張姍姍,冷　雪,時　坤,李健明,宮慶龍,劉　藝,孫志博,劉亞東,杜　銳

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春 130118)

豬偽狂犬病(Porcine pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的以仔豬神經(jīng)系統(tǒng)紊亂和高死亡率、育肥豬呼吸障礙和生長緩慢以及母豬繁殖障礙等為主要特征的病毒性傳染病。PRV有廣泛的宿主范圍，可感染多種哺乳動物，豬是PRV的天然宿主和重要的傳染源[1]。PRV基因組是雙鏈線性DNA，約143 kb，含有70個開放閱讀框，具有很強的遺傳穩(wěn)定性[2]。GC含量高達(dá)70%以上，是皰疹病毒中GC含量最高的。其基因組包括獨特的長區(qū)段(UL)、短區(qū)段(US)及兩側(cè)的末端重復(fù)序列(TR)和內(nèi)部重復(fù)序列(IR)。病毒基因組至少包括70個基因，可以編碼70種～100種病毒蛋白，其中多數(shù)基因是病毒復(fù)制非必需的。病毒增殖必需的糖蛋白主要有g(shù)L、gD、gB、gK、gH；非必需糖蛋白主要包括gG、gE、gC、gI、gM和gN等[3]。PRV毒力受多個基因編碼蛋白的影響，如gE、gC、gI、gD、gB、gH、TK、PK及RR等，刪除或者缺失這些基因可以顯著降低PRV毒力。

1　豬偽狂犬病的流行情況

1813年偽狂犬病最早發(fā)現(xiàn)于美國，1902年匈牙利學(xué)者Aujeszky首次報道該病病原是一種不同于狂犬病病毒的新病毒；該病毒1931年由美國科學(xué)家Shope從牛體內(nèi)分離，1934年Sabin等證實該病病原屬于皰疹病毒。隨后該病在很多養(yǎng)豬國家均有發(fā)生，主要出現(xiàn)于南美洲、亞洲和歐洲等豬群密集地區(qū)，僅在挪威、芬蘭和馬耳他地區(qū)沒有偽狂犬病病毒感染的報道，而在奧地利、瑞典、丹麥、英國、加拿大和新西蘭以及美國等地區(qū)PRV已經(jīng)根除[4-5]。

中國于20世紀(jì)50年代首次報道豬偽狂犬病的暴發(fā)，自20世紀(jì)80年代以來，從匈牙利引進(jìn)的Bartha-K61疫苗廣泛應(yīng)用于中國，該疫苗具有較好的免疫原性，相對有效的控制了豬偽狂犬病發(fā)生[6]。然而，近幾年來，隨著國內(nèi)豬場養(yǎng)殖密度提高及環(huán)境的變化，PR的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，并出現(xiàn)新的流行特點：流行范圍廣，國內(nèi)多個省份的PRV野毒感染嚴(yán)重；多數(shù)規(guī)模化豬場突發(fā)，蔓延迅速，疫情嚴(yán)重。不同日齡階段的豬均可感染，尤以母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和新生仔豬典型的神經(jīng)癥狀為主要特征，發(fā)病率和病死率顯著升高[7-8]，育肥豬呼吸道癥狀嚴(yán)重常繼發(fā)其他病原混合感染，造成呼吸綜合征；傳播方式多樣化，除了主要的空氣傳播，還有通過帶毒豬排毒的水平傳播和胎盤垂直傳播；多種動物易感PRV；現(xiàn)有疫苗保護(hù)效果不佳，此次PR的暴發(fā)主要發(fā)生在許多傳統(tǒng)疫苗免疫接種的豬場。

