QuEChERS-UPLC-MS/MS同時測定牛奶和奶粉中42 種類固醇激素

陳曉鵬，顧采琴*，綦 艷，張施敬

類固醇激素是一類具有強(qiáng)且持久的蛋白同化作用的四環(huán)脂肪烴化合物，包括天然及人工合成的糖皮質(zhì)激素、孕激素、雌激素等。由于類固醇激素具有較強(qiáng)的抗炎作用，并可促進(jìn)動物超常態(tài)生長，能夠大幅提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，在養(yǎng)殖業(yè)中經(jīng)常被大量使用。濫用該類激素則會造成動物乳源不同程度藥物殘留，人類食用后可導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、發(fā)育異?；驖撛谥掳?、致畸風(fēng)險[1]。因此世界各國均規(guī)定了動物源性食品中各種激素的最大殘留量，歐盟第96/22/EC指令、美國食品藥品管理局、日本肯定列表也禁止在食品源性動物中使用激素類藥物。我國農(nóng)業(yè)部文件《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[2]規(guī)定牛奶中氫化可的松的最大殘留量為10 μg/kg，歐盟規(guī)定地塞米松、潑尼松龍在牛奶中的最大殘留量分別為0.3、6 μg/kg[3]。為加強(qiáng)對乳制品污染的監(jiān)控，有效監(jiān)督我國奶粉質(zhì)量現(xiàn)狀，必須發(fā)展靈敏可靠的多種激素檢測方法，以期通過有效監(jiān)測，對可能發(fā)生的污染狀況進(jìn)行預(yù)測，并采取必要的措施預(yù)防食品危害的發(fā)生。

牛奶和奶粉中除了含有內(nèi)源性孕激素、雌激素外，其他所有化學(xué)合成類激素均屬于禁用藥物。目前國內(nèi)外已有許多激素檢測的標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)，但對乳制品中多激素殘留檢測方法卻少有報道，國家標(biāo)準(zhǔn)暫未發(fā)布權(quán)威的檢測方法。檢測類固醇激素主要有氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5-8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9-12]和液相色譜-質(zhì)譜法[13-17]。氣相色譜和高效液相色譜法方法靈敏度較低，選擇性和特異性差，不適合多激素藥物殘留的分析。氣相色譜-質(zhì)譜方法雖然靈敏度和特異性都很高，可以滿足殘留分析的要求，但衍生過程繁瑣。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜是分析動物源性食品中激素殘留的一種重要方法，該方法靈敏度高，選擇性和特異性好，能夠?qū)Φ蜐舛葮悠泛芎玫卮_認(rèn)，已用于多類復(fù)雜基質(zhì)中的激素測定[18-20]。

Anastassiadas等2003年開發(fā)了分散固相萃取技術(shù)QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）[21]，這是一種將目標(biāo)化合物的提取或分離與凈化相結(jié)合的原創(chuàng)方法，最早在農(nóng)藥多殘留中使用[22-25]。本實驗將QuEChERS技術(shù)應(yīng)用于樣品前處理，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立牛奶和奶粉中42 種類固醇激素殘留量的檢測方法，該方法簡單、快速、準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售樣品牛奶、奶粉，均為監(jiān)督抽檢試樣。

