高 聰 林大勇 韓 勇 劉 兵

(四川省人民醫(yī)院急診科,成都 610072)

外科腫瘤切除術(shù)是治療結(jié)腸癌的主要方法[1]。研究表明，手術(shù)期是癌癥發(fā)展最易受影響的階段[2]。手術(shù)期間腫瘤血管的破裂和手術(shù)操作不當(dāng)都可能導(dǎo)致癌細胞進入體循環(huán)，造成癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[2,3]。此外，手術(shù)期間全麻藥物的使用可導(dǎo)致機體免疫功能抑制，進一步增加癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險[4]。近年研究表明，在腫瘤切除手術(shù)期間使用局麻藥物能降低乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌等多種癌癥的復(fù)發(fā)率[5-7]。有數(shù)據(jù)分析指出，在結(jié)腸癌手術(shù)期間使用局麻藥物的患者預(yù)后明顯優(yōu)于使用全麻藥物的患者[8]。羅哌卡因是臨床常用的局麻藥物之一[8]。研究表明，羅哌卡因可通過調(diào)控Na+通道的開放明顯抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[9]，但其對結(jié)腸癌細胞增殖能力的影響及作用機制還較少見報道。因此，本文將從體內(nèi)體外兩方面探討羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞增殖和腫瘤生長的影響，以進一步闡明局麻藥物羅哌卡因影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司。CO2培養(yǎng)箱購自德國Binder公司，流式細胞儀購自美國BD公司，垂直電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國Hoefer公司。CCK8試劑盒、BCA試劑盒和Tunel試劑盒購自中國碧云天生物科技公司。Ki67、增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和細胞周期蛋白A (Cyclin A) 抗體購自美國CST公司，caspase-3、caspase-9、p53和磷酸甘油醛脫氫酶 (Glyceraldhyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH) 抗體購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細胞系SW480購自中國科學(xué)院上海細胞所細胞庫。將SW480細胞用含10%胎牛血清、100 U青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液。

1.2.2CCK8檢測細胞活性 當(dāng)細胞匯合率達到80%時，將細胞傳代接種至96孔板中，并用不同濃度的羅哌卡因 (0、1、2、5、10、20、50、100、200、400、800 μg/ml) 處理SW480細胞。48 h后按照CCK8試劑盒說明書加入CCK8試劑，孵育2 h后，用酶標(biāo)儀于450 nm檢測細胞吸光度。

1.2.3腫瘤成球?qū)嶒?將結(jié)腸癌細胞傳代接種于低黏附六孔板中，每孔5 000個細胞。將細胞隨機分為Ropivacaine 0、20、50和100 μg/ml組，每組6個復(fù)孔。用含相應(yīng)濃度羅哌卡因的培養(yǎng)液處理細胞48 h后，用含有4 μg/ml 肝素的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，兩周后用結(jié)晶紫染色，每孔隨機選取六個視野拍照統(tǒng)計。

1.2.4Western blot 用羅哌卡因處理細胞48 h，每孔加入2 ml預(yù)冷的蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。每組各取蛋白樣品30 μg 用12% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入一抗封閉過夜 (Ki67,1∶1 000;PCNA,1∶850;cleaved caspase-3,1∶700;cleaved caspase-9,1∶900;p53,1∶1 000;Cyclin A,1∶800) 。一抗封閉完成后，TBST清洗3次，室溫封閉對應(yīng)HRP標(biāo)記二抗1 h，最后加入ECL顯色液于暗室曝光顯影。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞周期 用羅哌卡因處理細胞48 h后，用胰酶消化收集細胞，加入70%乙醇4℃固定過夜。第二天用PBS清洗除去乙醇，加入1 mg/ml的 RNase A室溫孵育30 min。30 min后加入PI，室溫避光孵育15 min后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 用羅哌卡因處理細胞48 h，用0.25%的胰酶消化收集細胞，PBS清洗三次后，用70%乙醇4℃固定1 h。固定結(jié)束后加入PI和PE-Annexin V室溫孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7Xenograft模型建立 雄性BALB/C裸鼠購自北京實驗動物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將裸鼠隨機分為SW480組、Ropiv (5 mg/kg BW) 組、Ropiv (10 mg/kg BW) 組和Ropiv (20 mg/kg)組 ，每組12只。除SW480組外，其余組裸鼠于腹股溝皮下注射對數(shù)期的SW480細胞，細胞密度為1×107個/ml。以有腫瘤長出視為造模成功。Ropiv (5 mg/kg BW) 組、Ropiv (10 mg/kg BW) 組和Ropiv (20 mg/kg) 組分別連續(xù)腹腔注射給予5、10和20 mg/kg的羅哌卡因5 d，每天一次，SW480組給予等量溶媒。分別于造模后的1、3、7、10、14、18、21、24、28和32 d測量記錄腫瘤長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積 (腫瘤體積=a×b2/2)，并統(tǒng)計裸鼠存活情況，計算存活率 (存活率=存活數(shù)/裸鼠總數(shù)×100%) 。