尤以2011年底以來，國內(nèi)各地區(qū)突然暴發(fā)PR，迅速傳播，多數(shù)豬場PRV感染率或gE抗體陽性率增加20%～50%[9]，逐年上升，更加難以控制，對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的影響。全炎銘等[10]對2011年—2016年北京地區(qū)PRV野毒感染情況研究表明，2011年以前感染率較低，從2012年開始迅速上升，2013年P(guān)RV野毒抗體陽性率上升到38.99%，而2016年則達(dá)到最高40.08%。李琰[11]采用PRV-gE抗體ELISA對2015年—2016河南地區(qū)某豬場血液樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果不同發(fā)育階段豬群檢測的PRV-gE抗體陽性率具有較大的差異，以種母豬陽性率最高達(dá)68.99%，而育肥豬和種公豬分別為44.07%和39.68%，仔豬和保育豬分別為12.92%和27.66%，這表明種豬引進(jìn)時帶毒且持續(xù)存在，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。黃曉慧等[12]對2012年—2015安徽省不同規(guī)模化豬場的血清樣品進(jìn)行PRV抗體檢測，表明血清陽性率逐年上升，2015年最高達(dá)26,61%；另外豬場總陽性率為41.96%，其中育肥豬和母豬高達(dá)31.02%和27.46%，表明該地區(qū)豬群帶毒豬持續(xù)存在，導(dǎo)致PRV感染嚴(yán)重。黨占國等[13]對2012年—2015年河南地區(qū)的豬場進(jìn)行PRV野毒抗體檢測，結(jié)果表明，PRV gE抗體陽性率不斷上升，尤其2015年血清陽性率達(dá)70.24%，說明近4年內(nèi)PRV感染率呈逐年增長趨勢，成為國內(nèi)豬場疫病防控的一個難點。王金濤等[14]對2015年遼寧省3個規(guī)?；i場的血清樣品進(jìn)行PRV抗體檢測，其中豬場2和豬場3 PRV野毒感染較嚴(yán)重，感染率分別達(dá)到56%和78%，表明遼寧省不同規(guī)模化豬場PRV野毒感染普遍存在，應(yīng)加強PR的防控工作。楊珊珊等[15]采用ELISA對2016年江蘇省不同規(guī)?；i場的血清樣品進(jìn)行檢測，豬場PRV野毒抗體陽性率為94.6%，其中公豬野毒感染陽性率55%，后備母豬野毒感染陽性率達(dá)69.4%，經(jīng)產(chǎn)母豬野毒陽性率為44%，表明PR在江蘇省流行廣泛，野毒感染嚴(yán)重，尤其種豬群感染較嚴(yán)重，應(yīng)加強引種檢測及疫苗免疫等措施。以上調(diào)查結(jié)果均表明國內(nèi)多個省份的PRV野毒感染率大幅度升高，并呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

1.1　豬偽狂犬病病毒流行變異株的致病性

1.1.1臨床癥狀PRV流行變異毒株感染豬后，不同階段的感染豬都呈顯性感染，表現(xiàn)不同的臨床癥狀，感染母豬流產(chǎn)，哺乳仔豬、生長育肥豬均表現(xiàn)高熱、呼吸困難及神經(jīng)癥狀等，發(fā)病率和病死率均高。其中以母豬產(chǎn)死胎以及伴有神經(jīng)系統(tǒng)障礙的弱仔豬死亡等為主要特征，表現(xiàn)為妊娠母豬發(fā)生整窩流產(chǎn)、死胎，產(chǎn)仔數(shù)減少；新生仔豬則呈現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、抽搐、四肢劃水等神經(jīng)癥狀。

1.1.2病理變化流行變異毒株感染豬后，剖檢呈現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化，如腦膜充血、出血水腫，腦脊液增多；肝臟和脾臟有黃白色壞死結(jié)節(jié)，扁桃體和肺水腫，淋巴結(jié)和腎臟出血等典型的病理變化，尤其是哺乳仔豬發(fā)生病毒性心肌炎時，心肌變性呈灰色，甚至心肌壞死。

1.1.3疫苗保護(hù)效果李冬寶等[16]進(jìn)行的免疫保護(hù)試驗中，Bartha-K61疫苗對感染PRV經(jīng)典SC毒株能提供有效保護(hù)，而對感染新型變異株TJ株不能提供完全的保護(hù)，與SC經(jīng)典株相比，其變異株致病性增強。該試驗表明，傳統(tǒng)Bartha-K61疫苗不能對中國現(xiàn)流行的新型PRV變異株的感染提供有效的保護(hù)，新分離的PRV變異毒株毒力可能發(fā)生變化。Yang Q Y等[17]進(jìn)行的致病性試驗表明，新型PRV變異株HN1201毒力明顯強于經(jīng)典Fa毒株。雖然接種傳統(tǒng)疫苗有助于預(yù)防疾病，但并不能妨礙野生型強毒株的感染。毒力變化可能與傳統(tǒng)疫苗免疫豬場再次暴發(fā)偽狂犬病有關(guān)。

1.2　豬偽狂犬病病毒流行變異株的抗原性差異

楊文萍等[18]血清抗體檢測結(jié)果顯示，與傳統(tǒng)毒株LA株間的中和效價明顯高于新流行毒株ZJ01之間的中和效價，其變異系數(shù)為0.279～0.413，表明國內(nèi)分離的新型流行變異毒株抗原性發(fā)生較大的變異。屈鋒等[19]采用中和試驗進(jìn)行血清學(xué)檢測，Bartha-K61免疫接種豬產(chǎn)生的中和抗體水平較低，而對新分離的病毒接種豬血清產(chǎn)生的抗體水平較高，表明當(dāng)前流行的PPV變異毒株和疫苗株之間抗原性上存在一定的差異。因此，抗原差異也可能是導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗免疫豬群再次暴發(fā)偽狂犬病的原因。

