梁寒峭， 陳建國， 張 露，　程 池

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京100015）

已有研究表明多酚類物質(zhì)是諾麗植物中重要的活性成分，在發(fā)酵果汁中的質(zhì)量濃度可達(dá)1.14 mg/mL[5]。目前從諾麗果實(shí)、根、莖和葉中分離得到酚類化合物主要有黃酮類、香豆素類、木脂素類和酚酸類，其中香豆素是一類具有抗腫瘤，抗炎，抗病毒，保肝及抑制血小板活化因子（PAF）等生理活性的成分[6]。研究報(bào)道從諾麗果實(shí)中分離得到香豆素類成分如東莨菪亭（scopoletin）、異東莨菪亭（isoscopoletin）、東莨菪苷（scopolin）對(duì)脂肪氧合酶和低密度脂蛋白氧化反應(yīng)具有明顯地抑制作用，并且對(duì)黑色素的生成也具有抑制活性[7-9]，此外從諾麗葉中也分離得到了香豆素類成分pteryxin和peucedanocoumarin III[10]，但目前仍未見諾麗發(fā)酵果汁中香豆素成分含量的文獻(xiàn)報(bào)道。因此本研究建立了香豆素成分含量的測(cè)定方法，并對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間的諾麗果汁樣品進(jìn)行了含量的測(cè)定與比較。

1　材料與方法

1.1　儀器與材料

UNICO-JV2000紫外分光光度計(jì)，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品：AB204-N萬分之一電子天平，瑞士梅特勒儀器有限公司產(chǎn)品；電子天平，METTLER-TOLEDO公司產(chǎn)品；離心機(jī)，Eppendorff公司產(chǎn)品。

諾麗發(fā)酵果汁由海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司提供；東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品由北京盈澤納新化工技術(shù)研究院提供（批號(hào)14081804），甲醇、乙醇等其它試劑均為分析純，北京化工廠生產(chǎn)。

1.2　樣品溶液的制備

精密量取樣品10.0 mL，置于100 mL的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密移取31.25 mL置于100 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻離心，上清液即得樣品溶液。

1.3　對(duì)照品溶液的制備

精密稱取東莨菪內(nèi)酯（scopoletin）對(duì)照品11.20 mg置于50 mL的容量瓶中，用甲醇溶解，制成母液。精密移取3 mL母液置于10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2　結(jié)果與討論

2.1　測(cè)定波長的選擇

吸取對(duì)照品溶液和樣品溶液在190～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖1和圖2。

圖1　對(duì)照品溶液吸收光譜Fig.1　Absorption spectrum of reference

圖2　樣品溶液吸收光譜Fig.2　Absorption spectrum of sample

由上圖可知，對(duì)照品溶液和樣品溶液在348 nm處都有最大吸收峰，因此確定348 nm為測(cè)定波長。

（1）將配置好的黑色橡膠混合料運(yùn)至攤鋪區(qū)域，開始人工攤鋪，控制好攤鋪速度，以確保塑膠面層的密實(shí)度和平整度，將攪拌好的黑色橡膠顆粒用送料車送到鋪設(shè)地點(diǎn)，用刮尺攤鋪，均勻攤平。

2.2　線性關(guān)系考察

精密吸取東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 分別置于 10 mL 的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在348 nm處進(jìn)行測(cè)定，并以吸光度（y）對(duì)質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.067 7x+0.019 8（r=0.999 2），結(jié)果表明對(duì)照品在0～0.020 mg/mL具有良好的線性關(guān)系。

2.3　精密度試驗(yàn)

取1.2項(xiàng)下制備的樣品溶液，以甲醇為空白對(duì)照，連續(xù)6次測(cè)定其在348 nm處的吸光度，計(jì)算RSD為0.16%，表明儀器精密度良好。

2.4　重復(fù)性試驗(yàn)

取1.2項(xiàng)下制備的樣品溶液，以甲醇為空白對(duì)照，在348 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得其吸光度并計(jì)算RSD值為1.88%，表明樣品的重復(fù)性良好（n=6）。

2.5　穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取東莨菪內(nèi)酯對(duì)照品溶液，分別在0、10、20、40、80、120、240 min 時(shí) 348 nm 處進(jìn)行紫外測(cè)定，測(cè)得吸光度并計(jì)算RSD值為0.62%，表明對(duì)照品在240 min內(nèi)的穩(wěn)定性良好。取1.2項(xiàng)下制備的樣品溶液，分別在 0、10、20、40、80、120、240 min，以甲醇為空白對(duì)照，在348 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)得其吸光度并計(jì)算RSD值為1.34%，結(jié)果表明樣品在240 min內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.6　加樣回收率的考察

精密量取1.2項(xiàng)下所配樣品溶液9份，各1.0 mL分別置于5 mL的容量瓶中，精密量取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液1.00 mL（0.067 2 mg），1.35 mL（0.090 7 mg），1.60 mL（0.107 5 mg）3個(gè)水平各3份加入樣品溶液中，加甲醇稀釋至刻度，并以甲醇為空白對(duì)照，在348 nm處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算平均回收率為102.44%，RSD為1.81%，結(jié)果見表1，表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確可靠。

表1　樣品加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1　Recovery test of the samples

2.7　樣品測(cè)定

精密量取4個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間的諾麗果汁樣品，按照1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以甲醇為空白對(duì)照，在348 nm處測(cè)定吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算香豆素質(zhì)量濃度。發(fā)酵25 d至500 d的諾麗果汁中香豆素質(zhì)量濃度在17.59～24.26 mg/dL范圍內(nèi)，結(jié)果見表2。

表2　不同發(fā)酵時(shí)間諾麗果汁的香豆素質(zhì)量濃度結(jié)果Table 2　Coumarins content in Noni jucie with different fermented time

3　結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)建立的紫外分光光度法測(cè)定諾麗發(fā)酵果汁中總香豆素質(zhì)量濃度的方法簡便快捷且穩(wěn)定可靠，適用于液體類樣品中香豆素成分質(zhì)量濃度的檢測(cè)。

前期文獻(xiàn)報(bào)道諾麗植物中所含香豆素主要為吡喃型香豆素，已分離得到東莨菪內(nèi)酯、異東莨菪內(nèi)酯、東莨菪苷，東莨菪內(nèi)酯具有解熱、舒張血管和抑制PC3細(xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡等生理活性[11-13]，是諾麗發(fā)酵果汁中的一類重要活性物質(zhì)。本研究結(jié)果顯示諾麗發(fā)酵果汁中香豆素成分的質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時(shí)間的增長變化不大，表明此類成分在發(fā)酵過程中較穩(wěn)定。本研究為后期諾麗發(fā)酵工藝的研究及相關(guān)生產(chǎn)的質(zhì)量控制奠定了理論基礎(chǔ)。

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