1.2.8Tunel檢測細胞凋亡 將裸鼠連續(xù)喂養(yǎng)32 d后，處死動物并取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定過夜后，制作冰凍切片并保存于液氮中備用。根據(jù)Tunel試劑盒說明書檢測腫瘤組織的細胞凋亡情況。用4%多聚甲醛室溫固定腫瘤切片30 min后，加入0.5%的TritonX-100室溫通透15 min。用2%過氧化氫室溫孵育5 min，滴加含TdT酶的Tunel反應(yīng)液37℃孵育1 h，1 h后終止反應(yīng)，最后用0.05%的DAB染色液進行復(fù)染，于顯微鏡下隨機選取6個視野記錄統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞活性的影響 為了探究羅哌卡因?qū)W480活性的影響，確定后續(xù)實驗用藥濃度，我們用CCK8法檢測了細胞活性。實驗結(jié)果表明，當(dāng)羅哌卡因濃度低于100 μg/ml時，對結(jié)腸癌細胞的活性無明顯影響，濃度達到200 μg/ml時，細胞活性降至80%以下 (圖1) 。因此，我們選擇了對細胞無顯著毒性的低中高 (20、50、100 μg/ml) 三個劑量進行后續(xù)試驗。

2.2羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞增殖的影響 為了探究羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞增殖的作用，我們檢測了SW480細胞的成球情況及增殖標(biāo)記蛋白的表達情況。腫瘤成球?qū)嶒灲Y(jié)果表明，與Ropivacaine 0 μg/ml組比較，Ropivacaine 20、50和100 μg/ml組成球細胞數(shù)明顯減少(圖2) ，并具有量效關(guān)系；同時，羅哌卡因 (20、50、100 μg/ml) 還能明顯抑制細胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67和PCNA的表達(圖3) ，表明羅帕卡因能抑制結(jié)腸癌細胞增殖。

2.3羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)實驗結(jié)果表明，當(dāng)羅哌卡因濃度為50和100 μg/ml時，能顯著促進結(jié)腸癌細胞凋亡 (圖4) 。與Ropivacaine 0 μg/ml組比較，Ropivacaine 50 μg/ml組和Ropivacaine 100 μg/ml組結(jié)腸癌細胞凋亡標(biāo)記蛋白Cleaved caspase-3的表達水平明顯升高(圖3)；同時，羅哌卡因(20、50、100 μg/ml)還可明顯促進Cleaved caspase-9的表達(圖3)。

2.4羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞周期的影響 用不同濃度羅哌卡因處理細胞48 h后，與Ropivacaine 0 μg/ml組比較，20 μg/ml組的G0/G1期細胞數(shù)減少，G2/M期細胞數(shù)增多，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義；Ropivacaine 50 μg/ml組 (37.6%) 和100 μg/ml組 (32.2%) 的G0/G1期結(jié)腸癌細胞數(shù)較0 μg/ml組 (46.3%) 比較均明顯減少，G2/M期細胞數(shù)均顯著增多，并且隨濃度的增高作用逐漸增強(圖5)；此Cyclin A的表達(圖3) ；濃度為50和100 μg/ml時還能明顯促進p53的表達(圖5) ，以上結(jié)果均提示羅哌卡因可誘導(dǎo)SW480細胞發(fā)生G2期阻滯，從而抑制結(jié)腸癌細胞的生長。

2.5羅哌卡因?qū)δ[瘤生長的影響 為了探究羅哌卡因?qū)δ[瘤生長的影響，我們復(fù)制結(jié)腸癌Xenograft模型，并統(tǒng)計了腫瘤的生長情況及結(jié)腸癌小鼠的存活情況。實驗結(jié)果表明，連續(xù)喂養(yǎng)裸鼠28 d后，Ropiv 10組和Ropiv 20 mg/kg BW組裸鼠的腫瘤組織體積較SW480組比較明顯減小(圖6) ；同時，連續(xù)飼養(yǎng)32 d，羅哌卡因(5、10、20 mg/kg)可明顯抑制腫瘤細胞的生長(圖2) ；此外，羅哌卡因還能提高裸鼠生存率，并體現(xiàn)出量效關(guān)系(圖6)。

