姚　莉，蔣愛民，楊承鴻，李淑紅

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510400；2.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院生物技術(shù)系，廣東廣州 510430)

原發(fā)性肝癌是指發(fā)生于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，是臨床上最常見的惡性腫瘤之一[1]。據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肝癌發(fā)病率居惡性腫瘤第4位，死亡率居第3位[2]。目前在腫瘤化療過程中，抗癌藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，對正常細(xì)胞的增殖也有殺傷作用，因而化療療效受到限制。目前，國內(nèi)外許多研究表明，烏龍茶具有調(diào)節(jié)機體免疫、抗病毒、保肝、抗氧化等藥理作用，尤其是其抗腫瘤活性日益受到關(guān)注[3]。高分子量烏龍茶多糖、多酚是烏龍茶提取物中的主要活性成分，對動物移植性腫瘤具有抑制作用，可使腫瘤質(zhì)量減輕、體積減小，生存時間得以延長[4]。倪德江等[5]研究發(fā)現(xiàn)，茶多糖具有清除·OH和O2-·自由基能力，且多糖的結(jié)構(gòu)對其生物活性產(chǎn)生很大的影響，Chen H等[6]研究發(fā)現(xiàn)，多糖組成及其分子質(zhì)量分布與其抗氧化活性有很大關(guān)系；Lu Y R等[7]研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚的抗癌作用主要是通過清除自由基、抑制促癌酶的代謝過程、改變線粒體通透性等多種途徑發(fā)揮抗癌作用；王振云等[8]發(fā)現(xiàn)，茶多酚還可以通過激活內(nèi)部線粒體途徑促進腫瘤細(xì)胞的凋亡，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而起到抗癌作用。因此本研究主要是以人肝癌細(xì)胞HepG2為試驗對象，應(yīng)用四氮甲唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試驗和流式細(xì)胞儀等技術(shù)，研究高分子量烏龍茶多糖、多酚對腫瘤細(xì)胞的生長、增殖的抑制作用，以及兩者協(xié)同作用對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，為腫瘤臨床治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1試劑高分子量烏龍茶多糖(相對分子量8.877×104，純度≥93%)、多酚(純度≥95%)，吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院研制；四氮甲唑藍(lán)(MTT )，Sigma公司產(chǎn)品；RPM 1-1640培養(yǎng)基，Nissui日本日水公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。人肝癌 BEL-7404細(xì)胞株，由中國科學(xué)院細(xì)胞研究所引入；肝癌HepG2細(xì)胞，購自上海漢博生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器流式細(xì)胞儀(BD Biosciences FACSAria III ，USA)、全自動酶標(biāo)儀(WD-2102A 3350 630 nm)。

1.2　方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞，用50 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。每24 h～48 h傳代1次?？刂萍?xì)胞密度為2×105個/mL，加藥時稀釋培養(yǎng)液，加入無血清BRMI 1640配制成的各組含藥培養(yǎng)液200 μL，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱共孵育48 h，監(jiān)測各項指標(biāo)。

1.2.2分組方法將2×105個/mL細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分為3個組：(1)對照組；(2)烏龍茶多糖單獨用藥組：每孔加入不同濃度的烏龍茶多糖(50、100、200、400、800 μg/mL)；(3)多酚單獨用藥組：每孔加入不同濃度的多酚(50、100、150、200、250 μg/mL)；(4)烏龍茶多糖與多酚聯(lián)合用藥組：每孔加入經(jīng)(2)和(3)篩選出的烏龍茶多糖與多酚的最佳濃度。其中每組做6個重復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h。

1.2.3MTT法檢測細(xì)胞抑制率將1.2.2中每組加入MTT 20 μL/孔(5 mg/mL)3 h，測定前棄去上清液后加入溶解液100 μL/孔。置漩渦振蕩器5 min，待紫色顆粒溶解之后,用全自動酶標(biāo)儀測定每孔光密度，計算細(xì)胞生長抑制率，試驗重復(fù)6次。細(xì)胞抑制率計算公式為：