1.3　豬偽狂犬病毒流行變異株的分子特征的差異

近幾年，通過對PRV的毒力相關(guān)和抗原基因的序列分析，發(fā)現(xiàn)我國各省分離的PRV流行毒株與國外分離的其他毒株存在明顯的差異。Ye C等[20]系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，國內(nèi)新流行毒株與亞洲分離PRV毒株屬于同一基因型，處于一個相對獨立的分支，親緣關(guān)系較近，而歐美PRV毒株屬于另一基因型，親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。由此表明，國外經(jīng)典毒株為基因Ⅰ型，國內(nèi)流行株為基因Ⅱ型，這可能是導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗對流行毒株保護(hù)效果不理想的原因。姜平[21]表明，新暴發(fā)的PR的病原在原PRV的基礎(chǔ)上發(fā)生了重組變異，形成了新的強毒株，與以前的PRV流行毒株相比，新流行毒株在基因和蛋白水平上發(fā)生了變異，包括大多數(shù)病毒蛋白發(fā)生的堿基替換、插入和缺失。據(jù)陳秋勇等[22]和Fan J等[23]報道，關(guān)于PRV各基因氨基酸變異位點分析，發(fā)現(xiàn)PRV變異株gE基因與國內(nèi)外其他毒株的gE基因有2個明顯氨基酸變異位點。即第48位點插入1個天冬氨酸(D)，第496位點亦插入1個天冬氨酸(D)。此外，糖蛋白gB在75-77處有3個氨基酸的缺失，在94處有1個氨基酸的插入。糖蛋白gD在278-279處插入2個氨基酸。糖蛋白gI在172位缺失1個氨基酸,在238位插入1個氨基酸。糖蛋白gC在63-67位插入7個氨基酸(AAASTPA)，還有UL2、UL5、 UL12、UL13、UL50及IE180等基因都有氨基酸插入等變化。以上表明PRV新流行毒株的多個毒力相關(guān)基因和抗原基因發(fā)生了變異，導(dǎo)致其毒力和抗原性發(fā)生差異。綜上所述，與經(jīng)典毒株相比，PRV變異毒株毒力增強與抗原變異使傳統(tǒng)Bartha-K61疫苗在抵抗強PRV毒株入侵時，不能足以提供完全的保護(hù)，這可能是導(dǎo)致其免疫豬場再次發(fā)生豬偽狂犬病的主要原因。

2　豬偽狂犬病疫苗的應(yīng)用

疫苗免疫接種是控制偽狂犬病最重要的措施。早期常規(guī)疫苗主要是滅活和傳統(tǒng)弱毒活疫苗，這兩種疫苗在防控PR方面起到了一定作用。但滅活疫苗免疫效率低，成本高且用量大；傳統(tǒng)弱毒活疫苗安全性差，有恢復(fù)毒力的潛在危險。因此，為防止偽狂犬病病毒的感染，許多基因工程疫苗已經(jīng)陸續(xù)開發(fā)，包括亞單位疫苗、核酸疫苗、基因重組載體疫苗以及基因缺失疫苗，其中基因缺失弱毒疫苗己經(jīng)相對成熟，其他基因工程疫苗尚處于研究階段。

2.1　基因工程疫苗

2.1.1亞單位疫苗國內(nèi)Ye L L等[24]制備的ISCOM亞單位疫苗100 LD50劑量的PRV閩A株攻毒保護(hù)率為100%。Marchioli等將PRV保護(hù)性抗原基因gD克隆pSV2dhfr 載體免疫接種豬，誘導(dǎo)豬產(chǎn)生中和抗體以抵抗PRV強毒株的攻擊。gD在痘苗病毒啟動子P7.5控制下的TK基因位點高效表達(dá)。亞單位疫苗安全性高、性能穩(wěn)定、便于運輸和保存；同時還可以減少或消除早期常規(guī)疫苗難以避免的各種有害的反應(yīng)原。但是制作成本高，免疫原性效果較差，臨床應(yīng)用受到限制。

