朱展望　 徐登安　 程順和　 高春?！?夏先春　 郝元峰,*何中虎,4

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京100081; 2 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所, 湖北武漢430064; 3 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 江蘇揚州225007; 4 國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)中國辦事處, 北京100081

由禾谷鐮刀菌等引起的小麥赤霉病(Fusariumhead blight, FHB)是一種廣泛流行的真菌病害, 嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。我國長江中下游和東北麥區(qū)一直是其常發(fā)和重發(fā)區(qū)域[3]。近年來, 受氣候變化、小麥–玉米輪作制度下秸稈還田等影響, 赤霉病已成為黃淮麥區(qū)的常發(fā)病害。目前我國小麥赤霉病年均發(fā)生面積超過533.3萬公頃[4], 其中2012、2015和2016年尤為嚴(yán)重。江蘇省2012—2015年均發(fā)生面積約 120萬公頃, 超過該省小麥種植面積的50%[5]; 河南省 2012年發(fā)生最為嚴(yán)重, 發(fā)病面積達(dá)339.7萬公頃, 2016年次之, 為174.0萬公頃[6]。感病籽粒含真菌毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON), 不僅危害人畜健康, 還嚴(yán)重影響食用和飼用價值[7]。

培育抗病品種是降低赤霉病危害的經(jīng)濟(jì)有效手段。國內(nèi)外對赤霉病抗性遺傳進(jìn)行了大量研究,已定位約100個抗赤霉病QTL, 分布在小麥所有染色體[8], 其中抗病基因Fhb1~Fhb7已被正式命名[9-16],以位于3B染色體短臂的Fhb1抗性最強(qiáng), 且穩(wěn)定[8,17-18]。雖然在不同遺傳背景下,Fhb1的效應(yīng)有一定差異,但高病害壓力下仍可平均降低赤霉病嚴(yán)重度 20%左右[18]。該基因還可將DON轉(zhuǎn)化為低毒的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(DON-3G), 減輕毒素危害[19]。

Fhb1在赤霉病重發(fā)的北美春麥區(qū)已得到較為廣泛應(yīng)用, 如美國北達(dá)科他州立大學(xué)利用蘇麥 3號育成抗赤霉病硬紅春小麥品種 Alsen, 年推廣面積為95萬公頃, 占該州小麥種植面積的1/3左右, 標(biāo)記檢測其攜帶Fhb1[20]; 明尼蘇達(dá)大學(xué)利用Fhb1分子標(biāo)記輔助育成了抗赤霉病品種 Sabin[21], 且新近育成的多數(shù)品種(系)含此基因[22]。日本品種Nobeokabouzu Komugi、Nyubai、Shinchunaga 等也含有Fhb1, 其中 Shinchunaga作為赤霉病抗源在日本得到廣泛應(yīng)用[9,23-24]。國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)小麥育種中很少利用Fhb1, 原因是抗稈銹病基因Sr2與Fhb1相斥相緊密連鎖, 且Sr2在育種中必不可少, 但近期利用分子標(biāo)記已育成同時含Sr2和Fhb1的重組材料[25], 這將極大推動Fhb1在CIMMYT小麥育種中的應(yīng)用。

我國利用蘇麥 3號在長江中下游麥區(qū)育成了寧7840和鄂恩1號, 在黃淮麥區(qū)育成了鄭麥9023和西農(nóng)979等品種[26],但由于缺少診斷性標(biāo)記, 即基因特異性標(biāo)記, 除寧7840外, 其他品種是否含F(xiàn)hb1尚不明確。最近, Rawat等[24]克隆了該基因, 并發(fā)現(xiàn)該基因為PFT(pore-forming toxin-like)類型, 全長 3472 bp, 含2個外顯子, 1個內(nèi)含子, 編碼嵌合凝集素蛋白。本研究對229份小麥品種(系)的PFT基因測序,并對部分品種PFT鄰近基因HC(HCBT-like defense response protein)和His(histidine-rich calciumbinding protein)進(jìn)行研究, 開發(fā)了Fhb1基因區(qū)段的診斷性標(biāo)記, 進(jìn)一步利用該標(biāo)記對73份揚麥和寧麥品種(系)檢測, 結(jié)合系譜信息對我國小麥所含F(xiàn)hb1溯源。

1　材料與方法

1.1　材料

用于赤霉病抗性鑒定和PFT基因測序的國內(nèi)外小麥品種(系)共229份, 其中, 國內(nèi)品種218份, 來自13個省市, 包括江蘇34份、湖北17份、安徽3份、四川16份、河南63份、山東26份、陜西21份、河北12份、山西6份、甘肅8份、寧夏5份、北京6份、天津1份, 國外品種11份, 來自CIMMYT (附表1)。這些品種(系)由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供。

西風(fēng)(日本品種, 又名農(nóng)林129)、揚麥6號及73份揚麥和寧麥品種(系)用于標(biāo)記檢測和Fhb1溯源(附表2), 由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供。用于追溯西風(fēng)Fhb1來源的農(nóng)林61、農(nóng)林95、農(nóng)林105、農(nóng)林117等由國家作物種質(zhì)庫提供(http://www.cgris.net/)。

