焦　博　 柏　峰　 李艷艷　 路　佳　 張　肖　 曹藝茹　 葛榮朝　 趙寶存

河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 河北石家莊 050024

全球約1/5的灌溉土地是鹽漬化土地。高鹽脅迫下植物細胞質(zhì)中 Na+濃度升高, 體內(nèi)離子失衡, 嚴重影響植物的生長和產(chǎn)量[1]。植物在長期的進化過程中形成了一套耐鹽生理生化機制, 包括通過外排多余Na+或者液泡區(qū)隔化,使 Na+/K+比例穩(wěn)定, 植物體內(nèi)離子趨于平衡, 從而減少鹽脅迫給植物帶來的危害[2-3]; 通過提高抗氧化酶的活性,清除因脅迫產(chǎn)生的有毒的活性氧[4]; 通過增加可溶性溶質(zhì)的濃度, 調(diào)節(jié)滲透壓, 保護細胞膜和酶類, 緩解鹽脅迫造成的危害[5-6]。這些代謝過程的完成依賴于細胞產(chǎn)生的有利于耐逆的植物激素和鹽脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的表達[7]?？梢? 植物受到脅迫時對脅迫應(yīng)答相關(guān)基因的表達調(diào)控是抵抗或耐受周圍環(huán)境的重要環(huán)節(jié)。

轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是植物體內(nèi)重要的基因表達調(diào)控方式, 需要不同順式作用元件和反式作用因子共同參與?；虻谋磉_是受啟動子(promoter)調(diào)控的, 因此, 啟動子克隆及其調(diào)控功能分析是耐逆機制研究的重要內(nèi)容。最早發(fā)現(xiàn)的鹽、旱誘導(dǎo)型啟動子是擬南芥中的rd29A, 該啟動子驅(qū)動DREB1A基因的轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽、耐旱性明顯高于組成型表達的轉(zhuǎn)基因植株[8-9]。Xiao等[10]在大麥幼苗中分析了大麥Lea基因的誘導(dǎo)型啟動子Dhn4s, 該啟動子在干旱脅迫條件下促使外源基因表達量增加, 增強了植物的耐旱性。Guo等[11]發(fā)現(xiàn)CBL1基因的啟動子能夠受低溫、高鹽、洪澇等多種非生物逆境信號的誘導(dǎo), 并且只在維管束中特異表達, 說明CBL1的啟動子是一種誘導(dǎo)型啟動子, 同時還是一種強組織特異型啟動子?？梢? 逆境誘導(dǎo)表達的啟動子與植物對非生物脅迫的耐受性關(guān)系密切。

啟動子克隆和功能研究的首選方法是交錯式熱不對稱PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)和5′端缺失方法。TAIL-PCR是一種基于PCR的染色體步移技術(shù)中的半隨機引物 PCR, 由 Liu和 Whittier[12]于 1995年首創(chuàng), 他們利用這種方法擴增出P1和YAC插入末端序列, 并對其測序。TAIL-PCR是擴增已知序列的旁側(cè)序列的首選方法, 是克隆基因組序列未知的物種的啟動子和鑒定已知序列旁側(cè)序列的有力工具[13]。利用該技術(shù)已克隆了花生CH5B[14]、陸地棉LEA D113[15]、棉花GhRGP1[16]和GhGal1基因[17]的啟動子。Xu等[18]利用該技術(shù)從小麥中成功獲得了外源插入片段在轉(zhuǎn)基因小麥染色體中的旁側(cè)序列。對啟動子序列的表達活性鑒定常用的是5′端缺失方法,該方法可以分析不同片段對啟動子活性的貢獻。Hettiarachchi等[19]利用連續(xù)缺失方法, 檢測了TOP2啟動子在響應(yīng)鹽、脫落酸等逆境信號時發(fā)揮作用的不同DNA區(qū)段。

TaSC是耐鹽小麥品系RH8706-49中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達的基因, 該基因過表達能夠提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[20]。為了從調(diào)控水平分析TaSC基因的耐鹽性, 本研究利用TAIL-PCR結(jié)合電子克隆技術(shù), 從RH8706-49中克隆了TaSC基因ATG上游1419 bp的啟動子序列。通過檢測不同長度啟動子的轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS(β-glucuronidase)基因的表達水平來鑒定其功能, 確定了啟動子中不同區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活活性, 初步研究了全長啟動子在自然條件和脅迫條件下的表達活性。

