李金磊，董 鵬，狄元冉，方忠意，高延玲，周紅霞，吳志明

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南鄭州 450008)

腸球菌原屬于鏈球菌屬，是一種革蘭陽性菌，廣泛分布于植物、地表水、土壤、蔬菜及動物等多種生物，對高溫及惡劣環(huán)境有較強的耐受性[1-2]。腸球菌與多種食源性動物疫病有關(guān)，能引起豬腹瀉，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失，并威脅人的健康[3]。臨床分離的腸球菌中，糞腸球菌約占80%～90%，而屎腸球菌只占5%～10%[4]。糞腸球菌是人和動物腸道中一種重要的條件致病菌，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中常作為益生菌飼料添加劑來調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群。但是，近年來由于抗生素的廣泛使用，在獸醫(yī)臨床研究中，由腸球菌引起的動物疾病也日益增多[5-7]；在人類公共衛(wèi)生安全上，糞腸球菌已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一[8]，我國醫(yī)院分離的病原菌中，糞腸球菌位居前3位[9]。作為可以衡量抗菌藥物耐藥性水平的革蘭陽性指示菌，對豬、雞源糞腸球菌的耐藥性分析和研究具有重要意義，可以為科學(xué)制定抗菌感染防治方案及細菌耐藥性監(jiān)測提供必要的數(shù)據(jù)支持。本試驗從河南省A、B、C、D 4個地區(qū)的規(guī)模化養(yǎng)豬、雞場抽取樣品，對糞腸球菌進行分離、鑒定，隨后進行耐藥性試驗，以期掌握河南省豬、雞源糞腸球菌的耐藥情況，為指導(dǎo)臨床合理用藥和糞腸球菌的控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 腸球菌標(biāo)準菌株ATCC 29212，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 樣品來源 2016年1月至2016年12月抽取河南省A、B、C、D 4個地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場豬、雞肛門拭子樣品480份，具體抽樣數(shù)量見表1。

表1 樣品抽樣數(shù)量統(tǒng)計

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑 革蘭陽性細菌鑒定板，BD公司產(chǎn)品；一次性無菌采樣棒(BHI)，鄭州君越科萊特健康科技有限公司產(chǎn)品；KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂、腦心浸液瓊脂，北京路橋技術(shù)有限公司產(chǎn)品；革蘭陽性細菌藥敏板，天津市金章科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器設(shè)備 低溫可疊放搖床(MaxQ SHKE6000-8CE)，Thermo公司產(chǎn)品；細菌濁度儀，北京中西遠大產(chǎn)品；全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)(BD PhoenixTM-100)；梯度PCR儀(MyCycle)、凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.5 引物 糞腸球菌引物P1：5′-ACTTATGTGACTAACTTAACC-3′，P2：5′-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3′，擴增片段長度為326 bp。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)增菌 將一次性無菌采樣棒采集的樣品盡快送到實驗室，37℃培養(yǎng)16 h～20 h，同時設(shè)陽性和陰性對照。

1.2.2 樣品的分離、純化 取預(yù)增菌菌液1環(huán)～2環(huán)，劃線于KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h±2 h，選取單個典型菌落進行純化，最后將純化好的菌落劃線接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 PCR鑒定 用滅菌棉簽挑取純化好的菌落，加入裝有無菌生理鹽水的1.5 mL離心管中，反復(fù)冷凍煮沸2次～3次，12 000 r/min離心取上清作為PCR擴增模板。同時設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照。

50 μL總反應(yīng)體系為：預(yù)混酶25 μL，ddH2O 18 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，模板5 μL。

反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min；4℃結(jié)束反應(yīng)。同時設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。

PCR結(jié)束后，取8 μL PCR產(chǎn)物，用15 g/L瓊

脂糖進行電泳，15 V/cm電泳20 min～30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3.2 鑒定系統(tǒng)鑒定 對PCR鑒定為糞腸球菌陽性的樣品，采用全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進一步鑒定。

1.2.4 藥敏試驗 取營養(yǎng)瓊脂上經(jīng)鑒定的糞腸球菌菌落，用生理鹽水調(diào)制0.5 MCF，吸取10 μL加入到10 mL肉湯中，然后分別取100 μL加入到96孔藥敏板中，37℃培養(yǎng)16 h～20 h，讀取藥敏試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離結(jié)果

經(jīng)預(yù)增菌培養(yǎng)，KF鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基分離純化，最后經(jīng)PCR及全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定，河南地區(qū)規(guī)?；i、雞場共分離糞腸球菌254株，分離率為52.9%(254/480)，其中豬源糞腸球菌154株，分離率為51.3%(154/300)，雞源糞腸球菌100株，分離率為55.6%(100/180)。具體情況見表2和圖1。

表2 河南省各地區(qū)豬、雞源糞腸球菌分離情況

M.DNA標(biāo)準DL 2 000；P.陽性對照；N.陰性對照；K.空白對照；1～20.樣品

M.DNA Marker DL 2 000;P.Positive control; N.Negative control; K.Blank control;1-20.Samples

