施力光，彭維祺，胡海超，侯冠彧，周漢林

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

熱應激是當機體或細胞處于高溫環(huán)境中表現(xiàn)出的一系列非特異性生理反應的總和[1]，表現(xiàn)為畜禽呼吸頻率加快、脫水、采食量下降、精神委靡、神經(jīng)機能紊亂等，而且機體熱應激的嚴重程度隨溫度和濕度的增高而加重，重度熱應激甚至導致畜禽死亡，給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成損失[2]。盡管熱應激的作用機理至今尚未完全探明，但已有研究證實熱應激能通過交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺軸引起代謝、免疫及生殖機能紊亂。血液生化值是反映機體代謝狀況最敏感的指標之一，Cwynar等[3]測定了美利奴羊種公羊在不同溫度下(16.5 ℃、30 ℃和50 ℃)的血液指標生理化指標，測得血液紅細胞數(shù)、葡萄糖、腎上腺素等血液生理化指標在隨著環(huán)境溫度變化出現(xiàn)顯著改變；雷虹等[4]通過研究湘西黃牛在夏季熱應激狀態(tài)下(THI>82)18項血液生理化指標，發(fā)現(xiàn)夏季高溫會造成熱應激，而且對牛血液生理指標影響較大，對血液生化參數(shù)影響不明顯；姜潤深等[5]通過研究熱應激初期肉雞血液生化指標與耐熱性能的關系，發(fā)現(xiàn)熱應激狀態(tài)雞血清葡萄糖濃度和免疫球蛋白含量出現(xiàn)顯著變化。可見通過畜禽血液生化指標變化能較直觀的反映畜禽機體熱應激狀況。熱應激還對公畜繁殖性能的影響尤為顯著，熱應激發(fā)生時不僅造成種公畜呼吸和心率加快導致血液循環(huán)加快，出現(xiàn)呼吸性堿中毒癥狀；同時會導致下丘腦促性腺激素釋放激素(CnRH)和垂體前葉促性腺激素的分泌減少，影響性欲和交配能力[6-7]。Hamilton[8]通過熱應激環(huán)境下公羊睪丸和附睪精液品質(zhì)測定及氧化還原酶系活性證實，熱應激造成的精子不可逆轉(zhuǎn)的損傷。本課題組前期研究顯示，海南地區(qū)夏季高溫濕熱持續(xù)強度大、時間長，環(huán)境溫度持續(xù)在30 ℃左右的時間長達4～5個月之久[9]，對畜禽影響極為明顯。

本試驗通過測定海南高溫濕熱氣候條件下種公羊血液生化指標、血清生殖激素和精液品質(zhì)等相關指標的變化，探討種公羊?qū)釕さ纳眄憫?，旨在為我國南方熱區(qū)養(yǎng)羊生產(chǎn)緩解熱應激提供參考。

1　材料與方法

1.1　試驗動物與飼養(yǎng)管理

本試驗用種公羊由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所海南黑山羊種羊場提供，共15只，體重32～48 kg，年齡2～4歲，體質(zhì)健康。試驗羊舍為半開放高床羊舍，試驗分2個階段進行，即春季(非應激期)(2017年3月10日～2017年3月30日)和夏季(持續(xù)性熱應激期)(2017年7月10日～2017年7月30日)。試驗期間日常管理相同，專人負責定期投喂，自由飲水，定時定點測定羊舍溫、濕度，參照奶牛環(huán)境溫濕度指數(shù)(temperature humidity index，THI)計算方法[10]，用以評價炎熱程度。試驗前統(tǒng)一驅(qū)蟲并進行常規(guī)免疫。

1.2　樣品采集

試驗期間，分別對非熱應激期和持續(xù)性熱應激期的種公羊采用頸靜脈采血方法進行空腹采血10 mL，每5天采集一次，其中5 mL EDTA抗凝處理，4 ℃保存待測生理指標；另5 mL室溫靜置0.5～1 h，4 ℃ 3 000～3 500 rpm離心20 min分離血清，待測激素和生化指標。每次采血結(jié)束后，采用電刺激法采集種公羊精液，現(xiàn)場常規(guī)方法分別進行精液品質(zhì)檢測。

1.3　血清生化指標分析

血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽固醇(CHO)、葡萄糖(Glu)等生化指標委托海南西部中心醫(yī)院通過美國貝克曼全自動生化分析儀進行檢測。促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)、睪酮(T)等血清生殖激素采用ELISA法測定(ELISA檢測試劑盒購自上海哈靈生物有限公司)，具體操作步驟參照試劑盒提供使用說明書進行。

