呂紅超，程小果，王 慧，陳申秒*

(1.山東濱州沃華生物工程有限公司，山東濱州 256606；2.山東省動(dòng)物病原微生物工程實(shí)驗(yàn)室，山東濱州 256606)

冠狀病毒(CoVs)作為一種能夠引起人類和動(dòng)物呼吸系統(tǒng)疾病的主要病原，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。特別是在21世紀(jì)以來，冠狀病毒引發(fā)了全球性的嚴(yán)重急性呼吸綜合征[1]和中東呼吸綜合征[2]，更提高了人們對(duì)該類病毒的關(guān)注度。在家禽中，γ冠狀病毒屬的禽類冠狀病毒——傳染性支氣管炎病毒，自1930年首次在美國被發(fā)現(xiàn)以來，一直呈全球性流行，嚴(yán)重威害著國內(nèi)外養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。

雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸性的病毒性傳染病。目前,IB在我國各養(yǎng)雞密集省份及地區(qū)呈地方性流行，給我國的養(yǎng)雞業(yè)造成了重大影響和損失。

1 病原及流行病學(xué)

IBV基因組為一單股、正鏈RNA，編碼多種復(fù)制相關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白和4種結(jié)構(gòu)蛋白，即結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、核衣殼蛋白(N)和小膜蛋白(E)。其中S蛋白可被分成S1和S2兩個(gè)亞單位，該蛋白由于在病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合以及抗原表位的呈現(xiàn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，受到了越來越多的關(guān)注。研究表明大多數(shù)IBV 的血清型抗原決定簇位于S1蛋白，且S1蛋白和N蛋白的基因變異與新的IBV變異株的出現(xiàn)有關(guān)[3]。近幾年的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，IBV的S基因決定了病毒的組織嗜性，但對(duì)病毒的毒力不起決定作用[4]。

IBV作為一種RNA病毒，由于RNA依賴性的RNA聚合酶在轉(zhuǎn)錄過程中缺乏校對(duì)功能以及病毒自身的不連續(xù)轉(zhuǎn)錄機(jī)制，導(dǎo)致病毒極容易發(fā)生變異[5]，從而造就了IBV流行毒株的多樣性。目前，對(duì)IBV毒株的分型主要包括了血清學(xué)分型、基因分型和臨床分型：① IBV的血清學(xué)分型。IBV的血清型眾多，已報(bào)道的達(dá)30種以上，而且還存在大量的變異株。分型方法主要有中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)等。但在新的血清型不斷增多，與之對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)血清需求也不斷增多的情況下，缺乏一個(gè)公認(rèn)的權(quán)威機(jī)構(gòu)可以提供標(biāo)準(zhǔn)化的陽性血清，而且不同的系統(tǒng)及使用者之間缺乏一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，使得血清學(xué)分型的方法在實(shí)際應(yīng)用中越來越顯示其局限性[6]。②IBV的基因分型。主要是通過毒株的S1基因序列進(jìn)行，且因其操作簡便、成本較低、速度快且適合所有毒株(包括新出現(xiàn)的毒株)的分型，目前已得到較為廣泛地應(yīng)用。國內(nèi)流行的IBV主要分為兩大類，共11個(gè)基因型，第1類包括3個(gè)基因型，即Mass型、T型和4/91型；第2類主要包括8個(gè)基因型，即LX4(QX)型、CK/CH/LSC/99 Ⅰ型、CH/CH/LDI/97 Ⅰ型、d/CH/LDT3/03型、LHLJ型、NI/62型、TW-Ⅰ型和TW-Ⅱ型[7]。③ IBV的臨床分型。根據(jù)IBV組織嗜性，將IB分為呼吸型傳支、腎型傳支、腺胃型傳支和生殖型傳支等。其中，腎型傳支在很長一段時(shí)間內(nèi)的發(fā)病比例占據(jù)明顯優(yōu)勢。這種分型方法在臨床判斷IB種類及實(shí)施對(duì)癥治療方案時(shí)有實(shí)用意義，在IBV學(xué)術(shù)研究中應(yīng)用較少。

IBV致病型(臨床型)與IBV毒株血清型/基因型之間并無必然的聯(lián)系，不同血清型或基因型毒株可能屬于相同致病型。同時(shí)，屬于同一血清型或基因型的IBV毒株可能屬于不同致病型。