2.1.2核酸(DNA)疫苗Xiao S等[25]研究了結(jié)合Semliki forest病毒(SFV)復(fù)制子并表達(dá)偽狂犬病病毒(PRV)的糖蛋白C(gC)的自殺DNA疫苗(pSFVC1.5)。Montail等構(gòu)建了含PRV gD基因的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA疫苗，接種仔豬顯示,未免疫仔豬和免疫仔豬均能夠產(chǎn)生中等程度的中和抗體。gD基因在SV40早期啟動子控制下,構(gòu)建的重組質(zhì)?？烧T導(dǎo)gD抗體產(chǎn)生,保護(hù)小鼠免遭PRV強毒的致死攻擊。核酸疫苗免疫能克服PRV潛在感染，激發(fā)細(xì)胞免疫,安全性高，無病原微生物，操作簡單,成本低廉。雖然免疫疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的抗體，但對某些強毒的攻擊僅能起到部分保護(hù)性，仍不能完全阻止野毒入侵，應(yīng)用上也受一定的限制。

2.1.3PRV重組活載體疫苗目前國內(nèi)已報道重組偽狂犬病病毒活載體疫苗主要有表達(dá)CSFV的E2基因、表達(dá)FMDV的VP1基因、表達(dá)JEV的NS1基因，以及表達(dá)PRRSV的GP5基因的重組偽狂犬病病毒。Lei J L等[26]以rPRVTJ-delgE/gI/TK作為弱毒疫苗載體構(gòu)建了rPRVTJ-delgE/gI/TK-E2，具有安全性，對TJ的攻擊可提供保護(hù)。Wang Y M等[27]構(gòu)建了表達(dá)CSFV的E2基因的新的重組PRV變體(rPRVTJ-delgE/gI-E2)，對豬只檢測的抗PRV和抗CSFV中和抗體是安全的，并且通過PRV TJ毒株或CSFV毒株提供了完全保護(hù)，免受致死性攻擊。因此，該疫苗基因組大，能容納較大的外源基因，安全性好，免疫原性持久，宿主范圍廣，該疫苗還可以減少給動物機體帶來的應(yīng)激，以及加強免疫程序，能節(jié)約成本。該類疫苗的應(yīng)用可以作為兩種或兩種以上病毒共感染的二價或三價候選疫苗，為疫病防控提供良好的發(fā)展前景。

2.2　基因缺失疫苗的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)技術(shù)與基因工程技術(shù)日益成熟，基因缺失疫苗的研制成為重要研究的熱點。多數(shù)PRV基因缺失株是以其毒力基因以及部分囊膜糖蛋白為主進(jìn)行缺失如TK、PK、RR、gG、gE、gC、gD和gI等基因。目前國內(nèi)外已構(gòu)建出多種基因缺失疫苗，有如單基因、雙基因和多基因缺失疫苗，對于豬偽狂犬病的控制和根除起著有效的作用。

2.2.1基因缺失疫苗基因缺失疫苗是當(dāng)前基因工程疫苗研究的重要方向之一。國內(nèi)外許多學(xué)者研制了基因缺失苗，如Zhu L等[28]構(gòu)建了TK/gE、TK/gC、TK/gG雙基因缺失疫苗株及gE/gI/TK三基因缺失等。He Q G等[29]構(gòu)建了PRV Ea株的TK/gG 、TK/gE等雙基因缺失疫苗株。Kit S等[30]構(gòu)建出PRV的TK基因缺失疫苗株以及PRV TK/gC雙基因缺失疫苗株。PRV基因缺失疫苗株的成功研制，為今后PRV基因工程疫苗的研制打下了良好的基礎(chǔ)，同時結(jié)合相應(yīng)的ELISA檢測方法，使得PRV基因缺失疫苗在大多數(shù)國家豬偽狂犬病的根除計劃中起著關(guān)鍵的作用。

2.2.2單基因缺失疫苗第一代基因缺失疫苗是以PRV BUK疫苗株為親本，構(gòu)建出PRV的TK基因缺失的PRV BUK-dl3株，該缺失株于1986年被美國批準(zhǔn)上市。之后，國內(nèi)研究者也逐漸構(gòu)建出許多基因缺失株，如一些缺失株TK、gE、PK、gD、gG、RR等毒力和抗原性基因的缺失，但由于單個基因的缺失，不能有效的區(qū)分人工免疫和自然感染動物或出現(xiàn)毒力返強現(xiàn)象，所以目前對于單個基因缺失的應(yīng)用有所限制，需要在此基礎(chǔ)上再缺失其他相應(yīng)的基因。