2.6羅哌卡因?qū)δ[瘤組織細胞凋亡的影響 進一步研究結(jié)果表明，與SW480組比較，Ropiv 10和20 mg/kg BW組腫瘤組織的凋亡小體明顯增多(圖7)，表明羅哌卡因能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞凋亡，進而抑制腫瘤的生長。

圖1 羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞活性的影響Fig.1 Effect of ropivacine on cell viability of colon cancerNote: Cells were seeded in 96-well plates and treated with ropivacaine at different concentrations；A.The chemical structure of ropivacaine;B.CCK8 assay was performed for cell viability of SW480 cell.All experiment were repeated at least three times.n=6.

圖2 羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞集落形成的影響Fig.2 Effect of ropivacaine on colony formation of colon cancer cellNote: *.P<0.05,#.P<0.01,△.P<0.001 versus Ropivacaine 0 μg/ml group.

圖3 羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of ropivacaine on apoptosis of colon cancer cellNote: A.Flow cytometry was performed for apoptosis;B.Quantification of Fig.3A.#.P<0.01 versus Ropivacaine 0 μg/ml group.

圖4 羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞周期的影響Fig.4 Effect of ropivacaine on cell cycle of colon cancer cellNote: A.Cell cycle was detected by flow cytometry;B.Quantification of Fig.4A.#.P<0.01 versus Ropivacaine 0 μg/ml group.

圖5 羅哌卡因?qū)毎鲋硺?biāo)記蛋白、凋亡標(biāo)記蛋白和細胞周期標(biāo)記蛋白表達的影響Fig.5 Effect of ropivacaine on proliferation-,apoptosis-and cell cycle-related proteinsNote: GAPDH was used as a loading control.*.P<0.05,#.P<0.01,△.P<0.001 versus Ropivacaine 0 μg/ml group.

圖6 羅哌卡因?qū)δ[瘤生長的影響Fig.6 Effect of ropivacaine on growth of tumorNote: Xenograft model of colon cancer was employed and mice were treated with ropivacaine for 5 days.All experiments were performed after 32 days.A.Growth cave of colon tumor;B.Survival cave of mice with colon cancer.*.P<0.05,#.P<0.01 versus SW480 group.

圖7 羅哌卡因?qū)δ[瘤組織細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of ropivacaine on apoptosis in colon tumorNote: A.Apoptosis of colon tumor was measure by Tunnel assay;B.Quantification of Fig.7A.#.P<0.01,△.P<0.001 versus SW480 group.

3 討論

機體自身免疫應(yīng)答是影響癌癥發(fā)生發(fā)展的重要因素[10]。研究表明，在腫瘤切除手術(shù)過程中，全麻藥物的使用會降低機體免疫力，從而增加癌細胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[3]。如揮發(fā)性麻醉藥物和阿片類藥物能通過抑制NK細胞活性從而發(fā)揮對免疫系統(tǒng)的負向調(diào)控作用[11,12]。近年來局麻藥物的使用較大程度上避免了這一弊端。大量研究表明，局麻藥物可抑制癌細胞增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡[13-15]。利多卡因可誘導(dǎo)淋巴瘤T細胞凋亡，布比卡因可誘導(dǎo)成神經(jīng)細胞瘤及結(jié)腸癌細胞的凋亡，抑制癌細胞增殖[16-18]。也有研究表明，羅哌卡因可抑制結(jié)腸癌細胞侵襲和遷移，大劑量的羅哌卡因可抑制結(jié)腸癌細胞增殖[8,18]。本文研究表明，羅哌卡因可抑制結(jié)腸癌細胞SW480集落的形成，同時還能抑制細胞增殖標(biāo)記蛋白Ki67、PCNA的表達，并隨濃度升高，抑制作用逐漸增強。此外，羅哌卡因還能抑制裸鼠結(jié)腸癌皮下瘤的生長，提高了裸鼠的存活率。進一步證明羅哌卡因能通過抑制結(jié)腸癌細胞增殖和結(jié)腸癌皮下瘤生長減緩結(jié)腸癌的發(fā)展。

