孫 偉，劉杉杉

(1.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，貴州銅仁 554300；2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，貴州銅仁 554300)

規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相關(guān)蛋白(CRISPR-associated protein)組成的CRISPR-Cas系統(tǒng),廣泛存在于細(xì)菌和古生物菌中，是微生物在長期進(jìn)化的過程中形成的一種免疫系統(tǒng)，可通過RNA介導(dǎo)的核酸酶抵抗噬菌體入侵、阻止質(zhì)粒接合和轉(zhuǎn)化等基因的導(dǎo)入[1]。早期根據(jù)Cas蛋白的不同，將CRISPR系統(tǒng)分為Ⅰ～Ⅲ類[2]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有Ⅰ-Ⅵ共6種類型，其中CRISPR-Cas9是由Ⅱ型系統(tǒng)改造而成的一把新的“基因剪刀”，在許多原核生物和真核生物體內(nèi)得到成功應(yīng)用[3-4]。

基因編輯技術(shù)是基因功能研究的重要手段，并得到了迅速的發(fā)展。近年來，發(fā)展了多種基因編輯技術(shù)，其中有鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和CRISPR-Cas9系統(tǒng)，均可實現(xiàn)DNA水平的基因編輯。ZFN和TALEN通過蛋白質(zhì)和DNA識別發(fā)揮作用，與ZFN和TALEN不同的是，CRISPR-Cas9通過一小段RNA序列對DNA進(jìn)行識別，因此具有設(shè)計簡便、高效、可實現(xiàn)高通量操作的特點[5]。目前，CRISPR-Cas9 系統(tǒng)在基因編輯方面得到了迅速的發(fā)展，在多個領(lǐng)域的研究中得到了應(yīng)用。

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的起源

1987年，Ishino Y等[6]在K12型大腸埃希菌編碼堿性磷酸酶的基因附近，發(fā)現(xiàn)了一種特殊的DNA回文序列，但不知道其功能。直到2000年，Mojica F J等[7]才在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了CRISPR系統(tǒng)，并在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，這些CRISPR系統(tǒng)在細(xì)菌先天性免疫中具有重要的作用。

2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的組成和原理

2.1 系統(tǒng)組成

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由具有核酸酶活性的Cas9蛋白、CRISPR轉(zhuǎn)錄而來的crRNA和反式激活的CRISPR重復(fù)區(qū)互補(bǔ)的tracrRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)組成。其中，crRNA決定了識別序列的特異性，crRNA與tracrRNA形成復(fù)合體招募Cas9到特定基因位點發(fā)揮內(nèi)切酶活性。每個crRNA包含20 nt的引導(dǎo)序列，可與靶DNA序列通過堿基配對的方式結(jié)合。Cas9蛋白發(fā)揮酶活性對靶序列有效的切割還依賴于靶序列的3′ 端存在的相鄰原型間隔序列毗鄰基序(parotospacer-associated mMotif,PAM)[1]。來源于化膿鏈球菌Cas9的PAM識別序列為5′ -NGG。為了簡化操作過程，研究者將crRNA和tracrRNA融合到同一條單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA,sgRNA)中[8]。通過改造后的CRISPR-Cas9系統(tǒng)只需要單獨(dú)的Cas9在gRNA的引導(dǎo)下,完成對DNA雙鏈的定點切割，造成DNA雙鏈斷裂(double-strand break，DSB)[1]。

2.2 工作原理

Cas9蛋白通過sgRNA中的堿基互補(bǔ)區(qū)序列特異性識別和結(jié)合目標(biāo)DNA序列，并在目標(biāo)DNA雙鏈的特定位點對其進(jìn)行切割形成DSB。在真核生物中，基因位點一旦被Cas9切割會在體內(nèi)啟動兩種修復(fù)機(jī)制，即同源重組修復(fù)(homologous recombination,HDR)和非同源末端連接修復(fù)(non homologous end joining，NHEJ)[1]。正常情況下，機(jī)體通過HDR后不會改變目標(biāo)基因編碼序列，但是當(dāng)存在供體質(zhì)粒提供的同源位點時也可以通過同源重組的方式插入外源基因片段，HDR途徑可以對Cas9切割的目標(biāo)DNA序列進(jìn)行精確的編輯。有錯誤傾向的NHEJ，在修復(fù)過程中往往伴隨有堿基的缺失或插入，甚至出現(xiàn)大片段的缺失或顛倒移位，從而造成所編碼的基因提前終止或編碼錯誤的蛋白。盡管一些細(xì)菌不存在有效的NHEJ途徑，但是Cas9可以特異導(dǎo)入細(xì)菌基因組中，CRISPR-Cas9可對細(xì)菌基因組進(jìn)行編輯。因此，利用DNA損傷修復(fù)的原理，可實現(xiàn)DNA的缺失、插入，利于基因功能的研究。

