長(zhǎng)春市售烏鱧攜帶嗜水氣單胞菌情況調(diào)查

單曉楓 ， 張冬星 ， 康元環(huán) ， 孫武文 ， 吳同壘 ， 王桂芹 ， 錢愛(ài)東

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長(zhǎng)春 130118 ； 2. 河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 河北 秦皇島 066004)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是氣單胞菌科氣單胞菌屬的代表株，對(duì)人及多種動(dòng)物均具有一定的致病性，是典型的人、獸、水生動(dòng)物共患病原菌[1]。其分布廣泛，可作為水生動(dòng)物正常菌群存在于腸道中，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降可自身感染或通過(guò)糞便等排出體外而感染其他易感動(dòng)物，甚至當(dāng)人類在處理相關(guān)食材不得當(dāng)時(shí)也易被其感染而發(fā)病。

烏鱧(Channaargus)是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值與營(yíng)養(yǎng)醫(yī)學(xué)價(jià)值均較高的魚(yú)類，其肉質(zhì)鮮美、抗逆性強(qiáng)，可以抵抗多種傳染性疾病[2]，很多病原可以寄生其體內(nèi)而不引起烏鱧死亡，與其他水生動(dòng)物混養(yǎng)可能會(huì)造成其疾病的發(fā)生，人類如果食用消毒不徹底的烏鱧或食材前處理操作不得當(dāng)，可能會(huì)感染人類而對(duì)機(jī)體造成危害。而具有致病性的嗜水氣單胞菌可能作為烏鱧腸道菌群潛伏在體內(nèi)，一旦該菌接觸到其他水生動(dòng)物或人類，可能造成感染引發(fā)疾病。因此，本調(diào)查以長(zhǎng)春市市售烏鱧為研究材料，對(duì)其體內(nèi)攜帶嗜水氣單胞菌情況進(jìn)行調(diào)查，研究結(jié)果為使用烏鱧的公共衛(wèi)生安全，以及預(yù)防嗜水氣單胞菌感染人及動(dòng)物引發(fā)疾病提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC7966，本實(shí)驗(yàn)室保存。昆明系小鼠，體重約15g/只，購(gòu)自吉林省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；斑馬魚(yú)，購(gòu)自長(zhǎng)春市某花鳥(niǎo)魚(yú)市場(chǎng)。

1.2 主要試劑 RS鑒別培養(yǎng)基、AHM培養(yǎng)基，購(gòu)自北京陸橋生物技術(shù)責(zé)任有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；TaqDNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑，均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 樣品采集 采樣時(shí)間，2016年5—10月；采集長(zhǎng)春市水產(chǎn)市場(chǎng)表觀健康烏鱧，活體運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室、麻醉、表面消毒，無(wú)菌條件下采取烏鱧腸道，保存。

1.4 細(xì)菌的分離鑒定 無(wú)菌操作取腸道內(nèi)容物接種于RS培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng) 18 h，隨機(jī)挑取5個(gè)特征性菌落接種液體LB培養(yǎng)基，28 ℃ 培養(yǎng) 12 h，再次用RS培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落純培養(yǎng)。參照陸承平制定的國(guó)標(biāo)隊(duì)純化的菌株進(jìn)行初步鑒定[3]。

將初步鑒定為嗜水氣單胞菌的菌株用熱裂解法提取基因組，以儲(chǔ)衛(wèi)華[4]設(shè)計(jì)的特異性16S-rRNA基因引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見(jiàn)表1)，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，隨機(jī)挑取685 bp左右出現(xiàn)條帶者、純化其PCR產(chǎn)物，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank進(jìn)行比對(duì)，已驗(yàn)證PCR反應(yīng)正確性。將最終鑒定為嗜水氣單胞菌的菌株進(jìn)行凍干保存。

1.5 細(xì)菌攜帶毒力基因檢測(cè) 以上述鑒定為嗜水氣單胞菌分離株基因組DNA為模板，對(duì)嗜水氣單胞菌的氣溶素(aer)、絲氨酸蛋白酶(ser)、溶血素(hly)、黏附素(Aha)、細(xì)胞毒性腸毒素(act)以及群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控基因(LuxS)等6個(gè)毒力基因片段進(jìn)行擴(kuò)增(見(jiàn)表1)[4-7]。

1.6 代表菌株致病性試驗(yàn) 選取攜帶不同毒力基因的嗜水氣單胞菌分離株，分別以斑馬魚(yú)、昆明系小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行致病性試驗(yàn)，觀察一周，記錄死亡情況；同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以Reed與Muench的方法計(jì)算LD50。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離株理化鑒定結(jié)果 經(jīng)RS鑒別培養(yǎng)基分離，共獲得菌落為黃色、圓形的分離株301株，純化后，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB /T 1865222002進(jìn)一步鑒定：

