夏秀芳，王 博，鄭幸子，鄧思楊，潘 男，王 浩*

20世紀(jì)初美國(guó)蛋白質(zhì)委員會(huì)首次對(duì)糖蛋白進(jìn)行描述：主要是指由蛋白質(zhì)分子和除核酸外的包含碳水化合物基團(tuán)的物質(zhì)共同組成的一類復(fù)合物[1-2]。在食品的加工和貯藏過(guò)程中，氨基化合物和羰基化合物之間極易發(fā)生非酶褐變反應(yīng)，糖蛋白產(chǎn)物中糖鏈與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)鍵相連，形成特殊的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，國(guó)內(nèi)外很多研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白能夠有效地提高蛋白質(zhì)的乳化性、凝膠性和溶解性等。肖連冬等[3]以大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）與蔗糖為研究材料，在一定濃度下，經(jīng)糖基化反應(yīng)得到的糖蛋白乳化性逐漸升高，增加了體系的黏稠度。劉穎等[4]以南極磷蝦為研究材料，實(shí)驗(yàn)得到的南極磷蝦糖蛋白具有更好的乳化穩(wěn)定性、起泡性、溶解性等功能特性。Nakamura等[5]合成的溶菌酶-葡萄糖的共價(jià)復(fù)合物具有很好的乳化特性，同時(shí)也提高了溶菌酶的抗菌范圍。Moreno等[6]利用酪蛋白和乳糖在40 ℃下合成的糖蛋白乳化性得到了顯著的提高。因此糖蛋白作為一種食品添加劑，能夠滿足人們對(duì)蛋白質(zhì)的一些特殊需求，如今已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于食品加工等領(lǐng)域。

隨著對(duì)蛋白組學(xué)研究的深入，國(guó)際上很多學(xué)者對(duì)各種糖和蛋白質(zhì)反應(yīng)得到的糖蛋白進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖蛋白的抗氧化性和抗菌性得到了不同程度的提高。陳黎洪等[7]在對(duì)金華火腿研究時(shí)，對(duì)其副產(chǎn)物酶解物與木糖反應(yīng)得到的糖蛋白的抗氧化性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)的深入，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率與還原能力逐漸增強(qiáng)。馬志玲等[8]采用不同種類氨基酸和葡萄糖進(jìn)行模式美拉德反應(yīng)得到的糖蛋白，反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，體系的褐變程度加深，糖蛋白的抗氧化性越強(qiáng)。項(xiàng)惠丹等[9]在研究酪蛋白和SPI與多種還原糖發(fā)生反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同反應(yīng)條件下的產(chǎn)物都具有較強(qiáng)的抗氧化性。Deepak等[10]對(duì)鱗莖中29 kDa糖蛋白的抗真菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)糖蛋白糖部分被高碘酸氧化后失去抗真菌活性，說(shuō)明糖蛋白糖部分在抗真菌活性中起到重要的作用。以上研究大多集中在糖蛋白抗氧化性方面，但是關(guān)于抗氧化性提高的機(jī)理方面研究很少，本研究將以SPI和葡萄糖為原料，研究不同反應(yīng)條件下糖蛋白抗氧化性的變化及機(jī)理，為深入研究大豆糖蛋白及其在食品中的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂低溫豆粕 黑龍江省大自然糧油集團(tuán)有限公司；β-巰基乙醇、DPPH、Tris 美國(guó)Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）標(biāo)準(zhǔn)分子蛋白 大連寶生物科技有限公司；三氯乙酸、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

DK-8B電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司；AL-104型精密電子天平 梅特勒-托利多（上海）儀器設(shè)備有限公司；AM-1磁力攪拌器 北京鼎昊源實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GL-21M冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Mini電泳儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；FD-2A冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；UT-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

取200 g脫脂低溫豆粕粉與15 倍體積的去離子水混合，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至8.0，攪拌2 h后，將其懸浮液在4 ℃條件下6 000 r/min離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.5。靜置后在4 ℃條件下6 000 r/min離心10 min。取蛋白沉淀分散于5 倍體積水中并用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7.0，冷凍干燥后測(cè)定蛋白含量，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 大豆糖蛋白的制備

SPI和葡萄糖按蛋白與糖的質(zhì)量比1∶1放于燒杯中用蒸餾水溶解，使蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%，保鮮膜密封，將混合液分別放入70、80 ℃和90 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)，分別在0、1、2、3、4、5、6 h取樣，將樣品冷凍干燥，測(cè)定樣品蛋白含量，備用。

