清肺益氣方對肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制研究

陳　鑫

(河北省廊坊市人民醫(yī)院，河北 廊坊 065000)

近年來，肺癌的發(fā)病率和病死率呈不斷增高趨勢，且趨向年輕化。研究表明，腫瘤干細(xì)胞或腫瘤起始細(xì)胞(CICs)存在于多種類型的腫瘤組織中，具備表達(dá)胚胎干細(xì)胞的部分生物學(xué)標(biāo)志物，并具有強(qiáng)大的增殖和侵襲能力，可使化療藥物發(fā)生耐藥[1]。由于肺癌細(xì)胞中的CICs可高表達(dá)CD44+和CD133+蛋白[2]，同時(shí)具備較強(qiáng)的化療藥物耐受性。因此，尋找有效抑制肺癌CICs增殖的藥物成為肺癌研究的熱點(diǎn)。清肺益氣方是我院的協(xié)定處方，臨床應(yīng)用于肺癌患者的治療中，可顯著提高肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究以肺癌CICs作為研究模型，探討清肺益氣方對肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞增殖的抑制作用及其可能的作用機(jī)制，旨在為清肺益氣方的臨床治療提供理論依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1細(xì)胞及主要試劑人肺癌細(xì)胞株A549從中國科學(xué)院細(xì)胞庫選購。清肺益氣方免煎顆粒劑主要由人參、黃芪、黃芩(酒炒)、百合、北梗(炒)、貝母、薏苡仁、升麻、甘草等單味中藥免煎顆粒組成，從深圳三九醫(yī)藥股份有限公司選購。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、核糖核酸酶A(RNase A)均從美國Sigma公司選購。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均從美國Sigma公司選購。兔抗人CD44-異硫氰酸熒光素(FITC)抗體、兔抗人CD133-藻紅蛋白(PE)抗體、兔抗人p53抗體、兔抗人Caspase-3抗體及兔抗人GAPDH抗體均從美國Sigma公司選購。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級健康雄性日本大耳白兔6只，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量1.7～2.5 kg。所有動(dòng)物在清潔、采光通風(fēng)良好的動(dòng)物房中，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，自由飲食水，溫度保持在20～26 ℃，環(huán)境濕度保持在(56±2)%。

1.3方法

1.3.1含藥血清的制備將6只大耳白兔隨機(jī)分為清肺益氣方高劑量組及空白對照組，每組3只。每組早晚灌胃給藥1 次，給藥體積為 10 mL/kg，清肺益氣方高劑量相當(dāng)于成人臨床生物等效劑量的10倍；空白對照組給予等體積生理鹽水。連續(xù)用藥3 d后，于末次給藥后2 h處死白兔，進(jìn)行心臟取血，1 500 r/min 離心10 min后留取血清，56 ℃30 min滅活后，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行指標(biāo)檢測時(shí)，將含藥血清溶于無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中進(jìn)行稀釋，確定終濃度后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2肺癌CICs篩選及培養(yǎng)采用含有10%的FBS、100 IU/mL青霉素及100 IU/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基對A549細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在37 ℃，5%CO2孵箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于穩(wěn)定生長狀態(tài)，即處于對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用0.25%胰蛋白酶-EDTA對A549細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，離心后留取細(xì)胞沉淀，分別吸取兔抗人CD44-FITC、CD133-PE抗體各2 μL，在4 ℃條件下與細(xì)胞沉淀進(jìn)行孵育，30 min后PBS清洗并重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107mL-1。取500 μL調(diào)整濃度的細(xì)胞懸液在流式細(xì)胞儀上對細(xì)胞進(jìn)行分選，采用肺癌CICs表達(dá)CD44+/CD133+的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3肺癌細(xì)胞增殖情況檢測采用MTT比色法檢測。將處理后的細(xì)胞接種于密度為2×103/孔的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 ℃、5%CO2條件的孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞生長呈現(xiàn)指數(shù)期時(shí)，將濃度為0，5，10，20，40，60，80，100 μmol/mL的清肺益氣方含藥血清加入至培養(yǎng)板中，空白對照組給予1 mL的PBS作為對照，陰性對照組只加細(xì)胞和培養(yǎng)液而不做其他干預(yù)，均加入20 μL濃度為5 mg/L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心留取上清，DMSO處理后留取沉淀，采用酶標(biāo)儀檢測對應(yīng)OD490值，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，所得的OD取平均值作為最終結(jié)果，并參照文獻(xiàn)方法，計(jì)算出清肺益氣方對肺癌CICs的IC50濃度。計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(%)=(1-觀察組OD值/對照組OD值)×100%。

1.3.4細(xì)胞凋亡情況檢測采用流式細(xì)胞術(shù)檢測。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞并將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105mL-1，設(shè)置空白對照組、陰性對照組和清肺益氣方組，空白對照組細(xì)胞使用1 mL的PBS；陰性對照組只加細(xì)胞和培養(yǎng)液；清肺益氣方組給予1 mL IC50濃度的含藥血清處理。于給藥后培養(yǎng)24 h，1 000 r/min離心5 min，棄去上清留取沉淀，PBS清洗后，給予Annexin V-FITC 5 μL，4 ℃條件下進(jìn)行避光染色，持續(xù)約5 min，加入PI 避光染，持續(xù)15 min后加入緩沖液，調(diào)整至500 μL進(jìn)行過濾，取過濾后的細(xì)胞液進(jìn)行上樣，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算凋亡率。每份標(biāo)本共計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞以上，若為死細(xì)胞則顯示紅色熒光。

