楊永恒， 徐曉洋， 孫玉明， 原海燕， 劉清泉， 張永俠， 王銀杰， 黃蘇珍， 佟海英

(江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所，江蘇南京 210014)

甜菊(SteviarebaudianaBertoni)又稱甜葉菊，是菊科(Asteraceae)甜菊屬(Stevia)多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲巴拉圭等地。甜菊因其葉片可提取高甜度低熱量的甜菊糖苷而從20世紀(jì)70年代開始受到人們的廣泛關(guān)注[1]。甜菊葉片所含甜菊糖苷有多達(dá)30種組分，各組分的結(jié)構(gòu)相似，性質(zhì)迥異。甜菊苷(stevioside，St)和萊鮑迪苷A(rebaudioside A，R-A)是兩大主要組分，占總糖苷含量的60%～80%。St苷的甜度為蔗糖的250～300倍，略帶苦味，具有藥用價(jià)值，R-A 苷的甜度為蔗糖的350～450倍，且具有更接近蔗糖的甜味[2]，因此在甜菊種質(zhì)創(chuàng)新研究中，為滿足不同應(yīng)用目的的需要，提高St苷、R-A苷等單一糖苷的生物積累及其在總苷中的比例成為甜菊育種學(xué)家競(jìng)相研究的熱點(diǎn)。

在甜菊糖苷生物合成途徑中，葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶SrUGT76G1專一地對(duì)St苷的C-13位C-3′進(jìn)行糖基化，將其轉(zhuǎn)化為R-A苷[3]，所以SrUGT76G1是St苷和R-A苷合成的關(guān)鍵基因。研究該基因的表達(dá)調(diào)控對(duì)了解R-A苷的生物合成和今后通過基因工程等手段人為調(diào)控R-A苷的合成具有重要意義，但是目前對(duì)SrUGT76G1的表達(dá)調(diào)控模式還不清楚。啟動(dòng)子作為基因表達(dá)調(diào)控的重要區(qū)域，研究SrUGT76G1啟動(dòng)子對(duì)于了解這一關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控具有重要意義，但在甜菊研究中目前尚無相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)在SrUGT76G1基因研究的基礎(chǔ)上，根據(jù)已克隆到的SrUGT76G1基因DNA序列設(shè)計(jì)嵌套引物，擴(kuò)增基因上游未知序列，通過啟動(dòng)子序列分析初步探究序列上的功能元件。為了更深入地研究該基因的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)一步構(gòu)建植物表達(dá)載體，用1 989 bp的SrUGT76G1啟動(dòng)子取代pCAMBIA1301-220中的CaMV35S組成型啟動(dòng)子，連接GUS報(bào)告基因，構(gòu)建pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因瞬時(shí)表達(dá)的方法初步驗(yàn)證SrUGT76G1啟動(dòng)子的活性，為今后深入研究SrUGT76G1基因的表達(dá)調(diào)控和甜菊分子育種奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料

試驗(yàn)于2014年7月至2015年6月在江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所進(jìn)行。用于DNA提取的甜菊葉片取自本實(shí)驗(yàn)室甜菊種質(zhì)資源圃。植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院菊花實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105、大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株TOP10、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、測(cè)序載體pMD19-T Vector、TaqDNA polymerase、各種限制性核酸內(nèi)切酶與試劑購(gòu)自TaKaRa公司；氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、IPTG、X-gal、Real Master Mix SYBR GreenⅠ、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技公司；GUS活性檢測(cè)試劑購(gòu)自Sigma公司；其他常用化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2　方法