IBV可感染任何日齡及品種的雞，但主要侵害1周齡～4周齡的雛雞。所有致病性IBV毒株都會(huì)感染雞的呼吸系統(tǒng)。且IBV一旦感染雞就會(huì)在消化道持續(xù)存在，并隨糞便長期向體外排毒。另外，任何IBV毒株感染蛋雞，均會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)蛋量及蛋品質(zhì)下降[8]。IB發(fā)病有較明顯的季節(jié)性，從當(dāng)年的11月份到次年的5月份為高發(fā)時(shí)段[9]。白羽肉雞3周齡～5周齡IBV檢出率最高；商品蛋雞IBV檢出高峰有兩個(gè)時(shí)段，分別為3周齡～5周齡和25周齡～30周齡[10]。該病典型的臨床癥狀主要表現(xiàn)為氣管啰音、打噴嚏，缺乏母源抗體的雛雞會(huì)因呼吸道或腎臟感染造成死亡，母雞若在育雛期間感染IBV，可造成輸卵管的永久損傷，出現(xiàn)“水袋雞”、“假母雞”；產(chǎn)蛋雞感染IBV后，會(huì)引起生產(chǎn)性能的下降，蛋清變得稀薄如水?？傮w來看，IB造成的生產(chǎn)效益的下降較死亡損失更大。

2 國內(nèi)IB流行態(tài)勢

目前IB在國內(nèi)各省份及區(qū)域呈地方性流行，仍然是危害我國養(yǎng)雞業(yè)的主要病原。2016年山東省動(dòng)物病原微生物工程實(shí)驗(yàn)室共計(jì)檢測了近2 000份來自全國各地的禽病料。病原檢測結(jié)果顯示，IBV檢出率占總樣品數(shù)的10.67%(212/1987，結(jié)果未發(fā)表)。

尤永君等[11]對(duì)2010年-2013年我國IBV分離株S1基因分子特性分析發(fā)現(xiàn)，我國IBV分離株主要屬于LX4型，占比90%。宋新宇等[12]對(duì)2012年-2014 年期間國內(nèi)IB的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，LX4(QX)型毒株已經(jīng)成為國內(nèi)主要流行基因型，檢出率占75.06%，其次是Mass型，占5.03%。Zhao W等[13]對(duì)國內(nèi)在1995年-2015年分離的110株IBV毒株進(jìn)行全基因組序列和S1基因序列遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)它們均屬于LX4型毒株；而且1995年-2005年分離株和部分2006年分離株屬于一個(gè)亞分支，剩余2006年分離株和2007年-2015年分離株屬于另一個(gè)亞分支。揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室在2009年-2015 年的流行病學(xué)監(jiān)測中共從全國各地發(fā)病雞群分離鑒定IBV流行株150株，其中QX型毒株105株，占總數(shù)的70.0%，其次是TW-Ⅰ型，占總數(shù)的9.33%[14]。

從以上數(shù)據(jù)可以看出，LX4(QX)型IBV已經(jīng)成為國內(nèi)主要流行基因型。而對(duì)于該型毒株流行的原因目前依然缺少定論，一種比較可靠的假設(shè)認(rèn)為，不同親本病毒間的重組，而非基因突變導(dǎo)致了最初多種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的LX4型毒株的出現(xiàn)，隨后在進(jìn)化過程中，大部分拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)毒株由于不適合在雞體內(nèi)繁殖而被逐漸淘汰，少部分毒株因更適應(yīng)雞體環(huán)境逐漸進(jìn)化成為目前國內(nèi)IBV流行毒株[13]。而目前國內(nèi)流行LX4型毒株間致病性仍然存在較大差異，發(fā)病率為0～100%，病死率為0～80%；但病變主要以腎臟病變?yōu)橹?，大多屬“腎型”毒株。SPF雞免疫攻毒試驗(yàn)、被動(dòng)免疫攻毒試驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查均證明H120等現(xiàn)有疫苗的免疫不能完全保護(hù)該型病毒的攻擊，提示新疫苗研制的必要性和迫切性[15]。

另外，上述研究中，均有極少數(shù)的分離株暫無法歸入目前已知的基因型，可能是新出現(xiàn)的一些變異型毒株。Zhou H等[16]在2016年通過對(duì)一株國內(nèi)IBV分離株CK/CH/2010/JT-1的全基因組序列和S1基因遺傳進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該毒株部分基因組片段分別來自于QX型、CK/CH/LSC/99Ⅰ型、tl/CH/LDT3/03型和4/91型毒株的基因組片段，而且與國內(nèi)其他一些分離株形成了新的獨(dú)立進(jìn)化分支，表明該類毒株是一類新基因型的高毒力重組病毒。結(jié)合LX4型毒株來源于病毒重組的假設(shè)，我們可以推測不同IBV毒株間的重組可能是當(dāng)前新型IBV毒株出現(xiàn)的主要原因，尤其是在實(shí)際養(yǎng)殖環(huán)境中IBV多種基因型共存的情況下，新的重組毒株仍會(huì)不斷出現(xiàn)，給IB的防控帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

3 IB的綜合防控

3.1 良好的生物安全是防控IB的有效方式

對(duì)IB的防控，要采取綜合性的生物安全防控措施。堅(jiān)持定期對(duì)舍內(nèi)外環(huán)境進(jìn)行消毒。IBV對(duì)酸、堿、甲醛、高錳酸鉀等多種消毒劑敏感，在10 mL/L來蘇爾溶液、0.1 g/L高錳酸鉀溶液、10 mL/L福爾馬林溶液、20 g/L氫氧化鈉溶液、700 mL/L乙醇中3 min～5 min即被滅活[17]。此外，改善雞舍環(huán)境，減少雞群應(yīng)激，防止冷應(yīng)激、高濃度氨氣等對(duì)雞呼吸道黏膜的損傷，是防控IB等呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵所在。