3 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的設(shè)計

3.1 sgRNA的設(shè)計

Cas9核酸酶的特異性取決于PAM序列上游的20 nt的引導(dǎo)序列。研究表明，PAM上游被稱為“種子區(qū)”的12 nt的序列對于Cas9發(fā)揮酶切作用起到重要的作用。“種子區(qū)”一旦發(fā)生錯誤匹配，對靶位點的識別具有很大的影響[9]。因此，在設(shè)計sgRNA時候，要尋找目標(biāo)DNA中Cas9識別的PAM序列，同時也要考慮基因編輯中盡可能降低脫靶率。目前，多個CRISPR在線設(shè)計的軟件可供使用，其中http://crispr.mit.edu可對提交的目標(biāo)DNA序列包含的所有具有PAM序列進(jìn)行分析，通過對產(chǎn)生的sgRNA進(jìn)行系統(tǒng)評分，可簡化設(shè)計難度，并可以對存在的脫靶率進(jìn)行理論上的分析，這樣有助于提高人工選擇的效率。

3.2 影響Cas9蛋白打靶效率的因素

在設(shè)計sgRNA的過程中，靶DNA基因組序列中高GC含量有利于尋找Cas9識別的PAM序列5′NGG，但是過高的GC含量也會提高Cas9脫靶率[10]。一般GC含量在45%～60%為宜?？紤]到內(nèi)含子對基因編碼的終產(chǎn)物意義不大，因此在設(shè)計sgRNA時，應(yīng)該選取基因編碼的CDS區(qū)。不同的靶點在基因敲除效率上存在較大的差異，具體原因尚不明確。因此，在靶點的選擇上可以選擇2個～3個位點，可以在一定程度上提高打靶率。必要的時候可以在基因庫中對靶點進(jìn)行BLAST分析。此外，通過驗證載體也有利于篩選出高打靶率的sgRNA序列。

4 CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用

近幾年來，CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展迅速，在多種真核細(xì)胞、病毒，甚至一些細(xì)菌上得到了應(yīng)用，為基因功能的研究和抗病育種、疾病治療等方面的研究提供了新的思路和手段。

4.1 對真核生物進(jìn)行基因編輯

CRISPR-Cas9系統(tǒng)在對真核生物進(jìn)行基因編碼方面具有很廣泛的應(yīng)用前景。目前，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)在人類細(xì)胞、小鼠、豬等多種真核生物上實現(xiàn)了基因編輯。2013年Cong L等[11]首次利用CRISPR-Cas9技術(shù)實現(xiàn)了人類細(xì)胞雙基因缺失,同年，Mali P等[12]在人的干細(xì)胞上實現(xiàn)了基因編輯。邵峰等[13-14]采用該項技術(shù)將人的原代細(xì)胞、癌細(xì)胞和小鼠中表達(dá)的與焦亡相關(guān)的gsdme、gsdmd基因進(jìn)行敲除。該技術(shù)可實現(xiàn)在動物胚胎水平進(jìn)行基因編輯，從而產(chǎn)生具有穩(wěn)定基因缺少突變的后代。目前，已有多家研究機(jī)構(gòu)采用CRISPR-Cas9技術(shù)，在豬受精卵發(fā)育過程中，將豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)CD163受體的基因缺失，成功培育出具有抗PRRSV感染的基因缺失豬[15-16]，有望對PRRSV的有效防控起到一定的作用。Gao Y等[17]采用CRISPR-Cas9技術(shù)培育出抗結(jié)核病的牛，這些研究成果為動物疾病防控和抗病育種工作提供了新的思路和手段。