1.2　赤霉病田間接種鑒定

于2014—2016連續(xù)3年在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院南湖試驗田進(jìn)行赤霉病接種鑒定, 病原菌菌株為黃岡1號, 由農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室保存。試驗采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計, 2行區(qū), 行長1 m, 行距0.25 m, 2次重復(fù)。標(biāo)記10個正在開花且形態(tài)基本一致的穗子, 對其噴施病菌分生孢子懸浮液(5×105mL–1); 從抽穗期到調(diào)查結(jié)束, 用微電腦定時彌霧裝置增濕, 促進(jìn)發(fā)病[27-28]。接種后20 d調(diào)查發(fā)病穗數(shù)、每穗小穗數(shù)和病小穗數(shù)。病情指數(shù) = 發(fā)病率 × 嚴(yán)重度[29], 其中發(fā)病率為發(fā)病穗數(shù)與總穗數(shù)的比值, 嚴(yán)重度為每穗病小穗數(shù)與小穗數(shù)比值的平均值, 均以百分率計。

采用QTL IciMapping V 4.1軟件[30]估計229份小麥品種(系)赤霉病病情指數(shù)的方差和廣義遺傳力, 用SAS 9.2軟件比較不同單倍型品種赤霉病病情指數(shù)。

1.3　PFT、HC和His的等位基因鑒定

1.3.1引物設(shè)計利用蘇麥 3號Fhb1區(qū)段(GenBank登錄號為 KX907434)內(nèi)PFT、HC和His的編碼區(qū)序列, 在EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/)比對, 獲取各基因同源序列, 設(shè)計各基因3B染色體特異引物(表1), 并經(jīng)中國春缺體–四體系驗證。由華大基因(北京)合成引物。

1.3.2DNA提取和PCR擴(kuò)增采用CTAB法[31]從幼葉中提取基因組DNA。PCR體系30 μL, 含2×KOD buffer 15 μL, DNA 模板(50 ng μL–1) 3 μL, 上下游引物(10 μmol L–1)各 1.8 μL, dNTPs (2.5 mmol L–1)6 μL, KOD FX (TOYOBO)高保真性酶 0.6 μL, ddH2O 1.8 μL。擴(kuò)增程序為 94°C預(yù)變性 3 min; 98°C變性10 s, 相應(yīng)溫度下退火30 s, 68°C延伸2 min 30 s, 共35個循環(huán); 最后68°C延伸7 min, 4°C保存。

表1　用于擴(kuò)增PFT、HC和His基因開放閱讀框的特異引物Table 1　Specific primers used to amplify the open reading frames (ORF) of PFT, His, and HC

1.3.3擴(kuò)增產(chǎn)物檢測與回收測序用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產(chǎn)物, 溴化乙錠(ethidium bromide, EB)染色, 紫外光下成像。凝膠回收 DNA,連接載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞并培養(yǎng), 從每個連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)挑取12個單克隆, 擴(kuò)大培養(yǎng)后由華大基因(北京)測序, 或?qū)⒛繕?biāo) DNA片段回收直接測序。采用Geneious 10.0.7軟件(http://www.geneious.com/)進(jìn)行序列分析。

1.4　PFT和His基因標(biāo)記開發(fā)

用引物PFT-1F和PFT-2R (表1)對PFT基因第1外顯子和內(nèi)含子區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增, PCR體系20 μL, 含2× PCR Mix (0.1 U μL–1Taq酶、500 μmol L–1dNTPs、20 mmol L–1Tri-HCl、10 mmol L–1KCl、3 mmol L–1MgCl2) 10 μL, DNA 模板(50 ng μL–1) 2 μL, 上下游引物(10 μmol L–1)各 0.5 μL, ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序為95°C預(yù)變性3 min; 94°C變性30 s, 65°C退火30 s,68°C延伸2 min 30 s, 共33個循環(huán); 最后68°C延伸7 min, 4°C保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物, 有擴(kuò)增產(chǎn)物的用限制性核酸內(nèi)切酶DraI (識別序列為 5′-TTT/AAA-3′) 37°C 下過夜酶切。酶切反應(yīng)體系 15 μL, 含 PCR 產(chǎn)物 3 μL, 10× buffer 1.5 μL,DraI 0.8 μL, ddH2O 9.7 μL。用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應(yīng)產(chǎn)物。該 CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences)標(biāo)記可用于檢測PFT基因, 記為PFT-CAPS。

用引物His3B-4 (表1)對His基因進(jìn)行擴(kuò)增, PCR體系同PFT-CAPS標(biāo)記。擴(kuò)增程序為95°C預(yù)變性3 min; 94°C變性 30 s, 65°C退火 30 s, 68°C 延伸 2 min 30 s, 共35個循環(huán); 最后68°C延伸7 min, 4°C保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。該標(biāo)記記為His-InDel。

2　結(jié)果與分析

2.1　表型數(shù)據(jù)方差分析

赤霉病病情指數(shù)在基因型間、年份間以及基因型與年份互作間均呈顯著差異(表2), 其廣義遺傳力為 0.76, 說明本試驗中赤霉病抗性主要受基因型控制, 環(huán)境對其也有一定影響。

表2　229份小麥品種(系)赤霉病病情指數(shù)方差分析Table 2　Analysis of variance (ANOVA) of Fusarium head blight index in 229 wheat cultivars

2.2　PFT的等位基因與特異性標(biāo)記

用引物PFT-1、PFT-2和PFT-3在229份品種(系)中擴(kuò)增和測序, 共發(fā)現(xiàn) 3種等位基因, 分別記為PFT-I(蘇麥 3號類型)、PFT-II(南大 2419類型)和PFT-III(基因缺失類型)。PFT-I和PFT-II的開放閱讀框之間有14個核苷酸差異(圖1), 其中12個位于內(nèi)含子區(qū), 位于第 2128位的 G/A突變可能導(dǎo)致mRNA錯誤剪接, 使基因喪失功能[24]; 2個SNP位于第2外顯子區(qū), 均屬同義突變。

