大孔樹脂對金釵石斛粗多糖脫色的研究

張　玉 ，　呂文平 *， 寇興然 ，　齊明月 ，　張露月 ， 劉成祥 ，　王洪新

（1.江南大學 國家功能食品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

金釵石斛 （Dendrobium nobile Lindl）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物[1-2]，是中國藥典（2010版）記載的名貴中藥材，具有滋陰、清熱、益胃生津、清肝明目和潤肺止咳等功效[3-5]。

多糖是金釵石斛中的主要功效成分之一[6-8]，研究表明，金釵石斛多糖具有免疫調節(jié)、抑制腫瘤細胞生長、抗衰老等功效[9-10]。傳統(tǒng)方法提取的金釵石斛粗多糖往往含有色素等物質。色素的存在不僅影響多糖的品質，而且也是影響金釵石斛多糖價格的重要因素[11]。目前，石斛粗多糖溶液的脫色方法常常采用活性炭吸附法和雙氧水氧化法等方法[12]，但以上方法耗時長、多糖保留率低，結構易破壞，脫色劑難去除。

大孔樹脂作為一種廉價高效的高分子吸附材料，不僅處理量大、好，而且解吸與再生處理容易等[13]，被較多地用于多糖的脫色研究[14-15]，但尚未見應用于金釵石斛粗多糖脫色的研究報道[16]。本研究篩選出了適合金釵石斛粗多糖脫色的最佳樹脂，而且利用響應面法對金釵石斛粗多糖脫色工藝進行了優(yōu)化[17]。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

金釵石斛材料，來源于貴州赤水國禮金釵石斛發(fā)展有限公司；LSA-700、LSD-762樹脂，購于西安藍曉科技新材料有限公司；AB-8、D900、D101樹脂，購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；95%乙醇、苯酚、濃硫酸、鹽酸及氫氧化鈉均為國產分析純，購于國藥集團。

1.2　實驗儀器

搖擺式中藥粉碎機：溫嶺市奧力中藥機械有限公司產品；DHG-9075A型恒溫鼓風干燥箱：金壇市瑞華儀器有限公司產品；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州榮冠實驗分析儀器廠制造；電子分析天平：奧豪斯儀器 （上海）有限公司產品；BC-W203旋轉蒸發(fā)儀：上海貝凱生物化工設備有限公司產品；EX4-1.8離心機：北京京立離心機有限公司產品；UV1800全波長掃描儀：日本島津公司產品。

1.3　實驗方法

1.3.1金釵石斛粗多糖的制備金釵石斛（水分質量分數(shù)<12%）粉粹，過60目篩，置于三孔燒瓶中，以料液比 1∶40 （g/mL）加蒸餾水，60 ℃攪拌提取 4 h，過濾、濃縮，加入4倍體積無水乙醇使溶液含醇體積分數(shù)至80%，4℃放置12 h，過濾、80%乙醇洗滌得沉淀，40℃真空干燥即得金釵石斛粗多糖[18]。多糖質量分數(shù)32.4%。

1.3.2脫色方法與樹脂篩選采用靜態(tài)吸附法[19]對金釵石斛粗多糖溶液進行脫色處理，取2 g預處理過的樹脂置于具塞錐形瓶中，加入20 mL質量濃度為2 g/dL粗多糖樣品溶液，在轉速為120 r/min、溫度為30℃的搖床中振蕩3 h，觀察濾液顏色變化，在450 nm處測定多糖溶液脫色前后的吸光度值，計算脫色率。

1.3.3金釵石斛粗多糖脫色率及保留率的計算金釵石斛粗多糖含量測定方法，采用苯酚－硫酸法［20］；脫色前后采用450 nm波長為檢測多糖溶液[21]。

多糖脫色率X（%）=（OD脫色前-OD脫色后）/OD脫色前×100%

（1）

多糖保留率 Y（%）=D2/D1（2）

式（2）中，D1、D2：分別為脫色前后溶液中多糖的質量分數(shù)。

1.3.4脫色條件優(yōu)化

1）單因素試驗分別取10 mL質量濃度為2 g/dL的樣品溶液，采用靜態(tài)吸附法[22]，比較脫色時間、脫色溫度、樹脂用量對金釵石斛粗多糖溶液脫色效果的影響。

2）響應面試驗設計在單因素試驗結果的基礎上，根據(jù)Box-Behnken響應面設計原理[23]，選取脫色時間（X1）、脫色溫度（X2）和樹脂用量（X3）這 3 個因素，采用3因素3水平的Box-Behnken法進行試驗設計，試驗自變量因素及水平編碼見表1。

表1　Box-Behnken方案設計的因素及水平編碼Table 1　Coded values of corresponding actual values of independent variables in response surface design

1.3.5數(shù)據(jù)分析實驗各組數(shù)據(jù)均以x±s表示，應用spss20.0軟件處理各組數(shù)據(jù)，采用One-Way ANOVA法分析各組實驗數(shù)據(jù)之間的差異顯著關系[24]。其中，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。響應面實驗中采用Design Expert 8.0軟件制圖。

2　結果與分析

2.1　樹脂的篩選

利用5種大孔樹脂對金釵石斛多糖溶液進行脫色處理，D900、LSA700的脫色率分別為83.0%和82.4%，脫色的效果較好，D900的多糖保留率高于LSA762，見表2。因此，本實驗中選擇D900作為金釵石斛粗多糖脫色的樹脂。