1.2.1SrUGT76G1啟動(dòng)子的克隆采用改良CTAB法提取甜菊基因組DNA。以提取的甜菊基因組DNA為模板，根據(jù)已知的SrUGT76G1序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物SP1、SP2、SP3。hiTAIL-PCR反應(yīng)程序參照Liu等的方法[4]進(jìn)行。第1輪PCR用特異性引物SP1與簡(jiǎn)并引物L(fēng)AD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4組合，建立4個(gè)平行的25 μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增；第2輪PCR將第1輪的PCR產(chǎn)物稀釋50倍，取1 μL作為反應(yīng)模板，用簡(jiǎn)并引物AC1與特異性引物SP2擴(kuò)增；第3輪PCR將第2輪的PCR產(chǎn)物稀釋50倍，取1 μL作為反應(yīng)模板，用簡(jiǎn)并引物AC1與特異性引物SP3擴(kuò)增，經(jīng)過3輪PCR擴(kuò)增得到SrUGT76G1的上游序列。根據(jù)第一次步移得到的序列設(shè)計(jì)特異性引物SP4、SP5、SP6，以相同方法進(jìn)行第二次步移，將2次步移得到的序列拼接，并設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物pro-1F、pro-1R，最終得到SrUGT76G1的啟動(dòng)子序列。試驗(yàn)所用引物序列及反應(yīng)程序詳見表1、表2。

表1　甜菊SrUGT76G11啟動(dòng)子步移及分析引物

表2　hiTAIL-PCR反應(yīng)程序

1.2.2SrUGT76G1啟動(dòng)子作用元件分析將甜菊SrUGT76G1啟動(dòng)子序列提交PLACE服務(wù)器(http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)，預(yù)測(cè)該啟動(dòng)子保守區(qū)域中潛在的順式作用元件。

1.2.3植物表達(dá)載體構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220是含有CaMV35S啟動(dòng)子和GUS基因系統(tǒng)的雙元載體。為了研究SrUGT76G1啟動(dòng)子的功能，本研究中用SrUGT76G1啟動(dòng)子取代pCAMBIA1301-220中的CaMV35S組成型啟動(dòng)子，連接GUS報(bào)告基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P。將引物pro-2F和pro-2R(引物序列見表1，劃?rùn)M線處分別為限制性內(nèi)切酶SacⅠ和NcoⅠ的酶切位點(diǎn))擴(kuò)增得到的含酶切位點(diǎn)的SrUGT76G1啟動(dòng)子片段連接到pMD19-T(2 692 bp)載體上，得到重組質(zhì)粒pMD19-T-SrUGT76G1P。將重組質(zhì)粒pMD19-T-SrUGT76G1P和質(zhì)粒pCAMBIA1301-220分別用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和NcoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別切膠回收pMD19-T-SrUGT76G1P小片段和pCAMBIA1301-220大片段，用T4 DNA連接酶連接2個(gè)目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10菌株感受態(tài)細(xì)胞中。將經(jīng)藍(lán)白斑篩選、PCR檢驗(yàn)和SacⅠ、NcoⅠ雙酶切鑒定都正確的重組質(zhì)粒命名為pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P。

1.2.4SrUGT76G1啟動(dòng)子功能的瞬時(shí)表達(dá)分析將重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P和質(zhì)粒 pCAMBIA1301-220 分別轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EHA105中[5]。已轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌在5 mL含利福平和卡那霉素的YEP液體培養(yǎng)基中28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取2 mL菌液轉(zhuǎn)入10 mL含同樣抗生素的新鮮培養(yǎng)液中，28 ℃振蕩培養(yǎng)36～48 h，離心培養(yǎng)物并用5 mL MMA{1×MS，10 mmol/L MES[2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid]，200 μmol/L乙酰丁香酮，pH值5.6}重懸菌體，28 ℃保溫3 h，5 000 min離心10 min，沉淀用2 mL 10 mmol/L 的MgCl2洗滌1次，菌體用2 mL 10 mmol/L的MgCl2懸起。取14 d左右的甜菊和擬南芥無菌幼苗分別浸沒在含重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P和質(zhì)粒pCAMBIA1301-220的上述農(nóng)桿菌菌液中，以10 mmol/L MgCl2溶液為空白對(duì)照，真空(10 Pa)處理30 min，然后用無菌水將幼苗沖洗3次，放置在鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，24℃、12 h/d光照培養(yǎng)。分別于2、4、6 d后取樣進(jìn)行GUS染色。GUS染色液的配制按照J(rèn)efferson等的方法[6]進(jìn)行，將待測(cè)材料和對(duì)照材料放入1.5 mL的離心管中，加入GUS染色液，37 ℃保溫24 h，將染色后的材料用70%、80%、90%、100%乙醇依次脫色，至空白對(duì)照為白色時(shí)用體視顯微鏡觀察并拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1　SrUGT76G1啟動(dòng)子序列的獲得

