山奈酚通過調(diào)控AMPK/Nrf2/HO-1信號通路緩解ox-LDL介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷

康桂蘭 景增秀

(西寧市第二人民醫(yī)院，西寧 810003)

血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持血管壁正常結(jié)構(gòu)和功能的重要屏障，內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化(Atheroscle-rosis，AS)的始動環(huán)節(jié)[1]。有文獻(xiàn)報(bào)道，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopro-tein，ox-LDL)是早期AS發(fā)生和發(fā)展的重要因素，在AS病灶部位中存在明顯增加的氧化的低密度脂蛋白[2,3]。因此減少ox-LDL對內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷是預(yù)防和治療AS的有效途徑。黃酮類化合物是天然抗氧化劑，能夠緩解脂蛋白的過氧化作用，進(jìn)而有效地防治AS的發(fā)生[4]。山萘酚(Kaempferol)是一種黃酮醇類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、豆類、茶葉中，具有抗癌、抗炎、抗氧化等多種生理作用[5,6]。已有研究表明，山奈酚能夠抵抗缺血再灌注等心血管疾病損傷[7,8]，抵抗AS[9]，但是具體的分子機(jī)制并不明確。本研究在體外通過用ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)損傷，進(jìn)一步探討山奈酚對ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、凋亡、炎性因子和黏附分子產(chǎn)生和氧化應(yīng)激的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 HUVECs購自ATCC；山奈酚購自Sigma公司；MTT試劑盒、annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)試劑盒購于南京建成生物工程研究所；核提取試劑盒購于Pierce 公司；RIPA 細(xì)胞裂解液、PMSF和BCA 蛋白含量測定試劑購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Anti-cleaved-caspase-3、anti-Bcl-2、anti-TNF-α、anti-IL-1β、anti-IL-6、anti-VCAM1、anti-ICAM1、anti-E-selectin、anti-p-AMPK、anti-Nrf2、anti-HO-1和anti-GAPDH等 I 抗購自Abcam公司和Santa Cruz 公司；Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 將HUVECs置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%融合時，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化傳代，分別接種到不同規(guī)格的培養(yǎng)板中。藥物處理：先用山奈酚預(yù)處理HUVECs 2 h,再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染 根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別將Nrf2和HO-1的siRNA轉(zhuǎn)染到HUVECs。轉(zhuǎn)染6 h后，更換新的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后，山奈酚處理2 h,再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為6組：對照(control)組，正常培養(yǎng)；ox-LDL組，100 μg/ml的ox-LDL處理24 h；Kaempferol+ox-LDL組，50 μmol/L的山奈酚處理2 h后再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h；Kaempferol+ox-LDL+compound C組，5 mmol/L的compound C處理2 h，然后50 μmol/L的山奈酚處理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h；Kaempfe-rol+ox-LDL+si-Nrf2組，si-Nrf2轉(zhuǎn)染24 h，然后50 μmol/L的山奈酚處理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h；Kaempferol+ox-LDL+si-HO-1組，si-HO-1轉(zhuǎn)染24 h，然后50 μmol/L的山奈酚處理2 h，再用100 μg/ml的ox-LDL處理24 h。

1.2.4MTT檢測細(xì)胞活力 將細(xì)胞接種到96孔板上，每組設(shè)置4個復(fù)孔，分別進(jìn)行不同處理。然后每孔加入10 μl MTT試劑(0.5 mg/ml)，在培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μl二甲基亞砜溶液，震蕩溶解15 min,在酶標(biāo)儀490 nm處檢測吸光度(A)。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞接種到6孔板上，每組設(shè)置4個復(fù)孔，分別進(jìn)行不同處理。然后經(jīng)胰酶(不含EDTA)消化，PBS洗滌、離心后，棄上清液。每孔加入500 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入10 μl annexin V-FITC，5 μl PI，避光室溫孵育15 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.2.6ROS含量的測定 將細(xì)胞接種到6孔板上，每組設(shè)置4個復(fù)孔，分別進(jìn)行不同處理。然后每孔加入10 μmol/L DCFH-DA避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)分析胞間ROS水平。

1.2.7SOD含量測定 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行SOD含量測定。

1.2.8蛋白提取 將細(xì)胞接種到24孔板上，每組設(shè)置4個復(fù)孔，分別進(jìn)行不同處理。每孔加入RIPA裂解液與PMSF的混合液(100∶1)裂解細(xì)胞15 min，離心收集上清提取總蛋白。根據(jù)試劑盒說明書提取核蛋白。BCA 蛋白試劑盒進(jìn)行蛋白定量。

1.2.9Western blot檢測蛋白水平 取適量樣品蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，采用半干轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入Ⅰ抗4℃過夜孵育，之后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h。用Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1山奈酚提高ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性 山奈酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1A所示。MTT試劑盒檢測細(xì)胞活力，結(jié)果如圖1B所示。與對照組相比，ox-LDL處理顯著降低了HUVECs的細(xì)胞活性。當(dāng)加入不同濃度山奈酚預(yù)處理后，細(xì)胞活力呈山奈酚濃度依賴性提高。當(dāng)山奈酚濃度大于30 μmol/L時，細(xì)胞活力顯著上升。