42 種類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)品：潑尼松龍（純度99.4%）、氫化可的松（純度99.8%）、潑尼松（純度99.7%）、可的松（純度98%）、甲基潑尼松龍（純度99.5%）、倍他米松（純度98.8%）、地塞米松（純度98.9%）、氟米松（純度98.0%）、倍氯米松（純度96.0%）、曲安奈德（純度98.4%）、氟氫縮松（純度99.4%）、曲安西龍雙醋酸酯（純度98.9%）、潑尼松龍醋酸酯（純度99.1%）、氟米龍（純度99.6%）、氫化可的松醋酸酯（純度99.5%）、地夫可特（純度98.0%）、氟氫可的松醋酸酯（純度98%）、潑尼松醋酸酯（純度99.5%）、可的松醋酸酯（純度99.4%）、甲基潑尼松龍醋酸酯（純度99.1%）、倍他米松醋酸酯（純度97.5%）、布地奈德（純度98.0%）、氫化可的松丁酸酯（純度99.5%）、地塞米松醋酸酯（純度98.0%）、氟米龍醋酸酯（純度99.2%）、氫化可的松戊酸酯（純度99.5%）、曲安奈德醋酸酯（純度99.1%）、氟輕松醋酸酯（純度98%）、二氟拉松雙醋酸酯（純度98.6%）、倍他米松戊酸酯（純度98.5%）、潑尼卡酯（純度99.2%）、哈西奈德（純度99.2%）、阿氯米松雙丙酸酯（純度99.2%）、安西奈德（純度99.7%）、氯倍他索丙酸酯（純度99.0%）、氟替卡松丙酸酯（純度99.2%）、莫米他松糠酸酯（純度99.7%）、倍他米松雙丙酸酯（純度99.0%）、倍氯米松雙丙酸酯（純度99.8%）、氯倍他松丁酸酯（純度98%）、醋酸甲地孕酮（純度99.0%）、黃體酮（純度99.2%）以上購自德國Dr. Ehrenstorfer公司、上海安譜實驗科技股份有限公司、壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

乙腈（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（分析純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂、中性氧化鋁（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；PSA（40～60 μm，60A）、C18（40～60 μm）上海安譜科學(xué)儀器有限公司；超純水由Milli-Q Element超純水系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Xevo TQ高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國沃特世科技有限公司；JJ500Y電子天平 富陽騰輝電子科技有限公司；JP-C600超聲波提取器 廣州市吉普超聲波電子設(shè)備有限公司；MS3渦旋混合器 德國艾卡公司；CM200-2氮吹儀 北京成萌偉業(yè)科技有限公司；3-18K高速臺式冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；Milli-Q Element超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL）配制：準(zhǔn)確稱取42 種類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg，用甲醇分別溶解定容至10.0 mL，于－18 ℃冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)混合儲備溶液（10 μg/mL）配制：分別取標(biāo)準(zhǔn)儲備液1.0 mL混合，用甲醇定容至100 mL，于－18 ℃冷凍保存。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：臨用時用40%乙腈溶液溶解的樣品空白基質(zhì)提取液稀釋成0.5、1、5、10、25、50、100、250、500 μg/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 儀器條件

1.3.2.1 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；毛細(xì)管電壓：2.83 kV；離子源溫度：150 ℃；去溶劑溫度：600 ℃；去溶劑氣體流量：氮氣，1 000 L/h；碰撞氣：氬氣；分段式多反應(yīng)監(jiān)測模式采集。42 種類固醇激素的保留時間、母離子、子離子以及對應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見表1。

表1 42 種類固醇激素的質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimized parameters for mass spectrometric analysis of 42 steroid hormones in the MRM mode

續(xù)表1

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液；柱溫：30 ℃；梯度洗脫程序見表2。

表2 高效液相色譜梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions of HPLC

1.3.3 樣品前處理

1.3.3.1 奶粉

準(zhǔn)確稱取2 g（精確到0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入4 mL 50 ℃溫水溶解，渦旋混勻1 min，準(zhǔn)確加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液，渦旋振蕩2 min，超聲提取15 min。加入1 g氯化鈉和3 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩2 min，9 000 r/min高速冷凍離心5 min。取上清液約8 mL置于裝有50 mg C18、100 mg PSA、300 mg中性氧化鋁和300 mg無水硫酸鎂的另一離心管中，渦旋振動2 min，9 000 r/min高速冷凍離心3 min。準(zhǔn)確移取5 mL上清液于10 mL離心管中，45 ℃氮氣流吹干，用1 mL 40%乙腈溶液溶解殘渣。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.3.2 牛奶

準(zhǔn)確稱取5 g（精確到0.01 g）試樣于50 mL離心管中，以下步驟同1.3.3.1節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