表2　5種大孔樹脂脫色率（X）與多糖保留率（Y）Table 2　Assessment of different resinon decolorization rate and polysaccharide retention rate

2.2　單因素實驗結果

2.2.1溫度對脫色效果的影響脫色率隨溫度的升高而升高；溫度達到50℃之后，脫色率下降，在40℃條件下脫色率達到82.4%，見圖1。吸附是放熱過程，色素分子的擴散速度歲溫度升高加快，利于吸附；當達到吸附平衡時，色素的解吸速度同樣會加快，脫色率也會隨之下降，因此Box-Behnken設計實驗中脫色溫度范圍應選在30～50℃。

圖1　溫度對金釵石斛粗多糖脫色率和保留率的影響Fig.1　Effect of temperature on decolorization rateand polysaccharide retention rate

2.2.2樹脂用量對脫色效果的影響樹脂用量對脫色效果的影響由圖2可知，隨著樹脂用量的增加脫色率不斷升高，但當樹脂用量高于0.3 g/mL時，金釵石斛粗多糖溶液的脫色率增幅放緩，可能由于樹脂與多糖溶液之間達到吸附飽和，因此Box-Behnken設計實驗中選擇樹脂用量范圍為0.2～0.4 g/mL。

圖2　樹脂用量對金釵石斛粗多糖脫色率和保留率的影響Fig.2　Effect of resin on decolorization rateand polysaccharide retention rate

2.2.3時間對脫色效果的影響隨著吸附時間的延長，金釵石斛脫色率逐漸增大，從第4小時開始，多糖的保留率開始大幅度下降，可能是由于此時樹脂的吸附速率大于解吸速率，見圖3。因此，多糖保留率隨脫色時間的延長，呈現(xiàn)出略微的下降趨勢。綜合考慮，選擇脫色時間2～4 h作為響應面設計實驗的脫色時間范圍。

圖3　時間對金釵石斛多糖脫色率和保留率的影響Fig.3　Effect of time on decolorization rateand polysac charide retention rate

2.3　響應面實驗結果與分析

2.3.1數(shù)學模型的建立采用Design Expert8.0軟件對脫色率響應值進行回歸擬合，建立二次回歸模型，得回歸方程：

對上述方程進行方差分析，如下表3，R2＝0.980 8，說明實驗擬合程度良好，失擬項的p值為0.142 6，說明模型失擬項不顯著，校正系數(shù)說明此模型能說明實驗中97.61%的響應值的變化，可用來分析金釵石斛粗多糖脫色率[25]。此外，時間X1、溫度X2、樹脂用量X3對金釵石斛粗多糖的脫色率有極顯著影響；交互作用項均對脫色率有顯著影響；其他變量的影響均不顯著。由表3可知，影響金釵石斛粗多糖脫色率因素的順序為 X2（溫度）＞X1（時間）＞X3（樹脂用量）。

2.3.22因素間的交互效應分析根據(jù)表3，可知X1X2、X1X3對脫色率的影響顯著，而X2X3的影響不顯著，回歸方程作出響應面分析圖（見圖4）：脫色率隨 X1X2、X1X3、X2X3的改變而改變，呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，從響應面的最高點即該模型存在穩(wěn)定點，且穩(wěn)定點就是最大值[24]。

2.3.3最優(yōu)值預測及方法驗證軟件解析得出金釵石斛粗多糖溶液的最佳脫色條件為：D900樹脂用量為0.327 g/mL、脫色時間為3.70 h、脫色溫度為39.17℃，在此條件下，金釵石斛粗多糖溶液脫色率理論值為83.4%?？紤]到實際操作的方便性和優(yōu)化結果的準確性，將提取條件更改為D900樹脂用量為0.33 g/mL、脫色時間為3.7 h、脫色溫度為40℃，3次重復實驗測出金釵石斛粗多糖溶液脫色率為82.7%，多糖保留率76.5%，與理論值相比，相對誤差僅僅是0.7%。

表3　方差分析表Table 3　Analysis of variance table

圖4　兩因素交互影響脫色率的響應面圖Fig.4　Response surfaces of the pairwise interactive effects of two decolorization conditions on decolorization rate

本實驗中得到的金釵石斛粗多糖脫色工藝，多糖的脫色率保留率分別達到了82.7%和76.5%。而黃森等研究中的石斛多糖脫色率為65.47%；在活性炭脫色時，會殘留活性炭；雙氧水脫色法對多糖的分子結構具有很大的破壞性[12，26]。因此，本實驗優(yōu)化的工藝不僅僅條件溫和，成本低，同時多糖的保留率也較高。

3　結語

本實驗作者通過篩選合適樹脂，利用RSM響應面法設計金釵石斛的脫色條件，構建脫色率與脫色時間、樹脂用量和脫色溫度三者之間的數(shù)學模型，確定了金釵石斛粗多糖的最佳脫色工藝為：D900樹脂用量為3.3 g、脫色時間為3.7 h、脫色溫度為40℃，經3次平行實驗，得到脫色率為82.7%，保留率為76.5%，可以預見該回歸模型具有很好的預測性，對金釵石斛多糖的進一步研究和深度開發(fā)具有一定的實踐意義。

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