根據(jù)已知SrUGT76G1基因序列設(shè)計(jì)步移引物，采用Liu等的未知側(cè)翼序列擴(kuò)增的方法[4]，第一次步移克隆到了 1 107 bp 的片段，經(jīng)測(cè)序和NCBI blast比對(duì)，結(jié)果表明所得序列的3′端與數(shù)據(jù)庫(kù)中SrUGT76G1基因5′序列完全重疊，得到了ATG前862 bp的序列。根據(jù)克隆到的序列再設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套引物繼續(xù)向5′端步移，得到1 580 bp片段，亞克隆后測(cè)序，比對(duì)結(jié)果顯示其3′端與第一次步移所得序列的5′端重疊。將2次步移得到的序列進(jìn)行拼接，并重新設(shè)計(jì)1對(duì)序列特異引物從甜菊基因組DNA中克隆完整的SrUGT76G1啟動(dòng)子區(qū)域，將擴(kuò)增到的序列進(jìn)行NCBI blast，結(jié)果表明該序列3′端與數(shù)據(jù)庫(kù)中SrUGT76G1基因序列5′端同源，最終得到SrUGT76G1基因ATG前2 283 bp的啟動(dòng)子序列(圖1)。

2.2　啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)和序列分析

將克隆得到的啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列提交PLACE，進(jìn)行順式調(diào)控元件的分析，啟動(dòng)子序列正反向包含475個(gè)調(diào)控元件(表3)，含有典型的啟動(dòng)子保守元件，有21個(gè)TATA box；如：TATABOX2、TATABOX3、TATABOX4、TATABOX5和TATAPVTRNALEU；36個(gè)CAATBOX1和9個(gè)CCAATBOX1，它們是CAAT box的基序；2個(gè)ACGTTBOX，ACGTTBOX是1個(gè)ACGT元件；有2個(gè)AMYBOX1，它是5′上游區(qū)域的保守序列；19個(gè)MYB結(jié)合位點(diǎn)的同源序列，如：MYB1AT、MYB2AT、MYB2CONSENSUSAT、MYBATRD22、MYBCORE、MYBCORE ATCYCB1和MYBST1等。有12個(gè)MYCCONSENSUSAT的同源序列，1個(gè)MYCATERD1和1個(gè)MYCATRD22，它們是MYC結(jié)合位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)有植物多腺苷酸化信號(hào)的保守序列，8個(gè)POLASIG1，3個(gè)POLASIG2和6個(gè)POLASIG3[7]。

除了以上所述的保守元件，該啟動(dòng)子序列還含有多個(gè)植物激素相關(guān)的順式調(diào)控元件，1個(gè)SURECOREATSULTR11，它是硫和生長(zhǎng)素的響應(yīng)元件[8]；ARFAT是ARF(植物生長(zhǎng)素響應(yīng)因子，auxin response factor)的結(jié)合位點(diǎn)；2個(gè)ASF1MOTIFCAMV同源序列，它是植物生長(zhǎng)素和/或水楊酸響應(yīng)元件，并參與光調(diào)控；3個(gè)WBOXATNPR1的同源序列，參與水楊酸(SA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；3個(gè)DPBFCOREDCDC3，是bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和受ABA誘導(dǎo)的[9]；含有CPBCSPOR同源序列，是細(xì)胞分裂素增強(qiáng)蛋白(cytokinin-enhanced protein)結(jié)合的關(guān)鍵序列，最早在黃瓜POR(NADPH-protochlorophyllide reductase)基因啟動(dòng)子序列中被發(fā)現(xiàn)[10]；以及乙烯響應(yīng)元件ERELEE4、GCCCORE、LECPLEACS2和赤霉素響應(yīng)元件GARE1OSREP1、GAREAT、PYRIMIDINEBOXHVEPB1、PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A等。