圖1　PFT基因的結(jié)構(gòu)、引物結(jié)合位點及其3種等位基因Fig. 1　Structure, primer binding sites and three alleles of PFT gene

為開發(fā)PFT基因的特異性標(biāo)記, 用 PFT-1F和PFT-2R對PFT基因部分區(qū)段擴(kuò)增, 含PFT-I和PFT-II的品種(系)分別得到2277 bp和2276 bp片段。DraI內(nèi)切酶可在第 1471和第 1472位堿基之間將PFT-II擴(kuò)增產(chǎn)物切割為1567 bp和709 bp兩個片段,而PFT-I擴(kuò)增產(chǎn)物不被酶切(圖 2), 從而可將PFT-I和PFT-II區(qū)分。

綜合測序和PFT-CAPS標(biāo)記檢測結(jié)果表明, 在229份品種(系)中有 24份與蘇麥 3號序列相同, 為PFT-I基因型(表3), 35份為PFT-II基因型, 其余170份為PFT-III基因型(附表 1)。西農(nóng) 9871和小偃 22等高感赤霉病品種也為PFT-I基因型(表 3和圖 2),表明單獨PFT-CAPS不能作為Fhb1的診斷性標(biāo)記。為此, 以含PFT-I的 24份品種(系)為材料, 對PFT相鄰基因HC和His測序, 以期找到可將西農(nóng)9871等感病品種與蘇麥3號區(qū)分的標(biāo)記。

2.3　HC和His的等位基因及Fhb1診斷性標(biāo)記

利用HC3B-3對24份材料所含HC基因擴(kuò)增測序, 發(fā)現(xiàn)除煙2415為HC-II類型外, 其他均為HC-I類型(表3和圖3), 表明HC位點不能將西農(nóng)9871等感病品種與蘇麥3號區(qū)分。

圖2　PFT-CAPS標(biāo)記在部分國內(nèi)品種中的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2　Amplification profiles of marker PFT-CAPS in partial Chinese cultivars M: DL5000 DNA marker; 1~4; PFT-I型品種, 依次是蘇麥3號、寧麥9號、西農(nóng)9871和小偃22; 5~8: PFT-II型品種, 依次是鄭麥366、魯麥21、衡觀35和寧春4號。擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶Dra I酶切。M: DL5000 DNA marker; 1–4: PFT-I cultivars, namely Sumai 3, Ningmai 9, Xinong 9871, and Xiaoyan 22; 5–8: PFT-II cultivars, namely Zhengmai 366, Lumai 21, Hengguan 35, and Ningchun 4. PCR products were digested with Dra I restriction endonuclease.

圖3　PFT-I類型品種所含HC及His基因的結(jié)構(gòu)、引物結(jié)合位點及其等位基因Fig. 3　Structure, primer binding sites, and alleles of HC and His genes for the cultivars with PFT-I

利用His3B-4對上述材料的His基因測序, 發(fā)現(xiàn)3種等位基因, 分別記為His-I(1309 bp)、His-II(2061 bp)和His-III(2061 bp), 其中His-I起始密碼子附近有752 bp整段缺失,His-III較His-II有4個SNP變異(圖3)。蘇麥3號和寧7840等6個品種為His-I型, 西農(nóng)9871和小偃22等17個品種(系)為His-II型,煙2415為His-III型(表3)。His位點能區(qū)分蘇麥3號和西農(nóng)9871等感病品種, 可用于診斷性標(biāo)記開發(fā)。

引物His3B-4為His-InDel標(biāo)記, 其檢測結(jié)果表明, 蘇麥 3號等明確含有Fhb1的品種擴(kuò)增片段為1309 bp; 含PFT-I但推測不含F(xiàn)hb1的品種, 如西農(nóng)9871、小偃22和鄭麥9023等, 其擴(kuò)增片段為2061 bp;不含PFT-I的205個品種, 如揚麥158、濟(jì)麥22和矮抗58等, 其擴(kuò)增片段大小與西農(nóng)9871的相近, 為2000 bp左右, 與蘇麥3號等含F(xiàn)hb1的品種差異明顯(圖4), 其His基因序列有待研究。綜合赤霉病抗性資料及系譜信息,PFT-CAPS和His-InDel相結(jié)合可作為Fhb1的診斷性標(biāo)記,PFT-I/His-I為抗病單倍型。

表3　PFT-I類型品種(系)所含His及HC的等位基因及其赤霉病病情指數(shù)Table 3　Alleles of His and HC genes for the cultivars with PFT-I and their FHB indexes

2.4　PFT與His基因單倍型抗性

將PFT-I記為 PFT(+), 其他等位基因記為PFT(-); 將His-I記為 His(+), 其他等位基因記為His(-)。在 229份品種(系)中, 有 6份為含F(xiàn)hb1的PFT(+)/His(+)類型, 其平均病情指數(shù)為29.9; 18份為PFT(+)/His(-)類型, 其平均病情指數(shù)為 61.8, 與前者差異極顯著(P< 0.001); 有205份為PFT(-)/His(-)類型, 其平均病情指數(shù)為 60.2, 與 PFT(+)/His(-)差異不顯著(P= 0.73); 未發(fā)現(xiàn)PFT(-)/His(+)類型品種(圖 5)。