1　材料與方法

1.1　植物材料與菌株

小麥(Triticum aestivumL.)耐鹽突變體RH8706-49為濮農(nóng)3665/百農(nóng)3039雜交后代F1的花藥經(jīng)組織培養(yǎng)、EMS誘變、耐鹽性反復(fù)篩選得到的, 已穩(wěn)定遺傳18代, 其耐鹽指數(shù)≥1.3[21]。哥倫比亞野生型擬南芥(Col-0)、大腸桿菌(Escherichia coli) DH5α菌株和根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101用于啟動子克隆和轉(zhuǎn)化。這些材料和菌株均由河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)教研室保存。

1.2　小麥基因組DNA的提取及TAIL-PCR

參照CTAB法[22]提取小麥葉片的基因組 DNA, 參照Liu等[23]的方法, 根據(jù)TaSC基因序列設(shè)計 3條基因特異引物(其中SP2與SP3之間的距離162 bp), 分別與簡并引物進行TAIL-PCR, 并將第2輪和第3輪的擴增產(chǎn)物同時進行電泳, 對電泳結(jié)果中第2輪和第3輪的擴增產(chǎn)物的大小差異接近162 bp的條帶進行回收、克隆并測序。各引物序列見表1。

表1　本研究所用引物Table 1　Primers used in this study

1.3　啟動子的克隆

以TAIL-PCR方法獲得的片段為基礎(chǔ), 在http://www.gramene.org/網(wǎng)站進行 BLAST, 得到一條來源于中國春小麥基因組的約1419 bp的基因組邏輯序列, 參考該序列信息, 設(shè)計引物(表1), 以RH8706-49的基因組DNA為模板進行 PCR擴增?；厥諗U增產(chǎn)物并克隆和測序, 將測序正確的克隆命名為 pMD18-T-ProTaSC, 并利用 PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對該DNA序列進行順式作用元件分析。

1.4　啟動子驅(qū)動GUS的表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

為了鑒定啟動子的活性, 根據(jù)啟動子 ProTaSC的序列設(shè)計了 4條上游引物(表 1), 用于擴增不同長度的 5′端漸進缺失的啟動子片段。以pMD18-T-ProTaSC為模板, 分別擴增不同長度的ProTaSC啟動子片段, 經(jīng)克隆、測序后將正確的克隆分別命名為B-1096 bp、C-681 bp、D-343 bp和E-152 bp, 全長序列標記為A-1419 bp (圖1)。將這些啟動子片段與含有GUS的 pCAMBIA1300載體分別進行Hind III和BamH I雙酶切后進行連接, 用不同ProTaSC啟動子片段分別置換載體中的CaMV35S啟動子, 獲得不同的ProTaSC啟動子片段驅(qū)動GUS的雙元報告表達載體。

利用凍融法[24]將上述重組載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101, 再利用浸花法[25]分別轉(zhuǎn)化擬南芥, 篩選陽性苗進行培養(yǎng), 用于啟動子活性分析。

圖1　用于構(gòu)建GUS報告載體的TaSC啟動子的不同長度片段示意圖Fig. 1　Schematic diagrams of 5' deletion fragments of TaSC promoter with different lengths for constructing GUS reporter vectors

1.5　啟動子的活性檢測

將含不同長度 ProTaSC片段的擬南芥分別接種到1/2MS培養(yǎng)基上, 在普通光照培養(yǎng)箱(22℃, 光16 h/暗8 h)中培養(yǎng)。對生長7~9 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進行GUS染色分析, 確定不同長度的啟動子片段的啟動活性。

將上述在1/2MS培養(yǎng)基上生長7~10 d后的轉(zhuǎn)全長啟動子的擬南芥幼苗分為兩部分, 一部分轉(zhuǎn)移到溫室中進行蛭石培養(yǎng), 28 d后取擬南芥的不同組織進行GUS染色分析; 另一部分分別轉(zhuǎn)移到含 200 mmol L–1NaCl或 10 μmol L–1ABA的1/2MS培養(yǎng)基上脅迫處理0、24、36和72 h, 用于定量測定 GUS酶活性[26]。參考 Bradford[27]的方法定量蛋白。