該啟動(dòng)子序列還含有多個(gè)環(huán)境因子響應(yīng)的順式調(diào)控元件：有2個(gè)CBFHV同源序列，分別為ABRELATERD1和DRECRTCOREAT，它們是脫水響應(yīng)元件；6個(gè)ACGTATERD1的同源序列，是erd1(early responsive to dehydration)基因[11]黃化誘導(dǎo)表達(dá)必需的。LTRECOREATCOR15是在擬南芥cor15a基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的低溫響應(yīng)元件LTRE的核心基序[12]。還有厭氧響應(yīng)元件ANAERO1CONSENSUS，以及一些光調(diào)控元件，如：GT1CONSENSUS、IBOXCORE、INRNTPSADB、REALPHALGLHCB21、SORLIP1AT和SORLIP2AT等。其中GT1CONSENSUS是許多光調(diào)控基因保守的GT-1結(jié)合位點(diǎn)[13-14]。順式調(diào)控元件10PEHVPSBD、CIACADIANLELHC和EVENINGAT參與生理節(jié)律調(diào)控[15-17]。

此外，還發(fā)現(xiàn)SrUGT76G1啟動(dòng)子序列含有一些組織特異性表達(dá)元件：有22個(gè)GATABOX的同源序列，它們參與光調(diào)控和組織特異性表達(dá)[18]；ACGTOSGLUB1元件參與胚乳特異性表達(dá)；DPBFCOREDCDC3參與胚特異性表達(dá)；NTBBF1ARROLB參與組織特異性表達(dá)和植物生長(zhǎng)素誘導(dǎo)[19]；OSE1ROOTNODULE和OSE2ROOTNODULE為器官特異性表達(dá)元件，在根瘤感染細(xì)胞中被激活；POLLEN1LELAT52是2個(gè)相互依賴的花粉特異性表達(dá)的元件之一；RYREPEATBNNAPA是種子特異性表達(dá)元件；TAAAGSTKST1是保衛(wèi)細(xì)胞特異表達(dá)調(diào)控元件。

表3　SrUGT76G1啟動(dòng)子序列上部分順式調(diào)控元件

2.3　含雙酶切位點(diǎn)SrUGT76G1基因啟動(dòng)子片段的獲得

以含酶切位點(diǎn)的引物pro-2F和pro-2R克隆得到甜菊SrUGT76G1基因的啟動(dòng)子序列，其長(zhǎng)度為1 989 bp，提交至NCBI GenBank，獲得登錄號(hào)為KM206772。序列分析結(jié)果見圖2，除了TATA box等保守元件外，還有MYB、MYC識(shí)別位點(diǎn)，病原體和鹽響應(yīng)元件GT1GMSCAM4，鈣響應(yīng)元件ABRERATCAL，水楊酸響應(yīng)元件WBOXATNPR1，糖響應(yīng)元件WBOXHVISO1，赤霉素響應(yīng)元件GAREAT和增強(qiáng)子CTRMCAMV35S等。