2.5　我國小麥品種(系) Fhb1鑒定及溯源

利用PFT-CAPS和His-InDel標(biāo)記對73份揚麥和寧麥品種(系)檢測, 發(fā)現(xiàn) 20份含F(xiàn)hb1, 包括揚麥18和揚麥21等17份揚麥品種(系)、寧麥14、寧麥18和寧麥26 (附表2)。加上此前發(fā)現(xiàn)的6份含F(xiàn)hb1的品種, 系譜分析表明, 除蘇麥3號和寧7840 (阿芙樂爾/安徽11//蘇麥3號)外, 其余24份材料均有寧麥9號(揚麥 6號/西風(fēng))血緣, 推測其Fhb1來自寧麥 9號(圖6和附表3)。

對寧麥9號雙親揚麥6號和西風(fēng)的PFT、HC和His基因測序表明, 西風(fēng)的上述基因序列與寧麥9號及蘇麥3號完全一致, 而與揚麥6號有較大差異(結(jié)果未列出), 表明寧麥9號Fhb1來自西風(fēng)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn), 西風(fēng)的雙親農(nóng)林 117和農(nóng)林 105及其祖父母本(農(nóng)林95和農(nóng)林61)均含F(xiàn)hb1, 推測來自日本小麥品種 Shinchunaga[24], 并追溯到日本地方品種(圖6)。這說明寧麥9號Fhb1的確來自日本。

圖4　His-InDel標(biāo)記對國內(nèi)部分品種的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4　Amplification profiles of marker His-InDel in partial Chinese cultivarsM: DL5000 DNA marker; 1~4: His-I型品種, 依次是蘇麥3號、寧7840、寧麥9號和寧麥13; 5~11: 非His-I型品種, 依次是西農(nóng)9871、小偃22、鄭麥9023、煙2415、揚麥158、濟(jì)麥22和矮抗58。M: DL5000 DNA marker; 1–4: His-I cultivars, namely Sumai 3, Ning 7840, Ningmai 9, and Ningmai 13; 5–11: non His-I cultivars, namely Xinong 9871, Xiaoyan 22, Zhengmai 9023, Yan 2415, Yangmai 158, Jimai 22, and Aikang 58.

圖5　不同PFT/His單倍型品種的赤霉病病情指數(shù)Fig. 5　Average FHB indexes of cultivars or lines with differentPFT/His haplotypes誤差線上不同字母表示相應(yīng)不同單倍型的病情指數(shù)差異顯著(P < 0.05)。Different letters above error bars indicate significant FHB indexes among haplotypes at P < 0.05.

3　討論

分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection,MAS)在育種中成功應(yīng)用需具備3個條件, 即標(biāo)記選擇較表型選擇有優(yōu)勢、具診斷性標(biāo)記(基因特異性標(biāo)記)和實用性(低成本、高通量)[32]。黃淮麥區(qū)不具備赤霉病表型鑒定的理想環(huán)境, MAS是培育抗赤霉病品種的首選技術(shù)。Fhb1已被證明是抗性最強(qiáng)且穩(wěn)定的抗赤霉病基因, 目前利用標(biāo)記輔助選擇Fhb1的限制因素是缺乏低成本的診斷性標(biāo)記, 雖其連鎖標(biāo)記Xgwm493、Xgwm533、UMN10和Xsnp3BS-8等在育種中有一定應(yīng)用[33-35], 但均受遺傳背景影響較大[36]。Rawat等[24]證明Fhb1為PFT基因, 本研究發(fā)現(xiàn), 以西農(nóng)9871和小偃22為代表的部分陜西品種含該基因, 但高感赤霉病, 故PFT基因標(biāo)記不能作為Fhb1的診斷性標(biāo)記。對PFT鄰近基因HC和His測序, 發(fā)現(xiàn)His位點的多態(tài)性可有效區(qū)分上述材料, 進(jìn)而開發(fā)出Fhb1診斷性標(biāo)記His-InDel, 該標(biāo)記擴(kuò)增穩(wěn)定、片段差異大、用瓊脂糖凝膠電泳即可檢測, 成本較低, 是理想的育種標(biāo)記。由于PFT和His基因緊密連鎖, 且未見 His(+)/PFT(-)類型品種, 在標(biāo)記輔助選擇Fhb1時僅使用His-InDel即可取得滿意效果,在親本和高代品系鑒定時可使用PFT-CAPS和His-InDel標(biāo)記組合。

Fhb1對赤霉病的抗性主要表現(xiàn)為抗擴(kuò)展, 通常利用單花滴注法接種鑒定。由于效應(yīng)較大, 在田間噴霧接種條件下也可鑒定出該基因, 如 Buerstmayr等[37]用此方法在蘇麥3號衍生系 CM82036中定位到Fhb1, 解釋表型變異29%; Chen等[38]用單花滴注和噴霧接種法在 W14 (太谷核不育輪回選擇育成, 抗源包括蘇麥3號、望水白、寧7840、Shinchunaga等)中均定位到Fhb1, 其中單花滴注法接種條件下其效應(yīng)更大。本研究采用噴霧法接種, 用病情指數(shù)作指標(biāo)分析Fhb1單倍型抗性, 與田間抗性較吻合, 如用單花滴注法接種, 抗感單倍型間赤霉病病情指數(shù)差異預(yù)計會更大。