選擇一系列C18（ODS/SB/BEH）型色譜柱進(jìn)行峰形比較，在相同色譜質(zhì)譜條件下Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）柱更能夠獲得尖銳對稱的優(yōu)異峰形，選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性好，確定其為本方法的色譜分離柱。Van Den Hauwe等[26]在分析糖皮質(zhì)殘留時，采用乙腈和不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸（0.05%～0.3%）溶液作為流動相，甲酸體積分?jǐn)?shù)在0.05%～0.1%之間時，隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的增加，16 種糖皮質(zhì)激素的響應(yīng)值逐漸增加；但甲酸體積分?jǐn)?shù)在0.1%～0.3%之間時，隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的增加，響應(yīng)值又逐漸降低；本實驗比較了乙腈-0.1%甲酸溶液、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液（含5 mmol/L乙酸銨）的3 種流動相方案，測試100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同條件不同流動相體系中的響應(yīng)值差異，結(jié)果以某種流動相體系與A流動相體系中42 種激素響應(yīng)平均值的比值計算，繪制變化曲線（圖1）。結(jié)果表明，流動相含有乙酸銨和體積分?jǐn)?shù)過高的甲酸，反而會影響離子化效率，降低響應(yīng)值，而乙腈-0.1%甲酸溶液流動相體系能提供最佳離子化條件，峰面積信號最強(qiáng)，靈敏度最高，符合以上結(jié)論。

圖1 不同流動相的比較Fig. 1 Comparison of different mobile phases

2.2 質(zhì)譜條件的確定

在電噴霧質(zhì)譜、正離子監(jiān)測模式下，分5 組將質(zhì)量濃度為1 μg/mL的類固醇激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以5 μL/min的流速直接注入質(zhì)譜儀中進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，分別優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度和流量獲得各種化合物的母離子峰[M＋H]＋。根據(jù)歐盟2002/657/EC決議中有關(guān)質(zhì)譜分析方法必須不少于4 個識別點的規(guī)定[27]，選擇各個待測化合物碰撞后所得豐度較高的兩個子離子作為定量和定性離子，并確定其最佳碰撞能量的電壓值，最終確定的母離子、子離子相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。由于同時測定的化合物較多，質(zhì)譜在單位時間內(nèi)獲得的掃描次數(shù)較少，因此建立42 種目標(biāo)化合物的分段式多反應(yīng)監(jiān)測模式質(zhì)譜掃描方案，從而確保離子在準(zhǔn)確定量的情況下仍有較高的靈敏度，并能有效減少化合物之間的相互干擾。42 種類固醇激素的分段式總離子流色譜圖見圖2。

圖2 42 種類固醇激素的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current (TIC) chromatograms of 42 steroid hormones

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化

大部分類固醇激素的極性較低，容易溶于脂肪含量較高的基質(zhì)中，在弱極性或中等極性有機(jī)溶劑中有較高的溶解性，常用的提取溶劑包括乙醚、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、叔丁基甲醚、正己烷、氯仿、二氯甲烷。趙文榮等[28]挑選了幾種溶劑進(jìn)行提取效果比對實驗，結(jié)果顯示正己烷和乙醚與水不分層，共萃物多，干擾嚴(yán)重；乙酸乙酯與水不互溶，程序復(fù)雜，容易導(dǎo)致基質(zhì)損失；而乙腈較甲醇分層效果好，具有沉淀蛋白作用，響應(yīng)高基質(zhì)影響小。蛋白質(zhì)和脂肪是奶粉和牛奶中的主要干擾物，高速冷凍離心能夠分離沉淀部分脂肪，在提取過程中用適量的乙腈和含有甲酸的酸化乙腈[3]能夠更好地去除雜質(zhì)。因此本實驗確定采用乙腈體系進(jìn)行提取，并且比較了乙腈和0.1%甲酸-乙腈兩種溶劑的提取效果（圖3），結(jié)果表明，0.1%甲酸-乙腈作為提取溶劑的加標(biāo)回收率稍高于乙腈，且提取效果優(yōu)于后者。