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率參照文獻[9-10]，樣品處理同上，在藥物作用不同時間收集細(xì)胞。用PBS液洗2次，加入700 mL/L(V/V)冷乙醇，4℃固定24 h以上，隨后清洗細(xì)胞加入PI染液，孵育30 min，進行DNA染色，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡率。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)處理通過Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)處理，采用Origin8.0軟件作圖，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對測定指標(biāo)進行單因素方差分析，顯著性水平為P<0.05。

2　結(jié)果

2.1　單獨用烏龍茶多糖對肝癌細(xì)胞的抑制作用

烏龍茶多糖對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響見表1。由表1可見，隨著烏龍茶多糖濃度的提高，細(xì)胞培養(yǎng)液的光密度OD值逐漸降低，對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制率也逐步的提高。當(dāng)烏龍茶多糖濃度達到800 μg/mL時，其對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制率為38.31%，約為濃度為50 μg/mL時抑制作用(7.94%)的5倍，抑制作用顯著提高(P<0.05)。這可能是由于烏龍茶多糖具有具有清除·OH和O2-·自由基的能力，可明顯降低肝臟腫瘤發(fā)生前的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶胎盤類型陽性病灶的數(shù)量和體積，且烏龍茶多糖還具有抗氧化作用以及改變代謝酶類的作用，因而隨著烏龍茶多糖濃度的提高，抗氧化以及自由基清除分子增加，產(chǎn)生抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖作用。

2.2　單獨用多酚對肝癌細(xì)胞的抑制作用

多酚對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響見表2。由表2中可見，隨著多酚濃度的提高，細(xì)胞培養(yǎng)液的光密度OD值逐漸降低，說明隨著多酚濃度的提高，肝癌細(xì)胞HepG2增殖所受到的抑制作用也越強。多酚濃度在0～150 μg/mL范圍內(nèi)，多酚濃度的增加可顯著(P<0.05)提高對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用，而當(dāng)多酚濃度超過150 μg/mL后，肝癌細(xì)胞HepG2增殖所受到的抑制作用增加不顯著(P>0.05)。這可能是由于茶多酚為非細(xì)胞毒類藥物，其主要成分是復(fù)合兒茶素，具有很強的抗氧化作用，能夠有效防止自由基對DNA大分子的損傷和脂質(zhì)過氧化作用，也可能是由于茶多酚通過調(diào)控基因，抑制與癌發(fā)生相關(guān)基因的表達，誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡等作用，達到防癌和抗癌的作用[11]。多酚濃度在0～150 μg/mL范圍內(nèi)，隨著多酚濃度的不斷提高，細(xì)胞培養(yǎng)液中所接觸的多酚有效抗癌成分增加，因而使得肝癌細(xì)胞HepG2增殖受到的抑制作用增強。而當(dāng)多酚濃度超過150 μg/mL后，繼續(xù)增加濃度，肝癌細(xì)胞HepG2與多酚分子抗癌之間的接觸達到飽和狀態(tài)，因而不能顯著增加抑制作用(P>0.05)。

表1　烏龍茶多糖對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

表2　多酚對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

注：角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：The same letters indicate no significant difference in the same column(P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

2.3　烏龍茶多糖與多酚對肝癌細(xì)胞的協(xié)同抑制作用

由上述試驗結(jié)果，選取空白對照組、烏龍茶多糖組(烏龍茶多糖濃度為400 μg/mL)、烏龍茶多糖+多酚組(烏龍茶多糖濃度為400 μg/mL+多酚濃度為150 μg/mL)以及多酚組(多酚濃度為150 μg/mL)，觀察4組對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響(圖1)。