2.2山奈酚降低ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果如圖2A和2B所示。與對照組相比，ox-LDL處理顯著提高了細(xì)胞的凋亡水平。與ox-LDL處理組相比，山奈酚預(yù)處理能夠呈濃度依賴性降低細(xì)胞凋亡，當(dāng)濃度大于10 μmol/L時，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們進(jìn)一步通過Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖2C、D。與對照組相比，ox-LDL組的cleaved-caspase-3的蛋白水平顯著上調(diào)，而Bcl-2的水平顯著降低。山奈酚預(yù)處理呈濃度依賴性下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的cleaved-caspase-3的蛋白水平，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇50 μmol/L作為山奈酚的處理濃度。

2.3山奈酚下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的炎性因子表達(dá) Western blot檢測TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，ox-LDL處理顯著上調(diào)TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。與ox-LDL組相比，山奈酚預(yù)處理能夠顯著下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)。

圖1 山奈酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of kaempferol on cell viability in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

圖2 山奈酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of kaempferol on cell apoptosis in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

圖3 山奈酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)的影響Fig.3 Effects of kaempferol on expression of TNF-α,IL-1β and IL-6 in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

圖4 山奈酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中VCAM1、ICAM1和E-selectin表達(dá)的影響Fig.4 Effects of kaempferol on expression of VCAM1,ICAM1 and E-selectin in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDLgroup.

2.4山奈酚下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的黏附分子表達(dá) Western blot檢測血管細(xì)胞黏附分子(VCAM1)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM1)和選擇素E(E-selectin)的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，VCAM1、ICAM1和E-selectin的蛋白表達(dá)水平在ox-LDL組中顯著上調(diào)，而山奈酚預(yù)處理能夠顯著下調(diào)VCAM1、ICAM1和E-selectin的表達(dá)。

2.5山奈酚抑制ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激 如圖5所示，與對照組相比，ox-LDL處理能夠顯著上調(diào)ROS的產(chǎn)生，下調(diào)SOD的活性。與ox-LDL組相比，山奈酚預(yù)處理能夠顯著下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，上調(diào)SOD 的活性。

2.6山奈酚通過激活A(yù)MPK-Nrf2-HO-1通路抑制氧化應(yīng)激損傷 Western blot檢測p-AMPK、AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖6A～C所示。與對照組相比，p-AMPK、Nrf2和HO-1在ox-LDL組中的蛋白水平顯著下降，而山奈酚預(yù)處理顯著提高p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平。為了進(jìn)一步確定AMPK-Nrf2-HO-1通路與山奈酚的保護(hù)作用緊密相關(guān)，我們用AMPK抑制劑compound C、si-Nrf2和si-HO-1進(jìn)行處理來抑制該通路蛋白的表達(dá)。如圖6A～C所示，與kaempfe-rol+ox-LDL組相比，C.C+kaempferol+ox-LDL組中p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平均顯著下調(diào)，si-Nrf2+kaempferol+ox-LDL組中Nrf2和HO-1的蛋白水平顯著下調(diào)，p-AMPK表達(dá)無顯著變化，而si-HO-1+kaempferol+ox-LDL組中HO-1的蛋白水平顯著下調(diào)，p-AMPK和Nrf2表達(dá)無顯著變化。這個結(jié)果說明AMPK通過調(diào)控Nrf2影響HO-1的表達(dá)。與kaempferol+ox-LDL組相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1處理組都能夠增加ROS的生成(圖6D)。進(jìn)一步通過MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與kaempferol+ox-LDL組相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1處理組的細(xì)胞活力顯著下降，而細(xì)胞凋亡顯著增加(圖6E和6F)。這些結(jié)果說明山奈酚能夠通過激活A(yù)MPK-Nrf2-HO-1通路降低ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激等損傷。

圖5 Effects of kaempferol on oxidative stress in ox-LDL-treated HUVECsFig.5 山奈酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中氧化應(yīng)激的影響Note: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group.

圖6 山奈酚對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs中AMPK-Nrf2-HO-1通路的影響Fig.6 Effects of kaempferol on AMPK-Nrf2-HO-1 signaling in ox-LDL-treated HUVECsNote: vs control group;#.P<0.05 vs ox-LDL group;△.P<0.05 vs kaempferol+ox-LDL group.