圖3 不同溶劑對42 種類固醇激素的提取效果Fig. 3 Extraction efficiencies of 42 steroid hormones with different solvents

2.3.2 凈化填料的優(yōu)化

PSA、C18是QuEChERS方法常用的吸附劑。PSA可有效去除乙腈提取液中的脂肪酸、糖類、酚類以及極性色素等成分，C18具有良好的除脂能力，并能吸附部分色素和維生素，但在實際操作中發(fā)現(xiàn)，對于脂肪含量較高的奶粉試樣，提取液經(jīng)C18和PSA凈化后脂肪的去除效果并不理想。中性氧化鋁對大部分目標(biāo)物的吸附較少，因此可以作為凈化劑進(jìn)一步優(yōu)化，凈化后的溶液較之前清澈透亮，基線較平整，回收率在80%～120%之間，可以滿足目標(biāo)物痕量分析的要求。由于PSA、C18和中性氧化鋁3 種凈化填料，使用量少則達(dá)不到凈化要求，使用量大則產(chǎn)生吸附，影響回收率，因此本實驗考察各種填料的最佳使用量（圖4～6），最終采用50 mg C18、100 mg PSA、300 mg中性氧化鋁和300 mg無水硫酸鎂的組合方案進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示，樣品溶液澄清、基質(zhì)干擾小，回收率佳。

圖4 C18加入量對目標(biāo)物回收率的影響Fig. 4 Effects of C18 dosage on the recovery of the target compounds

圖5 PSA加入量對目標(biāo)物回收率的影響Fig. 5 Effects of PSA dosage on the recovery of the target compounds

圖6 中性氧化鋁加入量對目標(biāo)物回收率的影響Fig. 6 Effects of alumina-N dosage on the recovery of the target compounds

2.3.3 定容液的優(yōu)化

在多激素殘留的同時定性定量分析中，定容液的極性與目標(biāo)化合物的響應(yīng)和峰形密切相關(guān)。本實驗采用乙腈-水作為定容液，對兩種溶液的比例進(jìn)行考察。選擇極性遞增的4 個比例定容液，比較各種類型定容液的響應(yīng)值及分離度差異。由圖7可見，當(dāng)定容液隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的升高，峰形逐漸變差，分離度下降。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為40%時，42 種激素的響應(yīng)值最高，而且峰形優(yōu)異，最終確定其為本方法的定容液。

圖7 不同定容液對峰形和響應(yīng)值的影響Fig. 7 Effects of different solvents on peak shape and response

2.3.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

基質(zhì)效應(yīng)是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測試中最常碰到的干擾效應(yīng)，尤其對于基質(zhì)復(fù)雜的樣品（如動物源食品及生物樣本）中表現(xiàn)得尤為明顯，分為基質(zhì)抑制效應(yīng)和基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，是由基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在電噴霧離子源進(jìn)行離子化時相互競爭導(dǎo)致的結(jié)果。基質(zhì)效應(yīng)可以通過比較待測物加入空白提取液中的響應(yīng)值與待測物在純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值之比來確定其高低，該方法能夠?qū)|(zhì)效應(yīng)進(jìn)行定量計算和評價[29]。乳制品盡管經(jīng)過乙腈沉淀蛋白、分散固相萃取后得到良好的凈化效果，但仍然無法完全消除其基質(zhì)效應(yīng)。為保證最終結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，有必要引入基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，盡可能降低基質(zhì)效應(yīng)造成的影響。

2.4 方法驗證

2.4.1 專屬性分析

取市售空白基質(zhì)奶粉，該試樣除了含有內(nèi)源性黃體酮外，并未檢出其他干擾性成分，作為空白樣品，加標(biāo)回收計算時應(yīng)減去相應(yīng)本底空白值。空白基質(zhì)奶粉和42 種類固醇激素的空白樣品添加（100 μg/kg）色譜圖見圖8。42 種類固醇激素分布在1～9 min之內(nèi)，分離良好。

