辛小月 曲永利 袁 雪 高 巖 王 璐 張 帥 殷術(shù)鑫

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319)

患病的奶牛臨床治療通常采用注射β-內(nèi)酰胺類抗生素，如青霉素等[1]，這使得患病奶牛所產(chǎn)的奶中帶有抗生素，即使治療結(jié)束，奶牛所產(chǎn)的牛奶中仍然有抗生素殘留，所以將含有抗生素、高體細(xì)胞數(shù)的牛奶統(tǒng)稱為有抗奶，國外也稱之為廢奶。在德國，每年產(chǎn)生的有抗奶產(chǎn)量占總產(chǎn)奶量的1%～4%[2-3]，這些奶足夠飼喂給所有牛場的犢牛。有抗奶作為不計(jì)入成本的飼料，飼養(yǎng)者們選擇將其飼喂給犢牛來降低飼養(yǎng)成本。對于有抗奶的利用方式，根據(jù)作者所在研究小組2016年對黑龍江省300多個(gè)牛場調(diào)查的結(jié)果顯示，約95%的牛場使用有抗奶飼喂?fàn)倥?，而且其?6%的牛場不對有抗奶進(jìn)行相關(guān)處理。然而牛奶質(zhì)量對犢牛的生長發(fā)育和機(jī)體健康起著重要的作用，所以有必要對有抗奶對犢牛生長發(fā)育的影響進(jìn)行研究。按多數(shù)國家的標(biāo)準(zhǔn)定義，巴氏殺菌工藝是指“生牛奶中天然存在的堿性磷酸酶活性被鈍化而乳過氧化物酶活性依然得以保留的一大類熱處理工藝”，其目的在于殺滅牛奶中致病菌的同時(shí)最大限度地保存營養(yǎng)物質(zhì)和純正口感[4]。從全世界范圍來看，液態(tài)奶主要以巴氏殺菌奶的形式被消費(fèi)，巴氏殺菌奶在奶業(yè)發(fā)達(dá)國家占有很高的市場份額，在加拿大占99.9%、在美國占99.7%，英國、澳大利亞、新西蘭等國也在95%以上[5]，但我國僅占30%[6]。劉根濤等[7]通過飼喂巴氏殺菌初乳研究對犢牛生長性能及胃腸道發(fā)育的變化，結(jié)果顯示巴氏殺菌初乳顯著降低復(fù)胃重與活體重的比值，且能夠在一定程度上提高犢牛平均日增重，促進(jìn)犢牛生長發(fā)育、降低腹瀉率。韓云勝等[8]通過飼喂有抗奶研究對犢牛生長發(fā)育和血清免疫指標(biāo)的影響，結(jié)果顯示飼喂有抗奶顯著降低犢牛哺乳前期平均日增重，且在一定程度上提高犢牛斷奶前后的血清免疫指標(biāo)水平。國內(nèi)外學(xué)者對有抗奶在犢牛生長性能方面的研究結(jié)果不一，我國關(guān)于有抗奶在犢牛中的研究鮮有報(bào)道，對巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶在犢牛生長發(fā)育及血清免疫指標(biāo)影響的研究更為少見。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛生長發(fā)育和血清免疫指標(biāo)的影響，為國內(nèi)奶牛場有抗奶的科學(xué)有效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用18頭3日齡、體重[(42.82±0.35) kg]相近的健康荷斯坦奶公犢牛，隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組，每組9頭。對照組飼喂β-內(nèi)酰胺類有抗奶，試驗(yàn)組飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶，β-內(nèi)酰胺類有抗奶和巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶的飼喂溫度均控制在37～39 ℃。試驗(yàn)期為180 d。

1.2 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)飼喂?fàn)倥５哪叹鶃碓从谑褂忙?內(nèi)酰胺類抗生素治療的處于治療期和停藥期的泌乳奶牛所產(chǎn)的牛奶，牛奶中含有抗生素。巴氏殺菌的條件為63～65 ℃下加熱30 min。犢牛飼糧由顆粒料和優(yōu)質(zhì)羊草組成，配方均采用CPM軟件優(yōu)化形成。犢牛飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)犢牛出生0.5 h內(nèi)飼喂初乳4 kg/頭；β-內(nèi)酰胺類有抗奶和巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶的飼喂量：3～7日齡每日飼喂3次，5 kg/d；8～20日齡每日3次，5.5 kg/d；21～40日齡每日2次，4 kg/d；41～50日齡每日2次，3 kg/d；51～60日齡每日1次，1 kg/d。各組8日齡開始添加犢牛飼糧，每頭添加量為0.3 kg/d，61日齡斷奶后添加量為1.0 kg/d。提供充足的飲水，犢牛培育舍每天進(jìn)行清理，并定時(shí)進(jìn)行消毒，以確保為犢牛提供干凈的衛(wèi)生條件。

表1 犢牛飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 29 801 IU，VD38 278 IU，VE 83 mg，F(xiàn)e 132 mg，Cu 20 mg，Zn 132 mg，Mn 83 mg，I 1.66 mg，Se 0.66 mg，Co 0.66 mg。

2)產(chǎn)奶凈能為計(jì)算值，其余營養(yǎng)水平為實(shí)測值。NELwas a calculated value, while the other nutrient levels were measured values.