標(biāo)記檢測結(jié)合系譜信息表明, 我國小麥品種(系)所含F(xiàn)hb1至少有兩類來源。一類來自蘇麥3號, 可追溯到臺灣小麥(地方品種); 長江流域含蘇麥3號血緣的品種有寧7840、湘麥10號(友誼麥/蘇麥3號)、湘麥11 (蘇麥3號/獨稈1042)和鄂恩1號(洛夫林10號/761//蘇麥3號)等, 其中寧7840含F(xiàn)hb1[24]; 湘麥10號和湘麥11是否含F(xiàn)hb1, 有待檢測; 大面積推廣的鄂恩1號經(jīng)檢測不含F(xiàn)hb1。另一類來自寧麥9號,由其傳遞到部分寧麥、揚麥和鎮(zhèn)麥品種中; 經(jīng)檢測寧麥9號Fhb1來自日本小麥西風(fēng), 西風(fēng)由日本九州農(nóng)業(yè)試驗場于1983年育成, 較抗赤霉病[39], 其母本農(nóng)林117中抗赤霉病[40], 父本農(nóng)林105抗性未知, 兩者均有 Shinchunaga血緣, 含F(xiàn)hb1[24], 抗源可追溯到地方品種。據(jù)Yu等聚類分析, Shinchunaga與中國地方品種聚為一類, 而非日本地方品種[41], 推測其與中國種質(zhì)相關(guān); 西風(fēng)在我國表現(xiàn)早熟、抗紋枯病、農(nóng)藝性狀優(yōu)良, 赤霉病抗性與揚麥158相當(dāng), 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用西風(fēng)選育出寧麥 9號[42]。與蘇麥 3號相比, 寧麥9號及其衍生品種如寧麥18、寧麥26、揚麥18、揚麥21、鎮(zhèn)麥5號等的綜合農(nóng)藝性狀已大幅提升[43], 故建議在育種中擴(kuò)大使用; 新選育的一批揚麥高代品系已固定Fhb1基因, 對赤霉病遺傳改良具有重要意義, 也應(yīng)多加利用。鑒于很多國內(nèi)地方品種如望水白、白三月黃[44]、黃方柱[45]、翻山小麥等含F(xiàn)hb1, 且與日本抗赤霉病地方品種相比具有更高的遺傳多樣性[41]。故推測Fhb1均來自地方品種,可能由中國江蘇、浙江或福建等地傳到中國臺灣、韓國及日本, 并在這些地區(qū)的抗赤霉病育種中發(fā)揮了重要作用。

圖6　Fhb1在73份揚麥和寧麥品種(系)中的傳遞路徑Fig. 6　Gene flow of Fhb1 in 73 cultivars (lines) of Yangmai and Ningmai through founder parent Ningmai 9實線框內(nèi)品種(系)經(jīng)PFT-CAPS和His-InDel標(biāo)記檢測含F(xiàn)hb1, 虛線框內(nèi)品種未檢測。Cultivars or lines in solid boxes were characterized carrying Fhb1 using PFT-CAPS and His-InDel markers, while those in dotted boxes were uncharacterized.

Fhb1在美國、日本等春麥區(qū)和我國江蘇省等春性麥區(qū)均得到成功應(yīng)用, 而在冬麥區(qū)進(jìn)展相對緩慢,可能與對株高等農(nóng)藝性狀選擇有關(guān), 也可能是抗赤霉病育種的時間較短所致。20世紀(jì)70年代, 西北農(nóng)林科技大學(xué)率先在黃淮冬麥區(qū)利用蘇麥 3號進(jìn)行抗赤霉病育種, 創(chuàng)制出一批抗病中間材料, 為后來黃淮麥區(qū)選育具有一定赤霉病抗性的品種奠定了基礎(chǔ)。但本研究發(fā)現(xiàn)較多陜西來源品種雖含PFT抗病等位基因(PFT-I),His基因卻為感病類型(His-II), 即不含F(xiàn)hb1, 這可能與育種家對農(nóng)藝性狀的選擇有關(guān),即該區(qū)段的His-I或相鄰基因可能與不利農(nóng)藝性狀連鎖(至少對黃淮麥區(qū)而言);PFT-I可能來自蘇麥 3號(PFT和His間發(fā)生重組)或小偃6號某一早代親本;在赤霉病篩選壓力較小情況下, 育種家首先考慮農(nóng)藝性狀, 導(dǎo)致沒能選擇Fhb1區(qū)段抗病的單倍型。在美國東部軟紅冬麥區(qū), 育種家利用分子標(biāo)記選擇來自蘇麥3號或?qū)?840的Fhb1, 含有該片段的品系由于農(nóng)藝性狀差、產(chǎn)量低, 能通過審定的品種不多(Carl Griffey, 個人交流, 2015; Jerry Johnson, 個人交流, 2015)。因此, 明確Fhb1區(qū)段與不利農(nóng)藝性狀連鎖的基因, 對更好利用Fhb1具有重要意義, 對我國黃淮冬麥區(qū)尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)PFT-I/His-I為Fhb1抗病類型, 但Fhb1區(qū)段遺傳解析和抗性機(jī)制尚未完全清楚, 可能有多個基因參與赤霉病抗性。除該位點外, 蘇麥 3號所含其他抗赤霉病位點也尚待解析, 這些位點有可能會部分解釋陜西材料及其衍生系具有一定赤霉病抗性。