圖8 空白奶粉（a）和空白奶粉添加（100 μg/kg）（b）色譜圖Fig. 8 Chromatograms of negative control (a) and milk powder spiked at 100 μg/kg (b)

2.4.2 線性和檢出限

用空白樣品基質(zhì)提取液配制42 種類固醇激素的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1、5、10、25、50、100、250、500 μg/L，在優(yōu)化的實驗條件下分離檢測，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以定量離子的峰面積（y）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到目標(biāo)化合物的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r2）。如表3所示，42 種待測物的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.99，表明各目標(biāo)化合物在1～500 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表3 42 種類固醇激素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、LOD及LOQTable 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients,limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of 42 steroid hormones

續(xù)表3

在空白奶粉和牛奶樣品中添加一定質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液與空白樣品混合均勻后，按本研究建立的方法進(jìn)行檢測，以信噪比大于或等于10確定奶粉中各化合物的定量限（limit of quantitation，LOQ）為0.5～4.5 μg/kg，以信噪比大于或等于3確定各化合物的檢出限（limits of quantification，LOD）為0.15～1.5 μg/kg；牛奶中各化合物的LOQ為0.2～1.8 μg/kg，LOD為0.06～0.5 μg/kg。

2.4.3 回收率和精密度實驗結(jié)果

在奶粉和牛奶的空白樣品中分別添加42 種類固醇激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，奶粉的加標(biāo)水平A1、A2、A3分別代表25、100、250 μg/kg，牛奶的加標(biāo)水平B1、B2、B3分別代表10、40、100 μg/kg，每個水平平行測試6 次計算方法的平均回收率和精密度。如表4和表5所示，奶粉中42 種類固醇激素的加標(biāo)回收率在70.7%～117.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%～14.7%之間；牛奶的加標(biāo)回收率在70.3%～118.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.6%～13.9%之間。兩種基質(zhì)的平均加標(biāo)回收率在70%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不超過15%。結(jié)果表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，符合分析要求。

表4 奶粉中42 種類固醇激素的平均回收率及精密度（n=6）Table 4 Average recoveries and precisions (RSDs) of 42 steroid hormones in milk powder (n= 6)

表5 牛奶中42 種類固醇激素的平均回收率及精密度（n= 6）Table 5 Average recoveries and precisions (RSDs) of 42 steroid hormones in milk (n= 6)

2.5 實際樣品的測定結(jié)果

分別對市場銷售的24 個奶粉樣品和24 個牛奶樣品進(jìn)行42 種類固醇激素殘留量的檢測，結(jié)果顯示，48 個乳制品中除了黃體酮外均未檢出其他41 種類固醇激素。奶粉中黃體酮的檢出含量為0.6～23.8 μg/kg，檢出率為95.8%；牛奶中黃體酮的檢出含量為0.3～0.8 μg/kg，檢出率為20.8%。黃體酮是卵巢黃體分泌的一種天然內(nèi)源性孕激素，在體內(nèi)對雌激素激發(fā)過的子宮內(nèi)膜有顯著形態(tài)學(xué)影響，為維持妊娠所必須[30]，因此在動物源性的乳制品中具有一定比例的檢出率。長期食用含有激素的食品可導(dǎo)致兒童性早熟，但關(guān)于黃體酮對嬰幼兒健康產(chǎn)生的健康影響，目前尚未有確切的定論。

3 結(jié) 論

本實驗采用QuEChERS前處理方法并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了乳制品中42 種類固醇激素殘留量的檢測方法。該方法前處理方法簡單、簡便有效、靈敏度高、選擇性好、準(zhǔn)確度和精密度高，回收率高且穩(wěn)定，可用于實際樣品的測定，為多激素殘留的同時檢測提供了新的檢測途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐錦忠, 張曉燕, 丁濤, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測雞肉和雞蛋中合成類固醇類激素和糖皮質(zhì)激素[J]. 分析化學(xué), 2009,37(3): 341-346. DOI:10.3321/j.issn:0253-3820.2009.03.006.