2　結(jié)果與分析

2.1　TaSC啟動子的克隆

以 RH8706-49基因組 DNA (圖 2-A)為模板進行TAIL-PCR表明, 基因特異引物和隨機引物AD4組合的第3輪擴增得到一條322 bp的片段(圖2-B, 箭頭所示)。該序列與第2輪擴增產(chǎn)物的分子量差異接近162 bp, SP3單引物擴增沒有條帶出現(xiàn)(圖 2-B), 符合目的條帶的特征。對該序列克隆、測序后與TaSC基因比對, 得到ATG上游313 bp的序列, 其DNA序列見圖3中藍色斜體所示部分。以這313 bp序列為基礎(chǔ)拼接得到ATG上游1419 bp的邏輯序列, 根據(jù)邏輯序列設(shè)計引物, 擴增RH8706-49基因組DNA, 得到約1400 bp的片段(圖2-C, 箭頭所示), 對其克隆和測序顯示, 該序列長度為 1419 bp, 與邏輯序列的同源性達90%, 命名為ProTaSC。

圖2 TaSC基因啟動子的克隆Fig. 2　Cloning of TaSC promoterA: RH8706-49的基因組DNA; B: TaSC基因啟動子的TAIL-PCR擴增; C: TaSC基因的啟動子擴增; M: DL2000 ladder, 條帶自上而下的分子量依次外 2000、1000、750、500、200 和 100 bp; 1: SP3和AD4的三擴結(jié)果(箭頭所示為目的片段); 2: SP2和AD4的二擴結(jié)果; 3: SP3引物自擴結(jié)果; 4: TaSC啟動子的擴增結(jié)果, 箭頭示啟動子ProTaSC擴增片段。A: electrophoretic pattern of genomic DNA of RH8706-49;B: TAIL-PCR amplification of TaSC promoter; C: amplification of TaSC promoter from RH8706-49; M: DL-2000 DNA ladder in 2000,1000, 750, 500, 200, and 100 bp (from the top to the bottom);1: profile of the tertiary TAIL-PCR amplification with SP3 and AD4( target band shown by the arrow); 2: profile of the secondary TAIL-PCR amplification with SP2 and AD4; 3: the amplification profile with SP3 primer only; 4: Amplification of TaSC promoter ProTaSC (target band shown by the arrow).

2.2　啟動子序列的功能預(yù)測

對ProTaSC分析發(fā)現(xiàn), 序列中含有7個TATA box、13個CAAT box和多個功能順式作用元件(圖3)。不同順式作用元件的序列、功能及其在啟動子區(qū)的分布情況見表2。ProTaSC中包含非生物脅迫響應(yīng)元件 ABRE和 MBS各 1個, 分別是 ABA應(yīng)答元件(序列為 CACGTG, 位于-212位至-207位核苷酸區(qū)間)和MYB蛋白結(jié)合位點(序列為CAACTG, 位于-960位至-955位核苷酸區(qū)間)。

2.3　TaSC啟動子的啟動活性分析

對 ProTaSC啟動子及其不同 5'末端缺失片段驅(qū)動GUS的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進行GUS染色, 結(jié)果顯示全長序列(1419 bp)具有啟動功能, 而且在幼苗的根、莖、葉中均有表達(圖4-A); 5′末端部分缺失的1096 bp 片段和681 bp片段也具有啟動活性, 但啟動活性較全長序列弱, 而且僅在葉片中檢測到表達(圖4-B, C); 轉(zhuǎn)≤343 bp啟動子片段的擬南芥沒有GUS顯色反應(yīng)(圖4-D, E)。上述結(jié)果表明, ProTaSC的基本啟動活性中心位于起始密碼子ATG上游-681至-343位核苷酸區(qū)間, 然而該區(qū)間僅具有較弱的啟動功能, 表達量增強還需要-681位核苷酸上游的序列,在根中表達則需要-1096位核苷酸上游的序列。

圖3　小麥耐鹽突變體RH8706-49的TaSC啟動子的DNA序列Fig. 3　DNA Sequences of TaSC promoter in salt-tolerant wheat mutant RH8706-49藍色斜體字母表示TAIL-PCR的擴增結(jié)果; 下畫虛線表示TATA盒; 下畫實線表示CAAT盒; 陰影表示其他功能順式作用元件, 元件名稱備注在序列下方, 其中ABRE元件(CACGTG )和MBS元件(CAACTG)與高鹽等逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)。The amplification fragment of TAIL-PCR is shown by blue italic letters. TATA box and CAAT box are underlined with dotted and solid lines respectively. Shadow shows other functional cis-acting elements whose name remarks under the sequence. Among them, ABRE element(CACGTG) and MBS element (CAACTG) are related to stress response.