3.2 疫苗免疫是目前控制IB最有效的手段

目前使用的IB疫苗，主要是采用減毒活疫苗進(jìn)行噴霧、點(diǎn)眼、滴鼻或者飲水免疫，同時(shí)配合滅活疫苗進(jìn)行注射免疫。

IB 弱毒疫苗主要是由抗原性良好的毒株通過雞胚連續(xù)傳代致弱后制備的凍干疫苗。另外，通過熱處理的方法可以減少病毒在雞胚內(nèi)傳代次數(shù)，達(dá)到致弱病毒的目的[18]。當(dāng)前我國批準(zhǔn)使用的活疫苗主要有2種血清型，常用毒株H120、H52、Ma5、W93、28/86 和M41在基因型上均屬于Mass型；而國內(nèi)2012年批準(zhǔn)上市的LDT3-A株屬于tl/CH/LDT3/03型。

研究表明，用一種IBV活疫苗多次免疫雞只，能夠明顯降低雞只感染異源血清型毒株時(shí)雞體內(nèi)的病毒載量[19]。另外的臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)也表明，接種2種或者更多種不同血清型的IBV弱毒活疫苗可以對(duì)一些流行的異源血清型毒株的攻擊產(chǎn)生廣泛的保護(hù)，這也導(dǎo)致了“保護(hù)型”概念的提出，即利用不同毒株的主要抗原提供交叉保護(hù)。Terregino C等[20]研究發(fā)現(xiàn)，利用Ma5和4/91的組合可以對(duì)QX株的攻擊產(chǎn)生保護(hù)力，但并不能完全阻止雞只的排毒。

因此，面對(duì)國內(nèi)流行毒株(LX4型)與使用疫苗株(Mass型、LDT3-A株)血清型或基因型不一致，且同源性逐年降低[7,15]，導(dǎo)致疫苗保護(hù)效力明顯下降，IB發(fā)病病例日益增多的情況，合理使用組合疫苗進(jìn)行防疫的同時(shí)，尋找一株對(duì)于目前流行毒株免疫譜廣、免疫原性好的新型疫苗株是當(dāng)前防控IBV的關(guān)鍵所在。陳啟穩(wěn)[21]將IBV QXL毒株在雞胚上連續(xù)傳代87代后得到QXL87株，該毒株對(duì)雛母雞的卵巢及輸卵管無損傷，是理想的QX型弱毒疫苗候選毒株。隨后代珊[22]對(duì)QXL87株的致弱機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)IBV的毒力減弱可能不是由單個(gè)氨基酸的突變引起的，而是由多個(gè)基因共同決定的；同時(shí)，病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)在病毒毒力變化中可能發(fā)揮重要作用。霍亞飛等[23]通過對(duì)QX基因型毒株SDZB0808連續(xù)傳100代后的子代病毒P100的研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)3日齡SPF雞無明顯致病性，且毒力致弱與其基因組多個(gè)位點(diǎn)的基因突變和缺失有關(guān)；進(jìn)一步的研究也證明， P100對(duì)SPF雞具有良好的安全性和免疫效力，可以作為QX基因型IBV弱毒疫苗候選株[24]。

體液免疫和細(xì)胞免疫在抵抗IBV感染中幾乎占有同等重要的地位，因此采用弱毒活疫苗與多價(jià)滅活疫苗相結(jié)合的免疫方式，是預(yù)防IB的有效方法[20,25]。目前，國內(nèi)滅活疫苗多以Mass型的M41毒株作為生產(chǎn)用種毒。但對(duì)于IB疫苗而言，在缺少活疫苗基礎(chǔ)免疫的前提下，單獨(dú)應(yīng)用滅活疫苗并不能取得令人滿意的效果。因此，對(duì)于生長周期相對(duì)較短的白羽肉雞等，在飼養(yǎng)周期內(nèi)使用2次弱毒活疫苗免疫接種即可；對(duì)于生長期較長的黃羽肉雞等，飼養(yǎng)期內(nèi)可以進(jìn)行3次左右的活疫苗免疫；而對(duì)于蛋雞或種雞，一般在育雛及育成階段需使用2次～3次活疫苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，在開產(chǎn)前后使用滅活疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫[25]。

近年來，對(duì)以IBV S1基因?yàn)榛A(chǔ)的各種基因工程疫苗，包括核酸疫苗[26]、亞單位疫苗[27]及活病毒載體疫苗[28-29]等的研究及報(bào)道較多，這些疫苗目前雖未得到廣泛應(yīng)用，但因其更有利于批量生產(chǎn)及具有更高的安全性等優(yōu)勢，定會(huì)在將來IB的防控中起到越來越大的作用。

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