2.4　SrUGT76G1基因啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建

植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220是含有CaMV35S啟動(dòng)子和GUS基因系統(tǒng)的雙元載體。為了驗(yàn)證所克隆的SrUGT76G1啟動(dòng)子序列是否具有活性，設(shè)計(jì)引物引入SacⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)，用SrUGT76G1啟動(dòng)子取代 pCAMBIA1301-220 中的CaMV35S組成型啟動(dòng)子，連接GUS報(bào)告基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P(圖3)。根據(jù)啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)質(zhì)粒構(gòu)建引物pro-2F(5′端帶SacⅠ酶切位點(diǎn))和pro-2R(3′端帶NcoⅠ酶切位點(diǎn))，NcoⅠ酶切位點(diǎn)中的ATG是SrUGT76G1基因的起始密碼子，同時(shí)也是載體上GUS基因起始密碼子。

2.5　基因瞬時(shí)表達(dá)分析

采用農(nóng)桿菌滲透法分別轉(zhuǎn)化擬南芥和甜菊幼苗，被侵染的甜菊和擬南芥幼苗分別在不同的處理時(shí)間取出(1 d、2 d、3 d 和4 d)進(jìn)行GUS染色，結(jié)果用含質(zhì)粒pCAMBIA1301-220和pCAMBIA1301-220-SrUGT76G1P的農(nóng)桿菌侵染的幼苗都表現(xiàn)出GUS基因的有效表達(dá)(圖4)，說明所克隆到的SrUGT76G1基因啟動(dòng)子具有啟動(dòng)活性，可以用于下一步的研究。同時(shí)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，被侵染的甜菊幼苗在第3天GUS的表達(dá)到高峰，隨后組織褐化；而在擬南芥中24 h后逐漸增強(qiáng)并在第3、第4天持續(xù)表達(dá)。

3　討論與結(jié)論

基因的表達(dá)調(diào)控是基因功能的基本部分，基因啟動(dòng)子上關(guān)鍵元件是其表達(dá)調(diào)控的概況[20-21]。了解植物啟動(dòng)子非常有意義，并且在很多方面為通過生物技術(shù)控制基因表達(dá)提供可能[22-23]。盡管如此，目前甜菊基因啟動(dòng)子研究的報(bào)道還很少，僅有關(guān)于SrHDR基因啟動(dòng)子的研究[24]。甜菊SrUGT76G1基因是RA苷合成的關(guān)鍵基因[25-26]，研究SrUGT76G1基因的表達(dá)調(diào)控對(duì)于了解植物體內(nèi)甜菊糖苷積累的規(guī)律和今后通過生物技術(shù)手段進(jìn)行甜菊育種都有重要的意義，但是目前尚無相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)在研究SrUGT76G1基因的基礎(chǔ)上，通過染色體步移的方法克隆了該基因的5′端側(cè)翼序列，采用在線的啟動(dòng)子分析工具預(yù)測(cè)該SrUGT76G1啟動(dòng)子序列上的調(diào)控元件，結(jié)果顯示雙向序列包含475個(gè)調(diào)控元件，除了典型的啟動(dòng)子元件，如：TATA-box、CAAT-box、MYB結(jié)合位點(diǎn)等外，還有生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、乙烯、ABA、水楊酸和茉莉酮酸酯等植物激素響應(yīng)元件，和光、脫水、低溫、厭氧等環(huán)境因子響應(yīng)元件，以及芽、胚乳等組織特異性表達(dá)元件，可見SrUGT76G1表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性。

因?yàn)楂@得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株耗時(shí)費(fèi)力，為了快速驗(yàn)證克隆的啟動(dòng)子片段是否有活性，我們采用了農(nóng)桿菌真空滲透的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法[27]。結(jié)果表明SrUGT76G1啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因的表達(dá)，證明克隆到的5′側(cè)翼序列具有啟動(dòng)子活性。啟動(dòng)子克隆、序列分析和啟動(dòng)子活性初步驗(yàn)證只是SrUGT76G1基因表達(dá)調(diào)控研究的開始，這些順式元件的功能和對(duì)SrUGT76G1基因表達(dá)的調(diào)控作用等還有待深入研究，如進(jìn)一步構(gòu)建一系列5′端缺失啟動(dòng)子的表達(dá)載體，通過對(duì)擬南芥及甜菊中的遺傳轉(zhuǎn)化獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)而研究各順式調(diào)控元件的功能及調(diào)控因子等。