圖1河南省豬、雞源糞腸球菌PCR鑒定部分結(jié)果

Fig.1 PCR identification results ofEnterococcusfaecalisisolated from pigs and chickens in Henan province

2.2 藥敏試驗結(jié)果

將分離菌株進行頭孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺異惡唑、紅霉素、替米考星、頭孢噻呋、強力霉素、青霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、氧氟沙星、恩諾沙星、慶大霉素、利萘唑胺、阿莫西林/克拉維酸、萬古霉素等17種抗生素藥物敏感性試驗，分離的254株糞腸球菌對頭孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺異惡唑、紅霉素、替米考星、頭孢噻呋耐藥較嚴重，耐藥率分別為99.14%、98.71%、97.84%、96.12%、93.97%、93.97%、93.10%，對強力霉素(多西環(huán)素)、青霉素耐藥相對嚴重，耐藥率均在80%～90%，對萬古霉素全部敏感。其中豬源糞腸球菌對頭孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、頭孢噻呋、磺胺異惡唑、紅霉素、替米考星、強力霉素等8種抗生素耐藥嚴重，耐藥率均在89%以上，雞源糞腸球菌對克林霉素、泰妙菌素、青霉素、頭孢西丁、磺胺異惡唑、替米考星、紅霉素、頭孢噻呋等8種抗生素耐藥嚴重，耐藥率均在89%以上。具體結(jié)果見表3～表5。

2.3 不同地區(qū)耐藥結(jié)果

不同地區(qū)耐藥結(jié)果存在差異，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，總體來看，A地區(qū)對紅霉素(P<0.05)、替米考星(P<0.05)、復(fù)方新諾明(P<0.01)、慶大霉素(P<0.01)耐藥率明顯高于其他3個地區(qū)，對青霉素(P<0.01)的耐藥率明顯低于其他3個地區(qū)；B地區(qū)對復(fù)方新諾明(P<0.01)的耐藥率明顯低于其他3個地區(qū)；C地區(qū)對氟苯尼考(P<0.05)耐藥率明顯低于其他3個地區(qū)；D地區(qū)對恩諾沙星(P<0.01)的耐藥率明顯低于其他3個地區(qū)。A地區(qū)豬源糞腸球菌對復(fù)方新諾明(P<0.05)、利萘唑胺(P<0.05)、慶大霉素(P<0.01)的耐藥率明顯高于其他3個地區(qū)，對青霉素(P<0.01)的耐藥率明顯低于其他地區(qū)。A地區(qū)雞源糞腸球菌對氧氟沙星(P<0.01)、恩諾沙星(P<0.01)的耐藥率明顯高于其他3個地區(qū)；B地區(qū)雞源糞腸球菌對復(fù)方新諾明(P<0.01)、氟苯尼考(P<0.01)的耐藥率明顯低于其他3個地區(qū)；D地區(qū)雞源糞腸球菌對頭孢噻呋(P<0.01)的耐藥率明顯低于其他3個地區(qū)。具體結(jié)果見表3～表5。

2.4 不同動物來源耐藥結(jié)果

豬、雞源糞腸球菌對頭孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺異惡唑、紅霉素、替米考星、頭孢噻呋的耐藥率均超過88%，不同動物來源糞腸球菌對抗菌藥物的耐藥性存在差異，且具有統(tǒng)計學(xué)意義，豬源糞腸球菌對強力霉素(P<0.05)、氟苯尼考(P<0.01)、復(fù)方新諾明(P<0.01)、利萘唑胺(P<0.01)的耐藥率明顯高于雞源糞腸球菌，對青霉素(P<0.01)、氧氟沙星(P<0.01)、恩諾沙星(P<0.01)的耐藥率明顯低于雞源糞腸球菌。具體結(jié)果見表3～表5。

表3 河南省4個地區(qū)動物源糞腸球菌對17種抗菌藥物的耐藥結(jié)果

表4 河南省4個地區(qū)豬源糞腸球菌對17種抗菌藥物的耐藥結(jié)果

表5 河南4個地區(qū)省雞源糞腸球菌對17種抗菌藥物的耐藥結(jié)果

2.5 多重耐藥結(jié)果

總體來說，河南省糞腸球菌對7類及7類以上抗菌藥物耐藥率超過91%，豬源糞腸球菌對7類及7類以上抗菌藥物耐藥率超過89%，雞源糞腸球菌對7類及7類以上抗菌藥物耐藥率為94%；其中對9類抗菌藥物的多重耐藥菌株所占的比重最多，總體、豬源、雞源分別為35.43%、34.42%和37.00%。具體結(jié)果見表6。

表6 河南省動物源糞腸球菌多重耐藥結(jié)果

3 討論

近年來，腸球菌已成為醫(yī)院獲得感染的主要病原菌之一，通過天然和獲得的多重耐藥性，多重耐藥性在腸球菌中已普遍存在，并且變得日益嚴重，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成極大威脅[10]。需進一步提高人畜共患菌及動物源細菌的耐藥性監(jiān)測平臺[11]。