表2　啟動子ProTaSC序列中的順式作用元件及功能Table 2　The cis-acting elements and their functions in the promoter ProTaSC sequence

圖4 轉(zhuǎn)不同長度ProTaSC片段的擬南芥GUS組織化學(xué)染色結(jié)果Fig. 4 GUS assay results of transgenic Arabidopsis harboring different lengths of ProTaSC promotor fragmentsA: 轉(zhuǎn)1419 bp啟動子; B: 轉(zhuǎn)1096 bp片段啟動子; C: 轉(zhuǎn)681 bp片段啟動子; D: 轉(zhuǎn)343 bp片段啟動子; E: 轉(zhuǎn)152 bp片段啟動子。A: transferred with the 1419 bp promotor; B: transferred with the 1096 bp promotor fragment; C: transferred with the 681 bp promotor fragment; D: transferred with the 343 bp promotor fragment; E: transferred with the 152 bp promotor fragment.

2.4　TaSC啟動子的組織表達特異性

在轉(zhuǎn)全長 ProTaSC的擬南芥中, 主要在根(圖 5-A)、葉片(圖5-B, C)、花藥和萼片(圖5-D, E)及成熟果莢殼(圖5-F)中檢測到GUS表達, 且以根尖(圖5-A)和葉脈(圖5-B,C)中表達量較高, 但在主莖、花瓣、幼果和種子中沒有檢測到?？梢? 該啟動子有明顯的組織表達特異性。

2.5　ProTaSC啟動子受鹽和ABA誘導(dǎo)表達

對 NaCl和 ABA分別處理不同時間的轉(zhuǎn)全長ProTaSC擬南芥進行GUS酶活定量檢測表明, 相對于0 h對照, NaCl處理24 h時GUS表達量上升近1倍, 表達量隨后下降至初始水平, 在脅迫 72 h時表達量增長至 620 pmol 4-MU mg–1protein·min–1, 是對照的 3 倍以上(圖6); ABA處理24 h時GUS表達量上調(diào)很明顯, 至36 h 時表達量達到 466 pmol 4-MU mg–1protein min–1,到 72h時表達量下降至接近初始水平(圖 6)?？梢?ProTaSC啟動子的表達活性受NaCl和ABA誘導(dǎo), 但是響應(yīng)時間不同。

圖5　轉(zhuǎn)全長啟動子ProTaSC擬南芥不同組織的GUS染色結(jié)果Fig. 5　GUS assay results of different tissues of Arabidopsis harboring full-length promoter ProTaSCA: 根; B: 莖上葉; C: 蓮座葉; D: 花、幼嫩果莢和莖; E: 盛開的花; F: 成熟的角果。A: root; B: stem leaf; C: rosette leaf; D: floral, young pot and stem; E: blooming flower; F: mature pod.

圖6　不同脅迫條件下轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS定量分析Fig. 6　Quantification of GUS activity in transgenic Arabidopsis under different stresses**和 ***分別表示脅迫處理與對照(0 h)在0.01和0.001概率水平的差異顯著性(t檢驗)。** and *** indicate significant between the stress treatment and the control (0 h) at the 0.01 and 0.001 probability level, respectively(t-test).