3 討論

AS是一種常見的心血管疾病，可由高血壓、高血糖、高血脂、吸煙、飲酒等多種因素引發(fā)，嚴(yán)重威脅人類健康。血管內(nèi)皮損傷是AS的主要病理基礎(chǔ)，是一個包括凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的復(fù)雜過程。本研究發(fā)現(xiàn)山奈酚能夠緩解ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷，并初步探討了其分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)山奈酚能夠通過激活A(yù)MPK/Nrf2/HO-1信號通路降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減少內(nèi)皮損傷。

在正常生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡保持動態(tài)平衡，以此來維持血管的正常功能。研究表明，在AS斑塊中存在廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而內(nèi)皮細(xì)胞的過度凋亡是內(nèi)皮功能障礙的始動環(huán)節(jié)。在本研究中，我們首先通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理顯著降低了HUVECs的細(xì)胞活力。當(dāng)用山奈酚預(yù)處理后，HUVECs的細(xì)胞活力呈濃度依賴性提高，說明山奈酚能夠緩解ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞活力損傷。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)ox-LDL處理顯著提高HUVECs的凋亡率，而山奈酚能夠呈濃度依賴性降低ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。我們進(jìn)一步通過Western blot檢測了凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)山奈酚能夠呈濃度依賴性下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的cleaved-caspase-3的蛋白水平，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。以上結(jié)果說明山奈酚能夠保護(hù)HUVECs抵抗ox-LDL誘導(dǎo)的損傷，且保護(hù)作用呈濃度依賴性。

血管內(nèi)皮的炎性反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用，白細(xì)胞向血管內(nèi)皮的滾動、黏附、遷移和積聚，是血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)的標(biāo)志[10]。內(nèi)皮細(xì)胞在外界環(huán)境刺激下，能夠誘導(dǎo)多種炎性因子和黏附分子的產(chǎn)生，加速白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的黏附和炎性反應(yīng)。Jiang等[11]研究顯示，ox-LDL處理HUVECs后，IL-6、TNF-α、VCAM1、ICAM1和E-selectin的含量明顯升高。有文獻(xiàn)指出，山奈酚能夠通過降低炎性因子和黏附因子的表達(dá)發(fā)揮抗AS作用[12,13]。我們的研究結(jié)果與以上結(jié)果一致，ox-LDL處理顯著上調(diào)了TNF-α、IL-1β、IL-6、VCAM1、ICAM1和E-selectin的表達(dá)，而山奈酚預(yù)處理使以上蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)。以上結(jié)果說明山奈酚能夠保護(hù)HUVECs抵抗ox-LDL誘導(dǎo)的炎性損傷。

有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞增殖凋亡異常以及炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激有密不可分的關(guān)系。當(dāng)ROS的生物活性高于抗氧化防御能力時，即產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。在多種心血管疾病中，例如AS代謝綜合征、血脂異常，ROS水平明顯升高，與疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)[14，15]。SOD是主要的抗氧化酶，能夠保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ox-LDL處理能夠顯著上調(diào)ROS的產(chǎn)生，下調(diào)SOD的表達(dá)。山奈酚預(yù)處理后能夠顯著下調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，上調(diào)SOD 的表達(dá)，與Xiao等[8]的研究結(jié)果一致。這個結(jié)果說明山奈酚能夠保護(hù)HUVECs抵抗ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

Nrf2 是一個調(diào)控多種抗氧化酶基因表達(dá)的重要的轉(zhuǎn)錄因子，例如HO-1[17,18]，一種具有抗氧化和細(xì)胞保護(hù)作用的酶[19,20]。Nrf2/HO-1 信號的激活能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。AMPK是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，有研究報(bào)道AMPK的活化能夠抑制異常炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[21]。本實(shí)驗(yàn)的Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，ox-LDL處理顯著下降p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平，而山奈酚預(yù)處理顯著提高了p-AMPK、Nrf2和HO-1的蛋白水平。山奈酚能夠通過提高Nrf2的表達(dá)來降低ROS的產(chǎn)生[22],AMPK在癌癥中起到調(diào)控作用[23]，為了進(jìn)一步確定AMPK-Nrf2-HO-1通路與山奈酚的保護(hù)作用緊密相關(guān)，我們用AMPK抑制劑compound C、si-Nrf2和si-HO-1進(jìn)行處理來抑制該通路蛋白的表達(dá)。與kaempferol+ox-LDL組相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1處理組都能夠提高ROS的生成。進(jìn)一步通過MTT實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與kaempferol+ox-LDL組相比，Compound C、si-Nrf2和si-HO-1處理組的細(xì)胞活力顯著下降，而細(xì)胞凋亡顯著增加。這些結(jié)果說明山奈酚能夠通過激活A(yù)MPK-Nrf2-HO-1通路降低ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激等損傷。

綜上所述，山奈酚抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs活力降低，減少細(xì)胞凋亡，下調(diào)炎性因子和黏附分子的表達(dá)，緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，這與AMPK-Nrf2-HO-1信號通路的激活有關(guān)。本研究進(jìn)一步闡明了內(nèi)皮損傷及AS的發(fā)病機(jī)理，為山奈酚防治AS提供了理論依據(jù)。

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