本研究通過對河南省規(guī)模化豬場、雞場的糞腸球菌進行分離純化、鑒定及耐藥性試驗，共分離糞腸球菌254株，分離率52.90%(254/480)，其中雞源高于豬源，分離率分別為55.60%(100/180)和51.30%(154/300)。這一結(jié)果比幸文定[12]研究的江西省7個地區(qū)總分離率64.80%要高，比蘇崴藝等[13]從遼寧省雞場分離率為24.0%和Woods S E等[14]從獼猴中的分離率為33.33%(15/45)要高。表明不同動物來源、不同地區(qū)糞腸球菌分離率存在差異。

分離的254株糞腸球菌對頭孢西丁、克林霉素、泰妙菌素、磺胺異惡唑、紅霉素、替米考星、頭孢噻呋的耐藥率均超過90%。其中豬源糞腸球菌對氟苯尼考耐藥率比雞源高出60%以上，對復(fù)方新諾明、利萘唑胺的耐藥率比雞源高出20%以上；雞源糞腸球菌對青霉素、氧氟沙星、恩諾沙星的耐藥率比豬源高出20%以上，這種差異明顯與動物種類及不同動物用藥偏好有關(guān)，這一結(jié)果與商軍等[15]研究一致。多重耐藥嚴重，分離的糞腸球菌對7類及7類以上抗菌藥物耐藥率超過91%，比商軍等的研究偏高，表明河南省糞腸球菌的多重耐藥已相當(dāng)嚴重。

從本次試驗結(jié)果看，河南省豬、雞源性糞腸球菌耐藥現(xiàn)象已相對較為嚴重、且多重耐藥嚴峻，豬、雞源糞腸球菌耐藥率存在差異，在今后的管理過程中，應(yīng)根據(jù)不同養(yǎng)殖類型指導(dǎo)養(yǎng)殖企業(yè)選擇合理藥物，改善養(yǎng)殖環(huán)境，不斷加強動物源細菌耐藥性的監(jiān)測，進一步控制動物源細菌耐藥性的產(chǎn)生。

參考文獻：

[1] Pissetti C,Campos T,Werlang G O,et al.Antimicrobial resistance inEscherichiacoliandEnterococcussp.isolated from swine carcasses at the pre-chill stage[Z].Safepork Proc，2013:203-206.

[2] Tremblay C,Letellier A,Quessy S,et al.Antibiotic-resistantEnterococcusfaecalisin abattoir pigs and plasmid colocalization and cotransfer of tet (M) and erm (B) genes[J].J Food Prot,2012,75(9):1595-1602.

[3] Nam H M,Lim S K,Moon J S,et al.Antimicrobial resistance of enterococci isolated from mastitic bovine milk samples in Korea[J].Zoonoses and Public Health,2009,57(7-8):e59-e64.

[4] Beshiru A,Igbinosa I H,Omeje F I,et al.Multi-antibiotic resistant and putative virulence gene signatures inEnterococcusspecies isolated from pig farms environment[J].Microb Pathog，2017,104:90-96.

[5] 孟憲祥，曹延忠，郭 麗．5年腸球菌分布及耐藥性變遷分析[J]．醫(yī)學(xué)檢驗與臨床，2012，23(3)：37-38．

[6] 王潭楓，符振華．醫(yī)院感染不動桿菌和腸球菌的分離及耐藥性調(diào)查分析[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2011，23(11)：1020-1021，1025．

[7] 王亞賓，張 祥，胡清林，等．仔豬關(guān)節(jié)炎糞腸球菌生物學(xué)特性研究[J]．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，45(2)：183-187．

[8] 朱 娜，方 超，周成捷，等．湖南省豬源腸球菌的分離鑒定[J]．湖南畜牧獸醫(yī)，2016(2)：41-44．

[9] 李金平，陳 杰，莊青葉．麻雞源性糞腸球菌的分離及初步鑒定[J]．中國動物檢疫，2011，28(7)：61-61，64．

[10] 劉永安，李學(xué)瑞，周建華，等．一株羊源致病性屎腸球菌的分離鑒定及耐藥性分析[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2017，44(2)：530-537．

[11] Usui M,Tagaki C,Fukuda A,et al.Use ofAeromonasspp.as general indicators of antimicrobial susceptibility among bacteria in aquatic environments in Thailand[J].Front Microbiol，2016,7 (710):1-7.

[12] 幸文定．江西部分地區(qū)豬源糞腸球菌耐藥性及毒力基因檢測與分析[D]．江西南昌：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016．

[13] 蘇崴藝，李欣南，韓鐫竹．某養(yǎng)殖場雞源糞腸球菌分離鑒定及耐藥性研究[J]．現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014(4)：48-50．

[14] Woods S E,Lieberman M T,Lebreton F,et al.Characterization of multi-drug resistantEnterococcusfaecalisisolated from cephalic recording chambers in research macaques (Macacaspp.)[J].PLoS One,2017,12(1):e0169293.

[15] 商 軍，顧 欣，張文剛，等．豬、雞源分離糞腸球菌的核糖體分型及耐藥性分析[J]．中國抗生素雜志，2017，42(3)：230-236．