3　討論

啟動子是調(diào)控基因表達的順式作用元件, 提供特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以調(diào)控基因的表達, 是決定基因的表達特異性的重要元件。因此, 啟動子特性與基因功能密切相關(guān)。例如, 脅迫誘導(dǎo)型啟動子可以在脅迫條件下通過提高基因的表達量來增強植物的耐逆性。擬南芥rd29A啟動子受低溫、干旱、ABA和高鹽等誘導(dǎo), 遭受脅迫時顯著上調(diào)其下游基因的表達, 提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐逆性[28];rd29A驅(qū)動GmDREB3的轉(zhuǎn)基因擬南芥比CaMV 35S驅(qū)動GmDREB3的轉(zhuǎn)基因擬南芥有更強的耐逆性[29]。Nakashima等[30]發(fā)現(xiàn), LIP9是受高鹽等非生物脅迫誘導(dǎo)的啟動子, LIP9驅(qū)動OsNAC6轉(zhuǎn)基因水稻不僅耐旱性得到提高, 而且對產(chǎn)量沒有負面影響。Jeong等[31]報道, 在根特異表達啟動子RCc3的調(diào)控下, 水稻耐逆相關(guān)基因OsNAC10顯著增強了轉(zhuǎn)基因水稻對干旱、高鹽和低溫的耐受性, 改善了轉(zhuǎn)基因水稻在干旱條件下的田間農(nóng)藝性狀, 其田間產(chǎn)量增加25%~42%。檢測發(fā)現(xiàn), RCc3:OsNAC10轉(zhuǎn)基因植株的根部直徑是組成型過表達植株的 1.25倍, 推測增粗的根系有利于植株吸收水分和養(yǎng)料, 從而提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性和干旱條件下的產(chǎn)量?？梢? 啟動子類型與轉(zhuǎn)基因植物的脅迫條件下的生長密切相關(guān), 而脅迫誘導(dǎo)表達型啟動子有利于改善植物耐逆性及提高產(chǎn)量。

小麥鹽誘導(dǎo)基因TaSC具有耐鹽功能, 受鹽誘導(dǎo)上調(diào)表達[20]。本研究利用TAIL-PCR和電子克隆的方法, 從耐鹽小麥RH8706-49基因組DNA中克隆到TaSC的ATG上游1419 bp的啟動子序列, 命名為ProTaSC (圖2-C, 圖3)。鑒于中國春小麥的基因組序列已經(jīng)公布, 應(yīng)用 phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)查詢到Rh8706-49中的TaSCcDNA連同啟動子ProTaSC序列(命名為 ProTaSC+TaSC)在中國春基因組中的同源序列(命名為 Traes_5DL_50BA3A)。對二者的比對分析表明, ProT-aSC+TaSC序列與中國春基因組中的4266 bp的連續(xù)序列能夠匹配, 其中啟動子區(qū)域的同源性達到 91.16%; 二者外顯子部分的序列同源性達到 95.14%, 其中的編碼框(coding sequence, CDS)序列的同源性達到97.65% (附圖1),說明Traes_5DL_50BA3A與ProTaSC+TaSC的確是同源序列, 進一步證明了ProTaSC啟動子序列與TaSC基因是連鎖的。比對結(jié)果還表明, ProTaSC與中國春的序列存在一定差異, 有其序列特異性, 值得進一步研究其表達調(diào)控功能。

利用 5'末端逐漸缺失實驗對 ProTaSC進行表達活性分析表明, ProTaSC的全長序列具有啟動功能和組織表達特異性, 基本啟動活性中心位于起始密碼子 ATG上游–681位到–343位核苷酸區(qū)間內(nèi)(圖4和圖5)。該啟動子中包含2個非生物脅迫響應(yīng)元件——ABRE和MBS, 分別是與ABA和MYB蛋白相關(guān)的順式作用元件。ABA和MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控植物的多種耐鹽、耐旱過程[32-34],推測ProTaSC啟動子具有非生物脅迫應(yīng)答功能。本研究發(fā)現(xiàn)在鹽和ABA處理的不同時間點, GUS表達量均有顯著上調(diào)(圖6), 表明ProTaSC是受NaCl和ABA顯著誘導(dǎo)表達的功能序列。本研究結(jié)果為深入解析TaSC基因調(diào)控小麥耐鹽性機制提供了依據(jù)。

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附圖1　耐鹽小麥RH8706-49中ProTaSC+TaSC序列與中國春(Triticum aestivum L.)基因組序列的比對Supplementary Fig. 1　Alignment of ProTaSC+TaSC sequence from salt-tolerant wheat RH8706-49 and genomic DNA sequence from Chinese spring (Triticum aestivum L.)ProTaSC+TaSC: 小麥RH8706-49中TaSC基因的cDNA序列(557 bp)及其啟動子(1419 bp), 紅色線條標注TaSC的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA); Traes_5DL_50BA3A: 中國春的4266 bp的基因組DNA序列, 其中含內(nèi)含子2290 bp。ProTaSC+TaSC: the cDNA sequence (557 bp) and its promoter sequence (1419 bp) of TaSC gene in RH8706-49. Red bars show the start(ATG) and stop codon (TAA) of TaSC. Traes_5DL_50BA3A: the 4266 bp contiguous genomic DNA sequence of Chinese spring, containing 2290 bp of introns.