甜菊糖苷的生物合成與赤霉素有著密切的關(guān)系，它們共用生物合成途徑的起始階段，直至共同的前體物質(zhì)貝殼杉烯酸的合成[28]。因此我們?cè)茰y(cè)SrUGT76G1的表達(dá)受赤霉素調(diào)控，正如我們所期望的，啟動(dòng)子順式調(diào)控元件預(yù)測(cè)的結(jié)果表明該序列上有7個(gè)赤霉素響應(yīng)元件，包括2個(gè)GARE1OSREP1、1個(gè)GAREAT、1個(gè)PYRIMIDINEBOXHVEPB 1和3個(gè)PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A。GARE1OSREP1(TA ACAGA)是在水稻一個(gè)半胱氨酸蛋白酶(REP-1)基因啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)的，該基因的表達(dá)受赤霉素的誘導(dǎo)[29]。GAREAT則是在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的赤霉素響應(yīng)元件[30]；PYRIMIDINEBOXHVEPB1是一個(gè)嘧啶盒(Pyrimidine box)，在大麥EPB-1(半胱氨酸蛋白酶)基因啟動(dòng)子上發(fā)現(xiàn)，并且確定為赤霉素誘導(dǎo)必需的元件[31]；PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A存在于水稻和大麥的α-淀粉酶基因啟動(dòng)子上，是轉(zhuǎn)錄因子GARE的赤霉素響應(yīng)順式調(diào)控元件，并部分參與糖抑制[32-33]。盡管在Kumar等的研究中SrUGT76G1基因的轉(zhuǎn)錄水平在GA3處理下并沒有顯著變化[24]，但是鑒于甜菊糖苷與赤霉素共用很長(zhǎng)一段生物合成路徑，赤霉素對(duì)SrUGT76G1基因的表達(dá)調(diào)控還需深入研究。

在Kumar等的研究中發(fā)現(xiàn)甜菊糖苷主要在葉片中積累，尤其是頂部向下第三對(duì)葉，花和莖中含量次之，根中幾乎沒有，甜菊糖苷合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平也有相似的結(jié)果，表現(xiàn)出很強(qiáng)的組織相關(guān)性[24]。通過對(duì)SrUGT76G1啟動(dòng)子順式元件的分析，確實(shí)發(fā)現(xiàn)該序列上存在一些組織特異性表達(dá)元件，且大多是芽特異性表達(dá)相關(guān)的。由于甜菊葉片中糖苷含量在現(xiàn)蕾期達(dá)到最高，開花后逐漸下降[34-35]，我們推測(cè)一些關(guān)鍵基因受生理節(jié)律的調(diào)控。在SrUGT76G1啟動(dòng)子序列中也確實(shí)發(fā)現(xiàn)有生理節(jié)律調(diào)控相關(guān)元件，如：-10PEHVPSBD、CIACADIANLELHC和EVENINGAT。

目前，植物基因工程中常用的啟動(dòng)子仍以CaMV35S為主，CaMV35S是組成型啟動(dòng)子，不表現(xiàn)出時(shí)間或空間的特異性。組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因持續(xù)、穩(wěn)定地表達(dá)，可能會(huì)使植物消耗過多的能量和物質(zhì)，而且在研究中發(fā)現(xiàn)用相同的組成型啟動(dòng)子同時(shí)驅(qū)動(dòng)2個(gè)或2個(gè)以上外源基因的表達(dá)可能引起基因沉默或共抑制[36]；所以克隆甜菊自身基因的啟動(dòng)子，并研究其啟動(dòng)子的功能對(duì)未來甜菊的分子育種具有重要參考價(jià)值。

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