2.2.3雙基因與多基因缺失疫苗在第一代基因缺失疫苗的基礎(chǔ)上，Kit等在PRV BUK-dl3株的基礎(chǔ)上構(gòu)建了PRV TK/gC雙基因缺失疫苗株，該疫苗可用來區(qū)分自然感染和免疫動物。此后，Moormann等構(gòu)建了TK/gI雙基因缺失疫苗株。陳煥春等構(gòu)建了PRV Ea TK-/gG-、TK-/gE-疫苗株，其中TK-/gG-雙基因缺失疫苗株(HB-98)，2006年獲得國家新獸醫(yī)藥注冊證書。郭萬柱等構(gòu)建了PRV閩A株TK-/g-、TK-/gE-、TK-/gG-雙基因缺失株以及gE/gI/TK三基因缺失疫苗株(SA215)， 2003年獲得國家新獸藥證書，它是中國第一個基因工程疫苗。此外，一些研究者也構(gòu)建了其他多基因缺失株，如Mettenleiter等構(gòu)建了gC-/gE-/gI-/gG-和gD-/gE-/gI-/gG-四基因缺失疫苗株。近年來由于新PRV發(fā)生變異，導(dǎo)致這些疫苗的保護(hù)效力不足以抵抗變異毒株的攻擊，因此，必須針對變異毒株進(jìn)行新型疫苗的研究。

2.2.4流行變異株的基因缺失疫苗Gu Z等[31]利用BAC克隆技術(shù)在PRV ZJ01株基礎(chǔ)上構(gòu)建的的VZJ01△gE/gI雙基因缺失疫苗株，免疫試驗表明，該缺失疫苗對變異株ZJ01的攻擊可提供完全保護(hù)。Wu T等[32]以JS-2012株為親本，構(gòu)建了JS-2012-△gE/gI雙基因缺失株，試驗表明該缺失株對于新型毒株JS-2012可提供完全保護(hù)。Cong X等[33]在rPRV TJ-delgE/gI缺失株基礎(chǔ)上構(gòu)建gE/gI/TK三基因缺失疫苗株，試驗表明對于新型毒株TJ的攻擊能提供完全保護(hù)，與rPRV TJ-delgE/gI相比更具有安全性。Zhang C等[34]利用BAC克隆技術(shù)構(gòu)建了的TK/gE/gI三基因缺失疫苗株，動物試驗表明可產(chǎn)生特異性抗體，且對新型毒株的攻擊可提供完全保護(hù)。這些疫苗都證明能夠使免疫豬抵抗新型PRV變異株的攻擊，以提供有效的免疫保護(hù)，可作為有效的候選疫苗。這類基因缺失疫苗的成功研制，在豬偽狂犬病預(yù)防和控制中具有非常重要意義。

3　小結(jié)與展望

近年來，多數(shù)PR陰性豬場野毒感染情況嚴(yán)重并呈大幅度上升，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。由于豬偽狂犬病病毒變異毒株毒力增強和抗原變異，是導(dǎo)致豬偽狂犬病再次暴發(fā)的主要原因[35-36]；其次，豬群感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒等[37]免疫抑制性病毒，使豬群對其他病原的抵抗力降低，導(dǎo)致疫苗免疫效力降低；再者，豬是PRV主要的儲存宿主，潛伏感染易被忽視而導(dǎo)致長期體內(nèi)帶毒和排毒，尤其在引種過程時未進(jìn)行嚴(yán)格檢疫，造成豬群有野毒的存在；豬群免疫不到位，免疫程序不合理、疫苗選擇不科學(xué)或疫苗質(zhì)量差、免疫劑量使用不當(dāng)?shù)纫蛩匾矔?dǎo)致機體的免疫應(yīng)答減弱，從而造成免疫失敗。由于傳統(tǒng)的豬偽狂犬病疫苗對新型PRV變異毒株不能提供有效的保護(hù)，并存在一定的安全隱患，控制和根除豬偽狂犬病仍是必須努力的方向。因此，迫切需要研制一種針對當(dāng)前PRV流行變異毒株的新型疫苗，以防控新變異毒株的流行。此外，豬場也要實施有效的免疫方案，加強飼養(yǎng)管理和生物安全的管理措施，以減少混合感染及豬群內(nèi)野毒感染率。

隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷探索和創(chuàng)新，對于豬偽狂犬病新型疫苗的研究，將會有越來越多的基因工程疫苗應(yīng)用于生產(chǎn)中?？偠灾?，研制無致病性、無潛伏感染、安全有效的新型高效疫苗，是今后研究的主要方向，為實現(xiàn)豬偽狂犬病凈化和根除的計劃提供技術(shù)支撐。