1.4　精液品質(zhì)分析

射精量采集到的精液直接用集精杯測量射精體積。精子活力用預溫生理鹽水稀釋精液100倍，混勻后滴在載玻片上，蓋上潔凈的蓋玻片。置于顯微鏡下觀察(放大倍數(shù)250至400倍左右)。精子活力=呈直線前進運動精子數(shù)/總精子數(shù)×100%。精子密度測定用預溫生理鹽水按1∶100比例稀釋精液，利用血細胞計數(shù)板計數(shù)測定。每毫升精子數(shù)量=5個中方格數(shù)的精子數(shù)×5×10×1000×100(稀釋倍數(shù))?；温实臏y定用姬姆薩染色法檢測，取稀釋后精液樣品1滴制作抹片，4%多聚甲醛固定10 min，姬姆薩染色1 h，風干后鏡檢計數(shù)。

1.5　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行分析，應激期和非應激期2階段組間平均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示，P<0.01為差異極顯著，P<0.05為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同試驗期羊舍環(huán)境參數(shù)監(jiān)測

試驗羊舍溫濕度指標監(jiān)測結(jié)果如表1所示，在非應激期羊舍THI為70～72，試驗動物無熱應激或短暫性熱應激；在熱應激期羊舍平均THI達84以上，試驗公羊遭受持續(xù)性強熱應激。

表1　試驗羊舍溫濕度指標Table 1　Temperature and humidity index of goat house

2.2　持續(xù)性熱應激對公羊血液生理指標的影響

由表2可知，持續(xù)性熱應激造成海南黑山羊種公羊血液中的紅細胞數(shù)顯著增加，白細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05)，而對血小板數(shù)和淋巴細胞數(shù)影響不大。在應激環(huán)境中種公羊血液中血紅蛋白濃度、紅細胞比容和平均血紅蛋白含量的影響差異顯著(P<0.05)。

2.3　持續(xù)性熱應激對公羊血液生化指標的影響

本試驗測定了包括不同環(huán)境下種公羊血液中葡萄糖(GLU)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP和免疫球蛋白等12項血液生化指標，結(jié)果如表3所示。由表3可知，持續(xù)性的環(huán)境熱應激對血清免疫球蛋白濃度影響顯著，極顯著降低IgM和IgA濃度(P<0.01)，IgG濃度也顯著低于非應激期水平(P<0.05)；持續(xù)性的環(huán)境熱應激顯著增加血清中堿性磷酸酶(ALP)和乳酸脫氫酶(LDH)酶活性(P<0.05)，對血清中甘油三酯濃度也有極顯著影響(P<0.01)；對其他生化指標影響差異不顯著(P>0.05)。

表2　血液生理指標測定結(jié)果Table 2　Results of blood physiology index

表3　 血液生化指標測定結(jié)果Table 3　Results of blood biochemical indexes

2.4　持續(xù)性熱應激對公羊血清生殖激素的影響

公羊血清生殖激素ELISA測定結(jié)果見表4。從表4可見，持續(xù)性的環(huán)境熱應激對公羊血清生殖激素水平影響差異顯著。持續(xù)性的熱應激極顯著降低了血清FSH和LH含量，血清睪酮T濃度也顯著低于非應激期(P<0.05)。

2.5　持續(xù)性熱應激對公羊精液品質(zhì)的影響

由表5可知，在應激期和非應激期種公羊采精量的無顯著差異(P>0.05)，但持續(xù)性的環(huán)境熱應激能顯著降低精子密度(P<0.05)，而且精子活力也受到環(huán)境熱應激的影響，降低22%(P<0.01)；同時持續(xù)性的熱應激還極顯著的使種公羊精子畸形率增加了50%以上(P<0.01)。

3　討　論

3.1　持續(xù)性熱應激對海南黑山羊種公羊血液生理指標的影響

畜禽血液生理生化指標作為反應機體代謝情況和應激狀態(tài)的一組參數(shù)，對評價畜禽機體生理狀況具有重要意義。因為機體對外界環(huán)境的應激，會直接引起內(nèi)環(huán)境相應的調(diào)節(jié)，造成血液成分的改變和代謝的調(diào)節(jié)。從本試驗檢測的21項血液生理生化指標可以看出，持續(xù)性的高溫環(huán)境對公羊血液細胞成分中RBC、HCT、HGB和MCH有顯著影響。因為山羊汗腺不發(fā)達，環(huán)境高溫時只能依靠加快呼吸頻率進行輔助散熱的代償反應進行自身恒溫的調(diào)節(jié)，呼吸頻率的加快迫使紅細胞數(shù)和血紅蛋白含量增加以供給機體耗氧量的需求，這與Cwynar等[3]、雷虹等[4]、趙宗勝等[11]、黃光遠等[12]測定的熱應激環(huán)境下綿羊、肉牛、奶牛、成年兔血液生理指標變化結(jié)果基本一致。陶林等[13]報道，高溫應激對公雞的生理指標沒有顯著影響，推測可能是由于地方品種對慢性的熱應激有較強的適應性和耐受力。關于熱應激對畜禽血液白細胞數(shù)WBC影響的相關研究結(jié)果不盡一致，有研究顯示環(huán)境熱應激能夠顯著提高畜禽血液中白細胞數(shù)(WBC)[14]；另有相關研究報道熱應激對WBC影響差異不顯著，人長期桑拿浴(高溫應激)對外周白細胞數(shù)沒有顯著影響，也沒有白細胞產(chǎn)生堆積效應[15]，這可能是機體適應了類似代謝熱應激產(chǎn)生的自我調(diào)控機制。本試驗中種公羊在持續(xù)性環(huán)境熱應激后WBC顯著減少，與雷虹等[4]報道結(jié)果相符。結(jié)合血清免疫球蛋白測定結(jié)果，推測可能是由于在熱應激條件下種公羊的免疫力有所下降所致。