表1 PCR反應(yīng)所用的引物及目的片段大小

選取AHM培養(yǎng)基頂部紫黑色、底部黃色，運(yùn)動(dòng)性陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，吲哚陽(yáng)性，葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷陽(yáng)性，革蘭陰性的分離株，初步定為嗜水氣單胞菌。進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.2 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定 對(duì)初步鑒定為嗜水氣單胞菌的分離株，通過(guò)嗜水氣單胞菌16S rRNA特異性而進(jìn)行PCR鑒定，電泳檢測(cè)，在685 bp左右出現(xiàn)目的條帶的菌株可判定為嗜水氣單胞菌陽(yáng)性。隨機(jī)選取分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)GenBank比對(duì)，證實(shí)所測(cè)分離株為嗜水氣單胞菌。

經(jīng)理化試驗(yàn)、分子生物學(xué)鑒定結(jié)果綜合判定，共獲得107株嗜水氣單胞菌，所占分離株比例為35.55%。

2.3 細(xì)菌分離株攜帶毒力基因檢測(cè)結(jié)果 除LuxS基因外，107株嗜水氣單胞菌分離株攜帶5種毒力基因檢測(cè)結(jié)果如下：5種毒力基因都存在的菌株占14.0%(15/107)、攜帶4種毒力基因的菌株占20.56%(22/107)、攜帶3種毒力基因的菌株占20.56%(22/107)、攜帶2種毒力基因的菌株占17.76%(19/107)、只有1種毒力基因的菌株占11.21%(12/107)、5種毒力基因均沒(méi)有的菌株占15.89%(17/107)。

107株嗜水氣單胞菌分離株中攜帶aer基因的菌株有87株(81.31%)、攜帶hly基因的菌株76株(71.03%)、攜帶act基因的菌株32株(29.91%)、攜帶Aha基因的菌株37株(34.58%)、攜帶ser基因的菌株82株(76.64%)。作為群體感應(yīng)系統(tǒng)的標(biāo)志基因LusX，有88.79%(95/107)的菌株攜帶該基因。

2.4 代表菌株致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 隨機(jī)選取攜帶0種、1種、2種、3種、4種、5種毒力基因(LusX基因除外)嗜水氣單胞菌分離株各1株，分別對(duì)小鼠及斑馬魚(yú)進(jìn)行LD50的測(cè)定，其菌株毒力基因型及對(duì)小鼠、斑馬魚(yú)LD50結(jié)果如表2所示。從表中可以看出，攜帶毒力基因的菌株對(duì)小鼠、斑馬魚(yú)均有一定的致病性；且隨著菌株攜帶毒力基因數(shù)的增多，致病力也隨之增強(qiáng)；而同一菌株對(duì)斑馬魚(yú)的致病力要強(qiáng)于小鼠。

表2 嗜水氣單胞菌代表株致病性試驗(yàn)

3 討論

烏鱧肉質(zhì)鮮美，是我國(guó)淡水魚(yú)類生魚(yú)片的主要食材，但其抗逆性也較強(qiáng)，體內(nèi)往往攜帶多種病原生物而自身不發(fā)??；其中，體內(nèi)存在的嗜水氣單胞菌是典型的人-獸-魚(yú)共患病病原菌，其致病菌株可感染混養(yǎng)的其他魚(yú)類，也可能感染接觸該菌的人類。

本試驗(yàn)檢測(cè)，長(zhǎng)春市水產(chǎn)市場(chǎng)表觀健康的烏鱧體內(nèi)嗜水氣單胞菌分離率為35.55%(107/301)，這與我國(guó)其他鮮活水產(chǎn)品嗜水氣單胞菌攜帶率有所差異[8-10]，可能與樣品不同、采樣時(shí)間不同有一定關(guān)聯(lián)。試驗(yàn)對(duì)嗜水氣單胞菌分離株5種毒力相關(guān)基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超過(guò)70%以上的菌株攜帶aer、ser、hly基因，而大量研究證實(shí)，氣單胞菌aer、ser基因與菌株的致病性有較大的關(guān)聯(lián)；本試驗(yàn)的致病性結(jié)果也顯示，攜帶aer、ser、hly基因的分離率對(duì)小鼠及斑馬魚(yú)具有一定的致病性。通過(guò)以上結(jié)果是否可以提出一種假設(shè)：烏鱧體內(nèi)攜帶大多數(shù)嗜水氣單胞菌分離株均存在潛在的致病風(fēng)險(xiǎn)？這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本試驗(yàn)也對(duì)LusX基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，有88.79%(95/107)的嗜水氣單胞菌分離株攜帶該基因，LusX基因與細(xì)菌的群體感應(yīng)密切相關(guān)，而群體感應(yīng)系統(tǒng)與細(xì)菌致病性、生物被膜的形成以及耐藥性具有一定關(guān)聯(lián)[11]，攜帶該基因嗜水氣單胞菌分離株的大量存在，暗示這些細(xì)菌在宿主體內(nèi)可能形成生物被膜，一旦這些菌株引發(fā)疾病，其形成的生物被膜可能會(huì)給用藥帶來(lái)較大困難。

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