細胞凋亡是指由基因調(diào)控的細胞自主性的程序性死亡，其在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮了重要的作用。研究表明，細胞凋亡抑制是癌癥的一個重要特征[19]。在癌癥發(fā)展過程中，細胞凋亡的抑制能促進癌細胞的增殖和腫瘤的生長[20]。研究表明，局麻藥物羅哌卡因可通過促進細胞凋亡抑制血清誘導(dǎo)的HT29、CaCO2結(jié)腸癌細胞增殖[21]。在無血清培養(yǎng)條件下，羅哌卡因也可促進結(jié)腸癌細胞凋亡，抑制癌細胞生長[22]。本文研究結(jié)果表明，羅哌卡因可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞SW480凋亡，能明顯促進凋亡標(biāo)記蛋白Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9的表達，同時還可顯著促進結(jié)腸癌Xneograft模型小鼠腫瘤組織凋亡小體的形成，進一步表明羅哌卡因可促進結(jié)腸癌細胞凋亡，從而抑制結(jié)腸癌細胞增殖。

研究表明，細胞周期的調(diào)控與癌細胞的增殖和凋亡密切相關(guān)[23]。細胞周期分為四個階段，包括G1期、S期、G2期和M期。G1期是細胞對增殖正調(diào)控或負調(diào)控做出應(yīng)答的階段，DNA復(fù)制主要發(fā)生在S期，G2期DNA復(fù)制終止并開始合成大量的RNA和蛋白質(zhì)，為M期細胞的分裂做準(zhǔn)備[24]。本文研究發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因可顯著減少處于G0/G1的結(jié)腸癌細胞，處于G2/M期的細胞明顯增多，S期細胞數(shù)無明顯變化，表明羅哌卡因可能通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞發(fā)生G2期阻滯而抑制癌細胞的增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡。細胞周期是由多種細胞因子共同調(diào)控的結(jié)果。其中Cyclin A是細胞周期起始階段最重要的蛋白之一，其在整個G1期和S期都大量表達，主要參與DNA的復(fù)制，因此在多種癌癥中均呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[25,26]。p53是一類抑癌基因，能誘導(dǎo)癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，在調(diào)控DNA修復(fù)和維持染色體完整性的過程中也發(fā)揮了重要的作用[27,28]。我們的研究表明，羅哌卡因可促進SW480細胞p53的表達，同時抑制細胞周期蛋白Cyclin A 的表達，提示羅哌卡因誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞發(fā)生細胞周期阻滯與調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白p53和Cyclin A的表達有關(guān)。

綜上所述，羅哌卡因可抑制結(jié)腸癌細胞增殖，誘導(dǎo)癌細胞凋亡，并且可能與其誘導(dǎo)SW480細胞發(fā)生細胞周期阻滯有關(guān)。同時，羅哌卡因還能通過抑制腫瘤生長及促進腫瘤組織細胞凋亡而提高結(jié)腸癌裸鼠的生存率。本研究闡明了羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌的作用，可能為羅哌卡因應(yīng)用于結(jié)腸癌手術(shù)麻醉，降低結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)率提供了新的理論依據(jù)，但其作用機制還有待進一步探討。

參考文獻：

[1] Denis MG,Lipart C,Leborgne J,etal.Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood of colorectal cancer patients[J].Interna J Cancer，1997,74:540-544.

[2] Goldfarb Y,Ben-Eliyahu S.Surgery as a risk factor for breast cancer recurrence and metastasis:mediating mechanisms and clinical prophylactic approaches[J].Breast Disease，2006,26:99-114.

[3] Gottschalk A,Sharma S,Ford J,etal.Review article:the role of the perioperative period in recurrence after cancer surgery[J].Anesthesia Analgesia，2010,110:1636-1643.

[4] Cata J,Hernandez M,Lewis V,etal.Can regional anesthesia and analgesia prolong cancer survival after orthopaedic oncologic surgery?[J].Clin Orthop Relat Res，2014,472:1434-1441.

[5] Exadaktylos AK,Buggy DJ,Moriarty DC,etal.Can anesthetic technique for primary breast cancer surgery affect recurrence or metastasis?[J].Anesthesiology，2006,105:660-664.

[6] Kim MY,Oskarsson T,Acharyya S,etal.Tumor self-seeding by circulating cancer cells[J].Cell，2009,139:1315-1326.