1.3.5肺癌增殖相關(guān)基因表達(dá)檢測采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。采用Trizol法抽提1.3.4項(xiàng)中各組細(xì)胞的總RNA并通過逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用Primer Premier 5.0及Oligo6軟件完成Caspase-3、p53及18S rRNA的引物設(shè)計(jì)，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本均進(jìn)行3次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以18S rRNA為內(nèi)參照。引物序列：Caspase-3上游5’- CTGCCTCTTCCCCCATTCT -3’，下游5’-CGCTTCCATGTATGATCTTTG-3’； p53上游5’- GCTTTCCACGACGGTGAC -3’， p53下游5’-GCTCGACGCTAGGATCTGAC-3’； 18S rRNA上游5’- CGTTGATTAAGTCCCTGCCCTT -3’， 18S rRNA下游5’- TCAAGTTCGACCGTCTTCTCAG -3’。反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 預(yù)變性30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相關(guān)基因的相對表達(dá)量。

1.3.6肺癌增殖相關(guān)蛋白表達(dá)檢測采用Western blot法檢測。將處理后的1.3.4項(xiàng)各組細(xì)胞收集后抽提總蛋白，采用BCA法進(jìn)行各組總蛋白濃度的測定，吸取20 μg總蛋白進(jìn)行上樣，經(jīng)過預(yù)處理變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，然后半干電轉(zhuǎn)化法將蛋白轉(zhuǎn)移PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入1∶1 000稀釋后的一抗， 4 ℃孵育過夜，TBST液洗滌，加入HRP標(biāo)記的1∶500稀釋后的二抗，室溫孵育2 h， TBST液洗滌后，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，ChemiDocXRS進(jìn)行曝光，顯影，得到目的條帶后，Image軟件分析各目的條帶的灰度值。

1.3.7VEGF和HIF-1α表達(dá)檢測收集1.3.4項(xiàng)各組處理完成后細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，采用ELISA法檢測各組細(xì)胞VEGF和HIF-1α的表達(dá)水平。

1.3.8肺癌CICs體外侵襲能力檢測各組Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)法檢測1.3.4項(xiàng)各組變化。

2　結(jié)　　果

2.1肺癌CICs體外增殖情況不同濃度清肺益氣方組細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，且隨著含藥血清濃度的增加其抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用逐漸增強(qiáng)，即抑制作用呈濃度依賴性，見表1。根據(jù)公式計(jì)算得到清肺益氣方的IC50為80.12 μmol/mL。以此濃度觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，可見隨著給藥時(shí)間的延長，肺癌細(xì)胞形態(tài)逐漸皺縮變形，壞死脫落。見圖1～5。

表1　清肺益氣方對肺癌CICs體外增殖的抑制作用

注：①與陰性對照組比較，P<0.05。

圖1　空白對照組肺癌細(xì)胞形態(tài)

圖2　陰性對照組肺癌細(xì)胞形態(tài)

2.2細(xì)胞凋亡情況空白對照組細(xì)胞凋亡率為(0.08±0.01)%，陰性對照組細(xì)胞凋亡率為(0.02±0.01)%，清肺益氣方組為(17.22±0.55)%，清肺益氣方組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上可見，清肺益氣方組給藥后，體現(xiàn)活細(xì)胞的左下象限的活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，而體現(xiàn)早期和晚期凋亡細(xì)胞的右下象限及右上象限凋亡細(xì)胞數(shù)目增加。見圖6。

圖3　清肺益氣方作用12 h肺癌細(xì)胞形態(tài)

圖4　清肺益氣方作用24 h肺癌細(xì)胞形態(tài)

圖5　清肺益氣方作用48 h肺癌細(xì)胞形態(tài)

2.3肺癌增殖相關(guān)基因表達(dá)情況清肺益氣方組細(xì)胞中Caspase-3和p53 mRNA表達(dá)水平均顯著高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4肺癌增殖相關(guān)蛋白表達(dá)情況清肺益氣方組細(xì)胞中Caspase-3和p53蛋白表達(dá)水平均顯著高于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3和圖7。

圖6　各組細(xì)胞凋亡情況

組別Caspase-3p53陰性對照組1．02±0．09①0．98±0．06①空白對照組0．95±0．06①1．01±0．22①清肺益氣方組3．79±0．645．09±0．77

注：①與清肺益氣方組比較，P<0.05。

表3　各組肺癌增殖相關(guān)蛋白表達(dá)灰度值比較

注：①與清肺益氣方組比較，P<0.05。

圖7　各組肺癌增殖相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.5肺癌細(xì)胞上清液中VEGF和HIF-1α表達(dá)情況清肺益氣方組細(xì)胞上清液中VEGF和HIF-1α的表達(dá)水平均顯著低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4　各組肺癌細(xì)胞上清液中VEGF和HIF-1α表達(dá)情況