提高赤霉病抗性已成為黃淮麥區(qū)特別是黃淮南片的主要育種目標(biāo)。借鑒國內(nèi)外成功的經(jīng)驗, 提出3點抗病育種建議: (1)在抗源利用上, 選擇含F(xiàn)hb1、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗病品種如揚麥 21、寧麥 26等作親本, 但應(yīng)注意此類抗源的冬春性和矮稈基因與黃淮麥區(qū)品種有一定差異, 周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院利用寧麥 9號育成的材料其抗病性和農(nóng)藝性狀都有明顯改良(殷貴鴻, 個人交流, 2017), 值得在育種中利用。(2)在育種方法上, 以高產(chǎn)廣適品種為農(nóng)藝親本, 采用回交 1~2次、擴(kuò)大群體的方法, 結(jié)合本研究開發(fā)的標(biāo)記檢測和赤霉病接種鑒定進(jìn)行選擇, 并適當(dāng)降低農(nóng)藝性狀選擇標(biāo)準(zhǔn), 培育赤霉病抗性達(dá)到中感或中抗、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的新品種。(3)從長遠(yuǎn)來看, 可借鑒小麥抗銹病和白粉病育種的成功經(jīng)驗, 利用分子標(biāo)記聚合多個微效基因, 以提高品種的整體抗性水平[46]。

4　結(jié)論

26份國內(nèi)品種(系)具有PFT-I/His-I抗赤霉病單倍型, 含F(xiàn)hb1, 可作為育種有效抗源。我國小麥所含F(xiàn)hb1主要來自蘇麥3號和寧麥9號(揚麥6號/西風(fēng)), 并以后者為主。以PFT-CAPS和His-InDel可準(zhǔn)確檢測Fhb1, 將在抗赤霉病育種中發(fā)揮重要作用。

致謝感謝美國堪薩斯州立大學(xué)Guihua Bai教授和Zhenqi Su博士審閱全文, 并提供His基因為Fhb1新的候選基因這一信息。

[1] Dexter J E, Clear R M, Preston K R. Fusarium head blight: effect on the milling and baking of some Canadian wheats.Cereal Chem, 1996, 73: 695–701

[2] Dexter J E, Marchylo B A, Clear R M, Clarke J M. Effect of Fusarium head blight on semolina milling and pasta-making quality of durum wheat.Cereal Chem, 1997, 74: 519–525

[3]程順和, 郭文善, 王龍俊, 姜東, 馬鴻翔, 張伯橋. 中國南方小麥. 南京: 江蘇科學(xué)技術(shù)出版社, 2012. pp 281–282 Cheng S H, Guo W S, Wang L J, Jiang D, Ma H X, Zhang B Q.Wheat in Southern China. Nanjing: Jiangsu Scientific and Technical Publishers, 2012. pp 281–282 (in Chinese)

[4]馬忠華, 尹燕妮, 陳云. 小麥赤霉病發(fā)生規(guī)律及其防控技術(shù)研究進(jìn)展. 見: 陳萬權(quán)主編. 植?？萍紕?chuàng)新與農(nóng)業(yè)精準(zhǔn)扶貧—中國植物保護(hù)學(xué)會 2016年學(xué)術(shù)年會論文集. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社, 2016. p 29 Ma Z H, Yin Y N, Chen Y. The epidemic characteristics of wheatFusariumhead blight and the progress of its control technology development. In: Chen W Q, ed. Plant Protection Technology Innovation and Agricultural Targeted Poverty Alleviation—Proceedings of the 2016 Annual Conference of China Plant Protection Society. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 2016. p 29 (in Chinese)

[5]吳佳文, 楊榮明, 朱鳳, 田子華. 2015年江蘇省小麥赤霉病發(fā)生特點與防控對策探討. 中國植保導(dǎo)刊, 2016, 36(10): 31–34 Wu J W, Yang R M, Zhu F, Tian Z H. The epidemic characteristics of wheatFusariumhead blight in Jiangsu Province in 2015 and discussion of its control measures.China Plant Prot, 2016,36(10): 31–34 (in Chinese)

[6]金艷, 劉付領(lǐng), 朱統(tǒng)泉, 陳杰, 趙立尚. 河南省小麥赤霉病的發(fā)生情況分析與防治對策. 河南科技學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2016, 44(6): 1–4 Jin Y, Liu F L, Zhu T Q, Chen J, Zhao L S. Occurrence analysis and control measures of wheat scab in Henan province.J Henan Inst Sci & Technol(Nat Sci Edn), 2016, 44(6): 1–4 (in Chinese with English abstract)

[7] McMullen M, Jones R, Gallenberg D. Scab of wheat and barley:a re-emerging disease of devastating impact.Plant Dis, 1997, 81:1340–1348

[8] Buerstmayr H, Ban T, Anderson J A. QTL mapping and marker-assisted selection forFusariumhead blight resistance in wheat:a review.Plant Breed, 2009, 128: 1–26

[9] Cuthbert P A, Somers D J, Thomas J, Cloutier S, Brulé-Babel A.Fine mappingFhb1, a major gene controllingFusariumhead blight resistance in bread wheat (Triticum aestivumL.).Theor Appl Genet, 2006, 112: 1465–1472

[10] Cuthbert P A, Somers D J, Brulé-Babel A. Mapping ofFhb2on chromosome 6BS: a gene controllingFusariumhead blight field resistance in bread wheat (Triticum aestivumL.).Theor Appl Genet, 2007, 114: 429–437

[11] Liu S, Zhang X, Pumphrey M O, Stack R W, Gill B S, Anderson J A. Complex microcolinearity among wheat, rice, and barley revealed by fine mapping of the genomic region harboring a major QTL for resistance toFusariumhead blight in wheat.Funct Integr Genomics, 2006, 6: 83–89