1.4 奶樣采集與分析測定方法

每10 d采集1次奶樣，每天采集3次(早、中和晚)，將采取的奶樣按4∶3∶3混合。取混合后奶樣50 mL于加入5%重鉻酸鉀防腐劑的測定管中，于4 ℃保存，用于乳成分測定。同樣取混合后奶樣50 mL于無菌瓶中，于4 ℃保存，用于收集后2 h內(nèi)總細(xì)菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量的測定。

1.4.1 乳成分

乳成分等采用Foss Milkoscan 133B乳成分分析儀(Foss Electric,丹麥)測定。

1.4.2 體細(xì)胞數(shù)

奶中體細(xì)胞數(shù)采用Foss (r) Bentley Somacount CC-5000體細(xì)胞測定儀(Foss Electric,丹麥)進(jìn)行測定。

1.4.3 抗生素含量

奶中抗生素含量采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS Agilent Technologies，美國)進(jìn)行測定。

1.4.4 細(xì)菌數(shù)

將奶樣以1∶10的比例梯度稀釋到10-7，每個(gè)梯度各取1 mL加入無菌培養(yǎng)基中，奶樣中的總細(xì)菌用平板瓊脂計(jì)數(shù)培養(yǎng)基(PCA)在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，大腸桿菌用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，沙門氏菌用SS培養(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)。

1.5 生長發(fā)育指標(biāo)測定

分別于犢牛30、60、90、180日齡晨飼前測定犢牛的體重和體尺指標(biāo)，并計(jì)算犢牛各階段的平均日增重。

1.6 血清免疫指標(biāo)測定

在犢牛飼養(yǎng)期的7、15、30、60、90及180日齡晨飼前對犢牛進(jìn)行空腹頸靜脈采血，離心(4 000 r/min，10 min)分離血清，分裝于離心管并于-20 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。犢牛血清免疫指標(biāo)免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測定，試劑盒均購于美國RD公司。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

整理后的數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件中的GLM過程對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以P<0.05表示為差異顯著，P<0.01表示為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 β-內(nèi)酰胺類有抗奶和巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶的成分

由表2可知，巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶中總細(xì)菌、大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量較β-內(nèi)酰胺類有抗奶均極顯著降低(P<0.01)，但乳糖率、乳蛋白率、乳脂率、乳總固形物率、尿素氮含量和體細(xì)胞數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。

表2 β-內(nèi)酰胺類有抗奶和巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶的成分

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母的表示差異極顯著(P<0.01)。表3同。

In the same row, values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as Table 3.

2.2 巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛生長發(fā)育的影響

由表3可知，試驗(yàn)組犢牛在3～60日齡期間的平均日增重顯著高于對照組(P<0.05)，2組間犢牛60～180日齡和3～180日齡期間的平均日增重及30、60、90和180日齡的體重差異均不顯著(P>0.05)，但試驗(yàn)組均略高于對照組。

表3 巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛體重的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗(yàn)組犢牛60日齡體高及90和180日齡胸圍均顯著提高(P<0.05)；2組間其他各時(shí)間點(diǎn)的體斜長、體直長、管圍、腿圍和胸深均無顯著性差異(P>0.05)。

表4 巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛體尺的影響

相同時(shí)間點(diǎn)、同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母的表示差異極顯著(P<0.01)。下表同。

In the same column, values at the same time point with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

2.3 飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛血清免疫指標(biāo)的影響

由表5可知，與對照組相比，試驗(yàn)組30日齡血清IgA含量顯著提高(P<0.05)，15和30日齡血清IgM含量顯著提高(P<0.05)，30日齡血清IgG含量顯著降低(P<0.05)；但這2組間在其他時(shí)間點(diǎn)血清IgA、IgM和IgG含量差異均不顯著(P>0.05)。與對照組相比，試驗(yàn)組15日齡血清IL-1β含量顯著提高(P<0.05)，7日齡血清IL-6含量顯著降低(P<0.05)，2組在各時(shí)間點(diǎn)血清IL-1β和IL-6含量差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)組和對照組7、15、30、60、90和180日齡血清IL-2和TNF-α含量均無顯著差異(P>0.05)。