[2] 農(nóng)業(yè)部. 動物性食品中獸藥最高殘留限量: 農(nóng)業(yè)部公告第235號[R].2002-12-24.

[3] 崔曉亮, 邵兵, 趙榕, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧四極桿質(zhì)譜法同時測定牛奶中12 種糖皮質(zhì)激素的殘留[J]. 色譜, 2006, 24(3): 213-217. DOI:10.3321/j.issn:1000-8713.2006.03.001.

[4] SILVA A C, EBRAHIMI-NAJAFADABI H, MCGINITIE T M, et al. Thermodynamic-based retention time predictions of endogenous steroids in comprehensive two-dimensional gas chromatography[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2015, 407(14): 4091-4099.DOI:10.1007/s00216-015-8627-0.

[5] RANDAZZO G M, TONOLI D, HAMBYE S, et al. Prediction of retention time in reversed-phase liquid chromatography as a tool for steroid identification[J]. Analytica Chimica Acta, 2016, 916: 8-16.DOI:10.1016/j.aca.2016.02.014.

[6] 萬雋, 張曉光, 陳瑤. 糖皮質(zhì)激素類藥物對學(xué)齡前兒童CYP3A酶活性的影響[J]. 臨床藥學(xué)與研究, 2016, 27(11): 1473-1477.DOI:10.6039/j.issn.1001-0408.2016.11.11.

[7] LIAO K, MEI M, LI H, et al. Multiple monolithic fiber solidphase microextraction based on a polymeric ionic liquid with highperformance liquid chromatography for the determination of steroid sex hormones in water and urine[J]. Journal of Separation Science,2016, 39(3): 566-575. DOI:10.1002/jssc.201501156.

[8] HU Y, ZHANG M, TONG C, et al. Enrichment of steroid hormones in water with porous and hydrophobic polymer-based SPE followed by HPLC-UV determination[J]. Journal of Separation Science, 2013,36(20): 3321-3329. DOI:10.1002/jssc.201300663.

[9] CHA E, JEONG E S, CHA S, et al. Coupling of gas chromatography and electrospray ionization high resolution mass spectrometry for the analysis of anabolic steroids as trimethylsilyl derivatives in human urine[J]. Analytica Chimica Acta, 2017, 964: 123-133. DOI:10.1016/j.aca.2017.01.058.

[10] JANSSENS G, MANGELINCKX S, COURTHEYN D, et al.Simultaneous detection of androgen and estrogen abuse in breeding animals by gas chromatography-mass spectrometry/combustion/isotope ratio mass spectrometry (GC-MS/C/IRMS) evaluated against alternative methods[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2015, 63(34): 7574-7581. DOI:10.1021/acs.jafc.5b02746.

[11] CASALS G, MARCOS J, POZO O J, et al. Gas chromatographymass spectrometry profiling of steroids in urine of patients with acute intermittent porphyria[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(9): 819-824.DOI:10.1016/j.clinbiochem.2013.03.001.

[12] JANSSENS G, MANGELINCKX S, COURTHEYN D, et al. The use of gas chromatography-mass spectrometry/combustion/isotope ratio mass spectrometry to demonstrate progesterone treatment in bovines[J]. Journal of Chromatography A, 2016, 1449: 129-140.DOI:10.1016/j.chroma.2016.04.074.

[13] 祝偉霞, 劉亞風(fēng). 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定嬰幼兒配方奶粉中39 種激素殘留[J]. 色譜, 2010, 28(11): 1031-1037. DOI:10.3724/SP.J.1123.2010.01031.

[14] FAHLBUSCH F B, HEUSSNER K, SCHMID M, et al. Measurement of amniotic fluid steroids of midgestation via LC-MS/MS[J]. Journal of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 2015, 152: 155-160.DOI:10.1016/j.jsbmb.2015.05.014.

[15] KEEVIL B G. LC-MS/MS analysis of steroids in the clinical laboratory[J]. Clinical Biochemistry, 2016, 49(13/14): 989-997.DOI:10.1016/j.clinbiochem.2016.04.009.