注：①與清肺益氣方組比較，P<0.05。

2.6肺癌CICs的侵襲抑制情況清肺益氣方組侵襲細(xì)胞數(shù)為(25.07±15.06)個(gè)，陰性對照組為(84.09±15.21)個(gè)，空白對照組為(80.33±14.77)個(gè)，清肺益氣方組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對照組和空白對照組(P均<0.05)，而陰性對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3　討　　論

近年來，肺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年增高趨勢，已居于我國城市人口腫瘤發(fā)病率的第1位。在眾多確診的肺癌患者中約80%為非小細(xì)胞肺癌[3]，約60%是存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期肺癌[4]。大多數(shù)患者即使給予積極有效的抗腫瘤治療，5 年生存率仍非常低，大部分患者因腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而死亡。近年傳統(tǒng)中醫(yī)藥在肺癌的治療中顯示出了突出的優(yōu)勢，成為肺癌綜合療法的重要組成部分[5-6]。

傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，晚期肺癌多屬肺腎虧虛、精血不足、癌毒蘊(yùn)結(jié)之證[7]，故動(dòng)則氣喘，腰酸膝軟，食欲不振，治當(dāng)益氣清肺、潤燥止咳[8]。清肺益氣方出自《活人心統(tǒng)》卷下，主治肺痿葉焦，人形憔悴，具有清肺益氣、化痰止咳之效。方中黃芪為主藥，同人參合用，大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺，提高免疫系統(tǒng)功能；黃芩、百合、北梗清肺潤燥、化痰止咳，貝母清肺化痰、散結(jié)消腫，薏苡仁補(bǔ)益肺脾之氣、化濕祛痰，升麻升舉陽氣、解毒宣肺，甘草補(bǔ)益肺氣。該方具有控制肺癌進(jìn)展和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用，可延長患者的生存期，提高機(jī)體免疫功能，有效改善患者憋氣、咳嗽、胸痛等癥狀，配合化療藥物可達(dá)到減毒增效的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，清肺益氣方組的細(xì)胞增殖抑制率顯著高于陰性對照組和空白對照組，提示清肺益氣方對肺癌CICs有顯著的細(xì)胞毒作用，且隨著含藥血清濃度的增加，其抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度依賴性，且在80.12 μmol/mL的劑量下隨著給藥時(shí)間的延長，肺癌細(xì)胞形態(tài)逐漸皺縮變形，壞死脫落。而采用Tran-swell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，清肺益氣方處理組的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對照組和空白對照組，提示清肺益氣方可顯著削弱肺癌CICs在體外基質(zhì)中的遷移與侵襲能力，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與生長。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，清肺益氣方組細(xì)胞凋亡率明顯高于空白對照組及陰性對照組，說明清肺益氣方可有效促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡，抑制腫瘤的生長。

Caspase-3是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制其增殖的重要因子，在死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Caspase-3可通過自身切割而被活化，使下游半胱氨酸蛋白酶激活，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡過程[9]。而p53蛋白是作用較為廣泛的腫瘤抑制因子[10]，可通過負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞生長周期來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡。本研究結(jié)果顯示，清肺益氣方組細(xì)胞中Caspase-3和p53基因和蛋白表達(dá)水平顯著高于陰性對照組和空白對照組，說明清肺益氣方可通過上調(diào)p53和Caspase蛋白的表達(dá)，促進(jìn)肺癌CICs的凋亡，從而達(dá)到抑制肺癌CICs體外增殖的目的。

VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞生成過程中的最重要的細(xì)胞因子，在多種腫瘤的血管生成、腫瘤生長及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[11-12]。有研究顯示，在肺癌患者中VEGF可呈現(xiàn)高表達(dá)，參與了肺癌的病理進(jìn)程，是反應(yīng)肺癌惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良的敏感指標(biāo)[13-14]。HIF-1α是在缺氧應(yīng)激反應(yīng)過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)機(jī)體組織環(huán)境中的氧濃度下降時(shí)，其表達(dá)可顯著增高，在調(diào)控細(xì)胞的生長、糖代謝、氧的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用[15-16]。其可上調(diào)VEGF的mRNA和蛋白水平。有研究證實(shí)，當(dāng)腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，HIF-1α可上調(diào)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤血管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[15，17]。本研究結(jié)果顯示，清肺益氣方組細(xì)胞上清液中VEGF和HIF-1α的表達(dá)水平顯著低于陰性對照組和空白對照組，說明清肺益氣方可能通過抑制VEGF和HIF-1α的表達(dá)，從而抑制腫瘤血管生成，達(dá)到抗腫瘤作用的目的。

綜上所述，清肺益氣方對肺癌CICs具有顯著的抑制作用，其機(jī)制可能通過上調(diào)凋亡抑制基因和蛋白p53和Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)肺癌CICs的凋亡，削弱肺癌CICs的遷移與侵襲能力，并抑制VEGF和HIF-1α的表達(dá)，抑制腫瘤血管的生成等多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗腫瘤增殖的作用。

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