由圖1中可以看出，烏龍茶多糖與多酚聯(lián)合應(yīng)用，其對肝癌細(xì)胞HepG2增殖有明顯抑制作用，且聯(lián)合用藥組的抑制作用要顯著優(yōu)于2種藥物單獨使用(P<0.05)。烏龍茶多糖(400 μg/mL)經(jīng)與多酚(150 μg/mL)聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞抑制率為52.71%，烏龍茶多糖(400 μg/mL)及多酚(150 μg/mL)單獨應(yīng)用,細(xì)胞抑制率分別為為34.71%和35.03%。聯(lián)合應(yīng)用使得細(xì)胞抑制率提高了約1.5倍。結(jié)果表明，烏龍茶多糖與多酚聯(lián)合應(yīng)用，可以增強其單獨對肝癌細(xì)胞HepG2的抑制作用，二者起到了協(xié)同抑制作用。這可能是由于單獨應(yīng)用使得藥物作用靶向部位比較單一，聯(lián)合應(yīng)用擴大了藥物的抑制范圍，增強藥物的作用。

2.4　烏龍茶多糖與多酚協(xié)同對細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀(Annexin V/PI)法檢測肝癌細(xì)胞HepG2在藥物作用48 h后的凋亡百分率，結(jié)果見圖2。試驗結(jié)果顯示，單獨應(yīng)用高分子質(zhì)量烏龍茶多糖組及多酚組肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡率分別為11.10%±0.30%和25.87%±0.65%，明顯低于聯(lián)合應(yīng)用的細(xì)胞凋亡率47.23%±0.25%，差異極顯著 (P<0.01)，說明高分子質(zhì)量烏龍茶多糖和多酚的聯(lián)合使用對于肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的誘導(dǎo)作用更加明顯，此結(jié)果與上述結(jié)果一致。

A.空白對照組；B.400 μg/mL烏龍茶多糖；C.400 μg/mL烏龍茶多糖+150 μg/mL多酚；D.150 μg/mL多酚

A.Blank control group;B.400 μg / mL oolong polysaccharide;C.400 μg/mL oolong polysaccharide+150 μg/mL polyphenol;D.150 μg/mL polyphenol

圖1烏龍茶多糖與多酚協(xié)同對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

Fig.1Synergistic effect of oolong polysaccharide and polyphenol on HepG2 cell proliferation

A.400 μg/mL烏龍茶多糖；B.150 μg/mL多酚；C.400 μg/mL烏龍茶多糖+150 μg/mL多酚

A.400 μg/mL oolong polysaccharide;B.150 μg/mL polyphenol;C.400 μg/mL oolong polysaccharide+150 μg/mL polyphenol;

圖2烏龍茶多糖與多酚協(xié)同對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響

Fig.2Synergistic effects of oolong polysaccharide and polyphenol on apoptosis of HepG2 cells

3　討論

本試驗所用烏龍茶多糖、多酚是從福建烏龍茶中經(jīng)化學(xué)新工藝和高科技手段提取而來，有研究證實，烏龍茶多糖與多酚具有抗氧化以及廣泛的抗癌活性[12-15]。本試驗采用不同濃度的烏龍茶多糖、多酚作用肝癌細(xì)胞HepG2后，細(xì)胞的生長、增殖受到明顯的抑制。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，單獨應(yīng)用烏龍茶多糖組及多酚組肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡率顯著低于聯(lián)合應(yīng)用的細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，改變細(xì)胞周期，抑制癌癥的發(fā)生。目前在臨床應(yīng)用中的抗癌藥物在殺死癌細(xì)胞的同時，對機體正常組織也會有一定的損害，有一定的副作用，使化學(xué)治療藥物劑量受到了極大地限制。本試驗結(jié)果顯示，烏龍茶多糖、多酚的聯(lián)合用藥，肝癌細(xì)胞HepG2生長抑制率高達52.71%，起到了明顯的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，在臨床中可以減少化學(xué)藥物的使用劑量，其作用機制尚有待于進一步研究。