腫瘤和癌癥是目前死亡率很高而且很難治愈的疾病。下調(diào)表達(dá)相關(guān)的致癌基因，對于腫瘤的治療具有十分重要的意義。通過設(shè)計可識別人的乳頭瘤病毒(Human papilloma virus， HPV)致癌基因E6/E7啟動子的CRISPR-Cas9系統(tǒng)，可顯著降低HPV導(dǎo)致的宮頸癌細(xì)胞的增殖。利用CRISPR-Cas9技術(shù)抑制泌尿道上皮細(xì)胞癌相關(guān)因子1(urothelial carcinoma associated 1,UCA1)的長鏈非編碼RNA可顯著降低膀胱癌的發(fā)病率[18]。白血病是一種惡性腫瘤，EZH2基因的過表達(dá)在白血病的產(chǎn)生中起到關(guān)鍵的作用。Xie H等[19]通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了白血病模型小鼠的EZH2基因的表達(dá)，白血病起始細(xì)胞的生長發(fā)育得到了明顯的抑制。CRISPR-Cas9還可成為癌基因遺傳學(xué)方面的高通量分析的手段[20]。還可用于癌癥相關(guān)基因的篩選[21]。CRISPR-Cas9技術(shù)逐漸在癌癥研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，并有可能成為新的治療手段。

4.2 對病毒進(jìn)行基因編輯

CRISPR-Cas9可對多種動物和人類病毒的基因進(jìn)行編輯，對病毒性疾病的防控和治療具有重要的意義。Xu A T等[22]采用CRISPR-Cas9技術(shù)對豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)基因進(jìn)行編碼，獲得高達(dá)100%的基因缺失病毒，可作為較好的載體用于疫苗研發(fā)。Tang Y D等[23]采用該系統(tǒng)對PRV基因組進(jìn)行編輯，可阻斷病毒的復(fù)制，有可能成為一種新的控制PRV的有效手段。目前，人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)尚無有效治療方法,HIV-1在復(fù)制過程中可將病毒基因組整合到宿主細(xì)胞中，Ebina H等[24]發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9可以阻斷HIV-1長末端重復(fù)序列在休眠期和誘導(dǎo)后的T淋巴細(xì)胞中表達(dá)，可用于清除處于潛伏期感染的HIV-1。Goetze R W等[25]利用該技術(shù),證實了HIV在感染單核細(xì)胞THP-1過程中，并不依賴于DNA 聚合酶β。通過CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，有望通過基因治療的方法，治療處于感染期和潛伏期的HIV-1[26-27]。CRISPR-Cas9為病毒性疾病的防控和治療提供了新的思路和解決方案。

4.3 對細(xì)菌進(jìn)行基因編輯

2013年Jiang W等[28]采用CRISPR-Cas9技術(shù)對肺炎鏈球菌的基因編輯，同時還利用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)對大腸埃希菌進(jìn)行基因編輯，這是首次報道了CRISPR-Cas9技術(shù)可對細(xì)菌進(jìn)行基因編輯。以后的研究表明，CRISPR-Cas9技術(shù)可對鏈霉菌屬的多個菌種進(jìn)行基因編輯[29-31]。CRISPR-Cas9技術(shù)有可能在構(gòu)建新一代工程菌的過程中起到關(guān)鍵作用[32]。與真核細(xì)胞不同的是，細(xì)菌很難修復(fù)CRISPR造成的損傷。因此，探索CRISPR對細(xì)菌的致死機(jī)制有助于研發(fā)新一代的抗菌藥物[33]。

5 小結(jié)與展望

CRISPR-Cas9技術(shù)是一項新的基因編輯技術(shù)，在真核生物和原核生物得到了廣泛的應(yīng)用，顯示出了強(qiáng)大的基因編輯能力。但是，由于受到sgRNA識別位點特異性的限制和某些物種基因結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，在應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)的過程中還面臨著脫靶的問題，在一定程度上限制了其在基因功能研究方面的應(yīng)用，需要進(jìn)一步改進(jìn)。Zhang F等又發(fā)現(xiàn)了新的CRISPR-Cas13系統(tǒng)，可實現(xiàn)更高位點特異性的切割，并可對RNA進(jìn)行切割，彌補(bǔ)了CRISPR-Cas9技術(shù)不能直接對RNA進(jìn)行識別和編輯的不足[34-35]。隨著CRISPR-Cas9系統(tǒng)的不斷改進(jìn)和優(yōu)化以及新的Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)，其應(yīng)用范圍將更加廣泛，在基因功能的研究和應(yīng)用上發(fā)揮更大的作用，并可能成為治療和防控人類及動物疾病的一項新技術(shù)。