表5 巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛血清免疫指標(biāo)的影響

3 討 論

3.1 β-內(nèi)酰胺類有抗奶和巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶的成分比較

β-內(nèi)酰胺類藥物因其廣譜低廉、使用方便及毒性低被用作奶牛臨床型和亞臨床型乳房炎及子宮內(nèi)膜炎的首選藥物。本試驗(yàn)中，2種奶中的抗生素含量無顯著差異，說明巴氏殺菌未對奶中抗生素含量造成影響，與Jorgensen等[9]的研究結(jié)果相一致。本試驗(yàn)中巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶中的乳脂率、乳蛋白率均達(dá)到了國際標(biāo)準(zhǔn)。雖然像乳蛋白等乳成分經(jīng)巴氏殺菌后有一定程度損失，但這2種奶之間并未表現(xiàn)出顯著差異，這與臧長江等[10]的研究結(jié)果一致。乳糖受巴氏殺菌的影響較小，其含量相對穩(wěn)定并可小范圍變化，這與本試驗(yàn)的結(jié)果相同[11]。朱正鵬等[12]研究表明，牛奶中的乳脂和乳糖等乳成分與牛奶中體細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)。然而，本試驗(yàn)中并未表現(xiàn)出這種負(fù)相關(guān)性。奶中體細(xì)胞數(shù)是評價(jià)奶牛健康的重要指標(biāo)。當(dāng)奶牛乳房受細(xì)菌侵染或是由擠奶機(jī)造成機(jī)械性損傷時(shí)，血液會分泌大量的白細(xì)胞來抵抗外來的感染并修復(fù)損傷組織，此時(shí)大量增幅的白細(xì)胞也會伴隨牛奶排出體外。因此，奶牛乳房發(fā)生炎癥時(shí)，牛奶中的體細(xì)胞數(shù)會迅速升高，甚至乳成分會隨之發(fā)生變化。本試驗(yàn)中的β-內(nèi)酰胺類有抗奶和巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶的體細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異，且均超過1×106個(gè)/mL，這符合泌乳奶牛所處的病理狀態(tài)，也說明巴氏殺菌對奶中體細(xì)胞數(shù)沒有影響。奶牛臨床型及亞臨床型乳房炎多數(shù)是由細(xì)菌感染引起的[13]。細(xì)菌在感染乳腺組織時(shí)能夠吸附在上皮細(xì)胞上，從而引發(fā)局部免疫反應(yīng)，其特征為紅腫、發(fā)炎和產(chǎn)奶量下降[14]?？偧?xì)菌數(shù)量是牛奶中總微生物污染的指標(biāo)，也是反映奶品質(zhì)量的重要指標(biāo)?？偧?xì)菌數(shù)量越高說明奶牛健康狀況越差，牛奶的品質(zhì)越差。本試驗(yàn)中，β-內(nèi)酰胺類有抗奶經(jīng)巴氏殺菌后，總細(xì)菌、大腸桿菌及沙門氏菌數(shù)量均極顯著降低，這與李龍柱等[15]的研究結(jié)果相符。根據(jù)Jorgensen等[16]的研究結(jié)果，巴氏殺菌可顯著降低大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量。本研究的結(jié)果也清楚地表明這一點(diǎn)，說明巴氏殺菌能夠有效地殺滅致病菌，降低通過牛奶傳播給犢牛疾病的風(fēng)險(xiǎn)，從而提高了奶的質(zhì)量。

3.2 巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛生長發(fā)育的影響

體重是反映犢牛生長狀況的一個(gè)重要指標(biāo)。Aust等[17]研究結(jié)果表明，犢牛飼喂廢棄奶后，沒有對犢牛的生長造成影響。有研究表明，飼喂巴氏殺菌有抗奶的犢牛在斷奶前后的體重均高于飼喂未經(jīng)巴氏殺菌有抗奶的犢牛。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組犢牛在3～60日齡期間的平均日增重顯著高于對照組，這與宋健等[18]研究結(jié)果相似，說明飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶可在一定程度上促進(jìn)犢牛的生長。這可能是由于巴氏殺菌使牛奶中總細(xì)菌及有害菌數(shù)量大量減少，降低了犢牛的潛在發(fā)病率，使?fàn)倥Ｌ幱诮】瞪L狀態(tài)。本試驗(yàn)中，各時(shí)間點(diǎn)時(shí)犢牛的體重及60～180日齡和3～180日齡期間的平均日增重差異均不顯著，表明飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶主要影響了犢牛哺乳期的增重，或者說飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶可潛在提高犢牛的生長。