[12] Qi L, Pumphrey M, Friebe B, Chen P, Gill B. Molecular cytogenetic characterization of alien introgressions with geneFhb3for resistance toFusariumhead blight disease of wheat.Theor Appl Genet, 2008, 117: 1155–1166

[13] Xue S, Li G, Jia H, Xu F, Lin F, Tang M, Wang Y, An X, Xu H,Zhang L. Fine mappingFhb4, a major QTL conditioning resistance toFusariuminfection in bread wheat (Triticum aestivumL.).Theor Appl Genet, 2010, 121: 147–156

[14] Xue S, Xu F, Tang M, Zhou Y, Li G, An X, Lin F, Xu H, Jia H,Zhang L. Precise mappingFhb5, a major QTL conditioning resistance toFusariuminfection in bread wheat (Triticum aestivumL.).Theor Appl Genet, 2011, 123: 1055–1063

[15] Cainong J C, Bockus W W, Feng Y, Chen P, Qi L, Sehgal S K,Danilova T V, Koo D H, Friebe B, Gill B S. Chromosome engineering, mapping, and transferring of resistance toFusariumhead blight disease fromElymus tsukushiensisinto wheat.Theor Appl Genet, 2015, 128: 1019–1027

[16] Guo J, Zhang X, Hou Y, Cai J, Shen X, Zhou T, Xu H, Ohm H W,Wang H, Li A, Han F, Wang H, Kong L. High-density mapping of the major FHB resistance geneFhb7derived fromThinopyrum ponticumand its pyramiding withFhb1by marker-assisted selection.Theor Appl Genet, 2015, 128: 2301–2316

[17] Schweiger W, Steiner B, Vautrin S, Nussbaumer T, Siegwart G,Zamini M, Jungreithmeier F, Gratl V, Lemmens M, Mayer K F X,Bérgès H, Adam G, Buerstmayr H. Suppressed recombination and unique candidate genes in the divergent haplotype encodingFhb1,a majorFusariumhead blight resistance locus in wheat.Theor Appl Genet, 2016, 129: 1607–1623

[18] Pumphrey M O, Bernardo R, Anderson J A. Validating theFhb1QTL forFusariumhead blight resistance in near-isogenic wheat lines developed from breeding populations.Crop Sci, 2007, 47:200–206

[19] Horevaj P, Brown-Guedira G, Milus E A. Resistance in winter wheat lines to deoxynivalenol applied into florets at flowering stage and tolerance to phytotoxic effects on yield.Plant Pathol,2012, 61: 925–933

[20] Mergoum M, Frohberg R C, Stack R W. Breeding hard red spring wheat forFusariumhead blight resistance. In: Buck H T, Nisi J E,Salomón N, eds. Wheat Production in Stressed Environments:Proceedings of the 7th International Wheat Conference. Dordrecht, Netherlands: Springer, 2007. pp 161–167

[21] Anderson J A, Wiersma J J, Linkert G L, Kolmer J A, Jin Y,Dillmacky R, Wiersma J V, Hareland G A. Registration of ‘Sabin’Wheat.J Plant Reg, 2012, 6: 174

[22] Steiner B, Buerstmayr M, Michel S, Schweiger W, Lemmens M,Buerstmayr H. Breeding strategies and advances in line selection forFusariumhead blight resistance in wheat.Trop Plant Pathol,2017, 42: 165–174

[23] Bai G, Shaner G. Management and resistance in wheat and barley toFusariumhead blight.Annu Rev Phytopathol, 2004, 42:135–161

[24] Rawat N, Pumphrey M O, Liu S, Zhang X, Tiwari V K, Ando K,Trick H N, Bockus W W, Akhunov E, Anderson J A, Gill B S.WheatFhb1encodes a chimeric lectin with agglutinin domains and a pore-forming toxin-like domain conferring resistance toFusariumhead blight.Nat Genet, 2016, 48: 1576–1580

[25] He X, Bonnett D, Singh P K, Hyles J, Spielmeyer W, Dreisigacker S. Advanced wheat breeding lines combiningFhb1andSr2in different genetic backgrounds. In: Proceedings of the 9th International Wheat Conference. Sydney, Australia, 2015. p 140

[26]孫道杰, 張玲麗, 馮毅, 陳春環(huán), 張榮琦, 奚亞軍, 何心堯, 王輝, 宋哲民. 西農(nóng)系列小麥骨干新品種赤霉病抗源淺析. 麥類作物學(xué)報, 2016, 36: 822–823 Sun D J, Zhang L L, Feng Y, Chen C H, Zhang R Q, Xi Y J, He X Y, Wang H, Song Z M. Analysis of FHB resistance sources for newly released Xinong varieties.J Triticeae Crops, 2016, 36:822–823 (in Chinese)

[27]朱展望, 朱偉偉, 佟漢文, 劉易科, 陳泠, 楊立軍, 汪華, 張宇慶, 鄒娟, 焦春海, 高春保. 湖北小麥品種赤霉病抗性及其在生產(chǎn)中的應(yīng)用. 麥類作物學(xué)報, 2015, 35: 1733–1738 Zhu Z W, Zhu W W, Tong H W, Liu Y K, Chen L, Yang L J,Wang H, Zhang Y Q, Zou J, Jiao C H, Gao C B. Fusarium head bight resistance and application of wheat varieties in Hubei Province.J Triticeae Crops, 2015, 35: 1733–1738 (in Chinese with English abstract)