表4　血清生殖激素測定結(jié)果Table 4　Results of serum reproductive hormone

表5　精液品質(zhì)測定結(jié)果Table 5　Results of semen quality

3.2　持續(xù)性熱應激對海南黑山羊種公羊血液生化指標的影響

血糖是反映機體營養(yǎng)代謝狀況最直觀的指標之一，也是能反映動物應激的指標之一，因為熱應激時能引起腎上腺交感神經(jīng)興奮，使腎上腺素分泌增強，導致GLU含量升高[16]。白丹丹等[17]研究顯示，慢性熱應激導致肉牛血清GLU含量顯著降低，而Scharf等[18]報道急性熱應激時肉牛血清中GLU升高，也有相關高溫應激對公雞血清GLU含量無顯著影響的研究報道[19]。本試驗中，持續(xù)性的熱應激對種公羊血清GLU含量影響不顯著，而BUN和TG在熱應激階段顯著降低，可能是因為持續(xù)性的熱應激引起腎上腺交感神經(jīng)持續(xù)性的作用，使代謝向降解蛋白質(zhì)、提高糖原合成和脂肪沉積方向進行，引起B(yǎng)UN和TG含量的變化?？梢姡掷m(xù)性熱應激對血液中糖、蛋白及脂肪的代謝有影響。

熱應激導致機體代謝系統(tǒng)受到干擾，勢必會造成血清中酶的活性和含量發(fā)生變化。本試驗發(fā)現(xiàn)高溫應激會引起ALP和LDH顯著升高，因為熱應激導致細胞膜的通透性發(fā)生改變，能量代謝的無氧酵解過程明顯增強，引起LDH活性升高，與白丹丹等[17]、Hocking等[19]報道結(jié)果一致。本試驗檢測到ALT、AST和CK活性未受到持續(xù)性熱應激顯著影響，鑒于目前關于熱應激反應中血清酶的變化報道不一，推測可能是品種差異導致的。

熱應激狀態(tài)下機體的免疫機能都會減弱[20-21]。本研究測定的3種免疫球蛋白在持續(xù)性熱應激條件下含量顯著降低，其中IgM和IgA分別作為體液免疫應答中最先產(chǎn)生的免疫球蛋白和介導調(diào)理吞噬作用的免疫球蛋白，其含量極顯著減少，殺菌、溶菌和促吞噬能力下降，導致種羊的免疫系統(tǒng)效率降低。

3.3　持續(xù)性熱應激對海南黑山羊種公羊血清生殖激素和精液品質(zhì)的影響

生殖激素對種公畜繁殖性能有非常重要的調(diào)控作用，機體通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)生殖激素的分泌，因此血清生殖激素含量是反映種公畜生殖機能的重要指標之一。高溫應激能引起腎上腺交感神經(jīng)興奮，調(diào)節(jié)機體代謝機能；Maurya等[22]研究證實，高溫通過下丘腦-垂體-性腺軸影響畜禽的生殖激素的分泌。本試驗結(jié)果表明，在持續(xù)性熱應激階段，種公羊血清FSH和LH水平極顯著的降低，因為環(huán)境熱應激導致的內(nèi)分泌紊亂會抑制下丘腦的活動，會減少GnRH的分泌，進而影響垂體FSH和LH的分泌減少。在雄性動物中LH分泌的減少又會導致睪酮T合成降低，與楊明等[23]、Pei等[24]結(jié)果一致。本試驗中除種羊射精量未受影響外，熱應激致使公羊精子活力和密度顯著下降，精子畸形率極顯著升高。也是由于LH分泌減少，睪酮合成降低，抑制精子細胞的進一步正常發(fā)育，使精子細胞的增殖分裂和發(fā)育受阻，導致精子密度降低所致。與此同時，熱應激除了造成激素分泌的影響，還有代謝紊亂積累的有毒有害物質(zhì)增多，破壞精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能，降低精子的活率并增加畸形精子數(shù)。重度熱應激會損害精子的DNA，影響受精過程。

4　結(jié)　論

持續(xù)性的熱應激可導致海南黑山羊種公羊血液RBC、HGB、MBC、TG和LDH等生理生化指標的顯著改變，造成了血清生殖激素水平的顯著降低和精液品質(zhì)的下降，血清免疫球蛋白水平的顯著降低反映熱應激對還可能造成公羊免疫機能的下降。因此，在生產(chǎn)實踐中要防范持續(xù)性環(huán)境熱應激對種公羊健康及繁殖性能造成的不利影響。

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