[16] LI C, WU Y L, YANG T, et al, Rapid simultaneous determination of dexamethasone and betamethasone in milk by liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution[J]. Journal of Chromatography A, 2010, 1217(3): 411-414. DOI:10.1016/j.chroma.2009.12.015.

[17] HOLST B S, KUSHNIR M M, BERQUIST J. Liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for analysis of endogenous steroids in the luteal phase and early pregnancy in dogs: a pilot study[J]. Veterinary Clinical Pathology, 2015, 44(4): 552-558.DOI:10.1111/vcp.12301.

[18] 黃麗英, 張曉波, 陳小珍, 等. UPLC-MS/MS法分析嬰幼兒配方乳粉中12 種雌性激素[J]. 分析實驗室, 2014, 33(1): 54-58. DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2014.0012.

[19] 劉宏程, 李寧, 林濤, 等. 基質(zhì)固相分散-超高效液相色譜-質(zhì)譜檢測器測定牛奶中9 種類固醇激素殘留[J]. 色譜, 2015, 33(11): 1163-1168. DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.06035.

[20] 錢葉飛, 賈昌平, 魯輝, 等. UPLC-MS-MS快速檢測中成藥及保健食品中非法添加的38 種糖皮質(zhì)激素[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2016,22(10): 60-66. DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2016100060.

[21] 李彥, 關(guān)麗麗, 牟妍, 等. QuEChERS-UPLC-MS/MS檢測禽畜組織中金剛烷胺殘留[J]. 檢測分析, 2013, 24(23): 37-40. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2013.23.010.

[22] CALATAYUD-VERNICH P, CALATAYUD F, SIMO E, et al.Efficiency of QuEChERS approach for determining 52 pesticide residues in honey and honey bees[J]. MethodsX, 2016, 3: 452-458.DOI:10.1016/j.mex.2016.05.005.

[23] PAYA P, ANASTASSIADES M, MACK D, et al. Analysis of pesticide residues using the quick easy cheap effective rugged and safe (QuEChERS) pesticide multiresidue method in combination with gas and liquid chromatography and tandem mass spectrometric detection[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2007, 389: 1697-1714. DOI:10.1007/s00216-007-1610-7.

[24] BRUZZONITI M C, CHECCHINI L, DE CARLO R M, et al.QuEChERS sample preparation for the determination of pesticides and other organic residues in environmental matrices: a critical review[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2014, 406(17): 4089-4116.DOI:10.1007/s00216-014-7798-4.

[25] LOZOWICKA B, RUTKOWSKA E, JANKOWSKA M. Influence of QuEChERS modifications on recovery and matrix effect during the multi-residue pesticide analysis in soil by GC/MS/MS and GC/ECD/NPD[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2017, 24(8):7124-7138. DOI:10.1007/s11356-016-8334-1.

[26] VAN DEN HAUWE O, DUMOULIN F, ELLIOTT C, et al.Detection of synthetic glucocorticoid residues in cattle tissue and hair samples after a single dose administration using LC-MS/MS[J].Journal of Chromatography B, 2005, 817(2): 215-223. DOI:10.1016/j.jchromb.2004.12.006.

[27] The Commission of the European Communities 2002/657/EC.Commission Decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC Concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results[S]. Official Journal of the European Communities, 2002, L221: 8-36.

[28] 趙文榮, 李剛, 李寧, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測牛奶中13 種糖皮質(zhì)激素的殘留量[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工: 學(xué)刊, 2013(5): 66-69.DOI:10.3969/jissn.1671-9646(X).2013.05.047.

[29] MATUSZEWSKI B K. Standard line slopes as a measure of a relative matrix effect in quantitative HPLC-MS bioanalysis[J].Journal of Chromatography B, 2005, 830(2): 293-300. DOI:10.1016/j.jchromb.2005.11.009.

[30] 李佩斯. 國內(nèi)外嬰幼兒配方奶粉激素含量比較[J]. 中國乳業(yè), 2014,52(3): 52-54. DOI:10.16172/j.cnki.114768.2014.03.001.