xué)報，2014，30：433-436.

Zhong D L, Ding M, Tang F B,etal. Determination of tetracycline antibiotics in livestock manure by high performance liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J]. Journal of Analytical Science, 2014, 30: 433-436.

[16] 張 萍，湯 慧，吳 敏，等. HPLC-DAD 方法快速檢測雞蛋中 8 種四環(huán)素類藥物的殘留[C].2014年中國藥學(xué)大會暨第十四屆中國藥師周論文集，2014，2949-2957.

Zhang P, Tang H, Wu M,etal. Rapid determination of eight kinds of Tetracyclines Residue in eggs by HPLC-DAD spectrums[C]. The 2014 Chinese pharmaceutical Congress and the Forteenth Chinese Journal of Pharmacology, 2014, 2949-2957.

[17] 郝 杰，姜 潔，余建龍，等. 固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中多種獸藥殘留[J].食品科學(xué)，2017，38：266-272.

Hao J, Jiang J, Yu J L,etal. Simultaneous Determination of Multi-Veterinary Drug Residues in Animal-Origin Food by Solid Phase Extraction Coupled with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J]. Food Science, 2017, 38: 266-272.

[18] 李丹妮，嚴(yán) 鳳，周悅榕，等.QuEChERS-超高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測豬組織中賽庚啶及可樂定殘留量[J].中國獸藥雜志，2017，51(2)：29-34.

Li D N, Yan F, Zhou Y R,etal. Simulaneous Determination of Cyproheptadine and Clonidine in Pig Issues by QuEChERS and Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry[J]. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2017, 51(2): 29-34.

[19] José Fernando Huertas-Pérez a, Natalia Arroyo-Manzanares a, Lucie Havlíkov,etal. Method optimization and validation for the determination of eight sulfonamides in chicken muscle and eggs by modified QuEChERS and liquid chromatography with fluorescence detection[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2016, 124: 261-266.