體尺是衡量犢牛生長發(fā)育的重要指標(biāo)，可反映犢牛的骨骼發(fā)育情況和飼養(yǎng)管理水平[19-20]。Hill等[21]給出了部分荷斯坦?fàn)倥５捏w尺數(shù)據(jù)：體高86.4～93.1 cm，體斜長82.3～91.0 cm。本試驗(yàn)中犢牛60日齡體高和體斜長基本處于其給定的范圍內(nèi)，說明2組犢牛均屬于正常發(fā)育。另外，本試驗(yàn)中試驗(yàn)組犢牛60日齡的體高及90和180日齡的胸圍顯著高于對照組，這可能與試驗(yàn)組犢牛各時(shí)間點(diǎn)的體重和各時(shí)間段平均日增重均高于對照組有關(guān)。因此，綜合體重、體尺來看，飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛的生長發(fā)育有所促進(jìn)。

3.3 巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛血清免疫指標(biāo)的影響

免疫功能對于任何生物體來說都是必不可少的，可使生物體免受細(xì)菌、病毒及潛在微生物的侵襲。體液免疫是由免疫球蛋白來實(shí)現(xiàn)的，一定水平的免疫球蛋白能抵抗疾病且保證犢牛的健康[22]。IgA在局部黏膜免疫中起重要作用，IgM起到溶菌的作用且是新生動物消化道出現(xiàn)最早的免疫球蛋白，IgG含量高、半衰期長且是體液免疫中最主要的成分[23]。Daniels等[24]測定新生荷斯坦?fàn)倥Ｑ錓gG含量為1 385～2 182 mg/dL。本試驗(yàn)中犢牛血清IgG含量低于上述范圍。另外，本試驗(yàn)中試驗(yàn)組犢牛30日齡血清IgG含量顯著降低，這可能是因?yàn)槲唇?jīng)巴氏殺菌的β-內(nèi)酰胺類有抗奶中細(xì)菌數(shù)量高于巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶，從而激發(fā)犢牛免疫系統(tǒng)產(chǎn)生IgG。在本試驗(yàn)中飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶顯著提高了犢牛30日齡血清IgA含量以及15和30日齡血清IgM含量，這可能是由于對巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶的保存控制不得當(dāng)、飼喂不夠及時(shí)規(guī)范，未能有效抑制微生物的繁殖，導(dǎo)致巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶發(fā)生了再污染[25]。Zou等[26]指出，飼喂未處理的有抗奶給犢牛，導(dǎo)致犢牛血清中高含量的IgA和IgM，這與本試驗(yàn)結(jié)果不符。所以，犢牛的免疫球蛋白含量受多種因素影響且其變化范圍較大。

細(xì)胞因子參與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)，主要起促進(jìn)細(xì)胞分化增殖并產(chǎn)生抗體的作用。Kidd[27]報(bào)道，細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6和TNF-α常用來衡量和評價(jià)動物機(jī)體免疫功能狀態(tài)。金寧一等[28]研究表明，IL-6能顯著提高免疫鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，有效地發(fā)揮IL-6的免疫輔佐劑的作用。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)組犢牛7日齡血清IL-6含量顯著降低，根據(jù)其功能，這或許是導(dǎo)致試驗(yàn)組犢牛30日齡血清IgG含量下降的一個(gè)原因。另外，本試驗(yàn)中試驗(yàn)組犢牛血清IL-1β含量在15日齡時(shí)較對照組顯著升高，說明試驗(yàn)組犢牛機(jī)體的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)可能被激活，可能與巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶的再污染有關(guān)，同時(shí)也表明犢牛機(jī)體免疫功能得到改善。IL-2能顯著增強(qiáng)免疫干擾素和腫瘤壞死因子的生成，增加自然殺傷細(xì)胞和毒性T細(xì)胞數(shù)量[29]，這與本試驗(yàn)結(jié)果不符。綜合來看，本試驗(yàn)中犢牛血清免疫指標(biāo)的變化時(shí)間點(diǎn)較為分散且沒有規(guī)律性可尋，再者免疫系統(tǒng)本就是一個(gè)易受多種因素影響的復(fù)雜多變的系統(tǒng)。所以，本試驗(yàn)并不能說明飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛免疫系統(tǒng)是否有增強(qiáng)作用。

4 結(jié) 論

① 從犢牛生長發(fā)育看，應(yīng)用巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶飼喂?fàn)倥@著提高其哺乳期的平均日增重。

② 從血清免疫指標(biāo)來看，飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶能夠引起犢牛斷奶前的免疫反應(yīng)，但無法明確給出飼喂巴氏殺菌β-內(nèi)酰胺類有抗奶對犢牛免疫系統(tǒng)有增強(qiáng)或抑制作用的相關(guān)結(jié)論，還需要進(jìn)一步的研究。

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