[28]朱展望, 楊立軍, 佟漢文, 唐道廷, 劉易科, 汪華, 陳泠, 張宇慶, 高春保. 湖北省小麥品種(系)的赤霉病抗性分析. 麥類作物學(xué)報, 2014, 34: 137–142 Zhu Z W, Yang L J, Tong H W, Tang D T, Liu Y K, Wang H, Chen L, Zhang Y Q, Gao C B. Analysis of the resistance to Fusarium head blight in wheat varieties and lines from Hubei.J Triticeae Crops, 2014, 34: 137–142 (in Chinese with English abstract)

[29] Stack R W, McMullen M P. A visual scale to estimate severity of Fusarium head blight in Wheat. North Dakota State University Extension Service 1994. p 1095

[30] Wang J, Li H, Zhang L, Meng L. Users’ Manual of QTL IciMapping. The Quantitative Genetics Group, Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), and Genetic Resources Program, International Maize and Wheat Improvement Center (CIMMYT), 2016

[31] Saghai-Maroof M A, Soliman K M, Jorgensen R A, Allard R W.Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics.Proc Natl Acad Sci USA, 1984, 81: 8014–8018

[32] Anderson J A, Chao S, Liu S. Molecular breeding using a major QTL forFusariumhead blight resistance in wheat.Crop Sci,2007, 47: S112–S119

[33] Anderson J A, Stack R W, Liu S, Waldron B L, Fjeld A D, Coyne C, Moreno-Sevilla B, Fetch J M, Song Q J, Cregan P B, Frohberg R C. DNA markers forFusariumhead blight resistance QTLs in two wheat populations.Theor Appl Genet, 2001, 102: 1164–1168

[34] Liu S, Pumphrey M O, Gill B S, Trick H N, Zhang J X, Dolezel J,Chalhoub B, Anderson J A. Toward positional cloning ofFhb1, a major QTL forFusariumhead blight resistance in wheat.Cereal Res Commun, 2008, 36: 195–201

[35] Jin F, Zhang D, Bockus W, Baenziger P S, Carver B, Bai G.Fusariumhead blight resistance in U.S. Winter wheat cultivars and elite breeding lines.Crop Sci, 2012, 53: 2006–2013

[36] Bernardo A N, Ma H, Zhang D, Bai G. Single nucleotide polymorphism in wheat chromosome region harboringFhb1forFusariumhead blight resistance.Mol Breed, 2012, 29: 477–488

[37] Buerstmayr H, Steiner B, Hartl L, Griesser M, Angerer N,Lengauer D, Miedaner T, Schneider B, Lemmens M. Molecular mapping of QTLs forFusariumhead blight resistance in spring wheat: II. Resistance to fungal penetration and spread.Theor Appl Genet, 2003, 107: 503–508

[38] Chen J, Griffey C A, Saghai Maroof M A, Stromberg E L,Biyashev R M, Zhao W, Chappell M R, Pridgen T H, Dong Y,Zeng Z. Validation of two major quantitative trait loci for fusarium head blight resistance in Chinese wheat line W14.Plant Breed, 2006, 125: 99–101

[39]金善寶. 中國小麥品種志(1983–1993). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1997. pp 249–250 Jin S B. Chinese Wheat Varieties (1983–1993). Beijing: China Agriculture Press, 1997. pp 249–250 (in Chinese)

[40] Li T, Bai G, Wu S, Gu S. Quantitative trait loci for resistance toFusariumhead blight in the Chinese wheat landrace Huangfangzhu.Euphytica, 2012, 185: 93–102

[41] Yu J B, Bai G H, Cai S B, Ban T. Marker-assisted characterization of Asian wheat lines for resistance toFusariumhead blight.Theor Appl Genet, 2006, 113: 308–320

[42]楊學(xué)明, 姚金保, 錢存鳴, 周朝飛, 姚國才, 黃勝東. 寧麥9號選育方法的探討. 麥類作物學(xué)報, 2000, 20: 88–90 Yang X M, Yao J B, Qian C M, Zhou C F, Yao G C, Huang S D.Discussion on the breeding method of Ningmai 9.J Triticeae Crops, 2000, 20: 88–90 (in Chinese)

[43]姚金保, 馬鴻翔, 張平平, 姚國才, 楊學(xué)明, 任麗娟, 張鵬, 周淼平. 小麥優(yōu)良親本寧麥9號的研究與利用. 核農(nóng)學(xué)報, 2012,26: 17–21 Yao J B, Ma H X, Zhang P P, Yao G C, Yang X M, Ren L J,Zhang P, Zhou M P. Research of wheat elite parent Ningmai 9 and its utilization.J Nucl Agric Sci, 2012, 26: 17–21 (in Chinese with English abstract)

[44] Zhang X, Pan H, Bai G. Quantitative trait loci responsible forFusariumhead blight resistance in Chinese landrace Baishanyuehuang.Theor Appl Genet, 2012, 125: 495–502

[45] Li T, Bai G, Wu S, Gu S. Quantitative trait loci for resistance to Fusarium head blight in the Chinese wheat landrace Huangfangzhu.Euphytica, 2012, 185: 93–102

[46]何中虎, 蘭彩霞, 陳新民, 鄒裕春, 莊巧生, 夏先春. 小麥條銹病和白粉病成株期抗性研究進(jìn)展與展望. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2011, 44: 2193–2215 He Z H, Lan C X, Chen X M, Zou Y C, Zhuang Q S, Xia X C.Progress and perspective in research of adult-plant resistance in stripe rust and powdery mildew in wheat.Sci Agric Sin, 2011, 44:2193–2215 (in Chinese with English abstract)