[7] Biki B,Mascha E,Moriarty DC,etal.Anesthetic technique for radical prostatectomy surgery affects cancer recurrence:a retrospective analysis[J].Anesthesiology，2008,109:180-187.

[8] Vogelaar FJ,Lips DJ,van Dorsten FR,etal.Impact of anaesthetic technique on survival in colon cancer:a review of the literature[J].Gastroenterology Report，2016,4:30-34.

[9] Baptista-Hon DT,Robertson FM,Robertson GB,etal.Potent inhibition by ropivacaine of metastatic colon cancer SW620 cell invasion and NaV1.5 channel function[J].Bri J Anaest，2014,113(Suppl 1):i39-i48.

[10] Silver D,Sinyuk M,Vogelbaum M,etal.The intersection of cancer,cancer stem cells,and the immune system:therapeutic opportunities[J].Neuro-oncology，2016,18:153-159.

[11] Maher DP,Wong W,White PF,etal.Association of increased postoperative opioid administration with non-small-cell lung cancer recurrence:a retrospective analysis[J].Br J Anaesth，2014,113(Suppl 1):i88-i94.

[12] Nguyen J,Luk K,Vang D,etal.Morphine stimulates cancer progression and mast cell activation and impairs survival in transgenic mice with breast cancer[J].Br J Anaesth，2014,113(Suppl 1):i4-i13.

[13] Chang YC,Hsu YC,Liu CL,etal.Local anesthetics induce apoptosis in human thyroid cancer cells through the mitogen-activated protein kinase pathway[J].PloS One，2014,9:e89563.

[14] Sakaguchi M,Kuroda Y,Hirose M.The antiproliferative effect of lidocaine on human tongue cancer cells with inhibition of the activity of epidermal growth factor receptor[J].Anesthesia Analgesia，2006,102:1103-1107.

[15] Le Gac G,Angenard G,Clement B,etal.Local anesthetics inhibit the growth of human hepatocellular carcinoma cells[J].Anesthesia Analgesia，2017,125:1600-1609.

[16] Werdehausen R,Fazeli S,Braun S,etal.Apoptosis induction by different local anaesthetics in a neuroblastoma cell line[J].Bri J Anaest，2009,103:711-718.

[17] Boselli E,Duflo F,Debon R,etal.The induction of apoptosis by local anesthetics:a comparison between lidocaine and ropivacaine[J].Anesthesia and Analgesia，2003,96:755-756.

[18] Bundscherer A,Malsy M,Gebhardt K,etal.Effects of ropivacaine,bupivacaine and sufentanil in colon and pancreatic cancer cells in vitro[J].Pharmaco Res，2015,95-96:126-131.

[19] Favaloro B,Allocati N,Graziano V,etal.Role of apoptosis in disease[J].Aging (Albany NY)，2012,4:330-349.

[20] Hassan M,Watari H,AbuAlmaaty A,etal.Apoptosis and molecular targeting therapy in cancer[J].Bio Med Res Intern，2014,2014:150845.

[21] Martinsson T.Ropivacaine inhibits serum-induced proliferation of colon adenocarcinoma cells in vitro[J].J Pharmacol Exper Therap，1999,288:660-664.

[22] Kontargiris E,Kolettas E,Vadalouca A,etal.Ectopic expression of clusterin/apolipoprotein J or Bcl-2 decreases the sensitivity of HaCaT cells to toxic effects of ropivacaine[J].Cell Res，2004,14:415-422.

[23] N?r?xe D,Poulsen H,Lassen U.Hallmarks of glioblastoma:a systematic review[J].ESMO Open，2016,1:e000144.

[24] Chen J.The cell-cycle arrest and apoptotic functions of p53 in tumor initiation and progression[J].Cold Spring Harbor Pers Med，2016,6:a026104.

[25] Bretones G,Delgado MD,León J.Myc and cell cycle control[J].Biochim Biophys Acta，2015,1849:506-116.

[26] Dachineni R,Ai G,Kumar D,etal.Cyclin A2 and CDK2 as novel targets of aspirin and salicylic acid:a potential role in cancer prevention[J].Mol Cancer Res，2016,14:241-52.

[27] Vousden KH,Prives C.Blinded by the light:the growing complexity of p53[J].Cell，2009,137:413-431.

[28] Finlay CA,Hinds PW,Levine AJ.The p53 proto-oncogene can act as a suppressor of transformation[J].Cell，1989,57:1083-1093.