1.3.3 還原能力測(cè)定

采用He Yuehua等[11]的方法，并稍作修改。取0.5 mL大豆糖蛋白，加入2.5 mL濃度為0.2 mol/L、pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀，充分混合。將混合物在50 ℃水浴下保溫20 min，再加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液，然后將混合物在3 000×g下離心10 min。取2.5 mL上層清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的三氯化鐵溶液，混合均勻，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，以吸光度表征還原能力。

1.3.4 羥自由基清除能力測(cè)定

參照金鳴等[12]的方法，取1 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液，加入2 mL pH 7.4磷酸鹽緩沖液和1 mL蒸餾水，充分混勻，再加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液和1 mL體積分?jǐn)?shù)0.01%過(guò)氧化氫溶液，37 ℃保溫60 min，于536 nm波長(zhǎng)處測(cè)得吸光度Ap；用1 mL蒸餾水代替1 mL過(guò)氧化氫溶液，測(cè)得吸光度AB，1 mL大豆糖蛋白溶液代替蒸餾水，測(cè)得吸光度As。采用式（1）計(jì)算大豆糖蛋白對(duì)羥自由基的清除率。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參照Saiga等[13]的方法，并略作修改。取大豆糖蛋白溶液0.5 mL和3.5 mL 1×10-4mol/L DPPH無(wú)水乙醇溶液加入同一帶塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用無(wú)水乙醇作參比，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。根據(jù)公式（2）計(jì)算大豆糖蛋白對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：A1為加大豆糖蛋白后DPPH溶液的吸光度；A2為大豆糖蛋白溶液的吸光度；A3為未加大豆糖蛋白時(shí)DPPH溶液的吸光度。

1.3.6 游離氨基含量的測(cè)定

參照Benjakul等[14]的方法并稍作修改。取大豆糖蛋白溶液125 μL，與2.0 mL 0.212 5 mol/L、pH 8.2的磷酸鹽緩沖液混合，再加入體積分?jǐn)?shù)0.01%的2,4,6-三硝基苯磺酸溶液1.0 mL。充分混合后，在50 ℃水浴中避光保溫30 min。再加入2.0 mL 0.1 mol/L的Na2SO3終止反應(yīng)，冷卻15 min，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，重復(fù)以上步驟得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中的游離氨基含量。

1.3.7 褐變程度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取25 mg大豆糖蛋白溶于5 mL水中，以水作空白樣，于420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，用吸光度來(lái)表示大豆糖蛋白的褐變程度。

1.3.8 紫外吸收光譜的測(cè)定

以去離子水為空白，在室溫下測(cè)定各處理組大豆糖蛋白（1 mg/mL）的紫外吸收及其二階導(dǎo)數(shù)圖譜。

1.3.9 SDS-PAGE分析

參照Xia Xiufang等[15]的方法，10%分離膠，5%濃縮膠，上樣量為12 μL；開(kāi)始電泳時(shí)電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V；取出膠片用考馬斯亮藍(lán)染色30 min，用甲醇-冰醋酸脫色液脫至透明。電泳膠片置于凝膠成像儀攝像，結(jié)合Tanon軟件進(jìn)行分析和處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為 ±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序。采用Sigma Plot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同反應(yīng)溫度和時(shí)間制得大豆糖蛋白的還原能力

還原能力是評(píng)價(jià)天然抗氧化劑抗氧化能力的重要指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)中制得的大豆糖蛋白具有很好的還原能力，這可能是由于反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生了大量褐色素、吡咯酮、脫氧果糖嗪類、還原酮等能夠提供氫電子的物質(zhì)，其提供的電子可將Fe3+還原為Fe2+，使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)，從而中斷自由基連鎖反應(yīng)[16]。從圖1中可以看出，隨反應(yīng)溫度的升高大豆糖蛋白的還原能力逐漸增強(qiáng)，3 個(gè)溫度制得大豆糖蛋白的還原能力變化趨基本一致，0～4 h其還原能力隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著提高，5 h其還原能力有所下降，反應(yīng)進(jìn)行6 h還原能力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這可能是由于反應(yīng)生成的美拉德產(chǎn)物在長(zhǎng)時(shí)間高溫下有部分分解，造成還原力有所下降，而后又重新發(fā)生聚集使還原能力增強(qiáng)。此外，不同條件制得大豆糖蛋白還原能力均高于SPI，90 ℃ 6 h的大豆糖蛋白具有最高的還原能力，比SPI還原能力提高4.6 倍，說(shuō)明糖基化改性后的SPI具有更好的抗氧化活性。美拉德產(chǎn)物具有還原作用，Kim等[17]對(duì)此也有研究，其發(fā)現(xiàn)甘氨酸、三甘氨酸、甘氨酰甘氨酸這3 種氨基酸與葡萄糖生成的大豆糖蛋白的還原力隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。此外，其對(duì)間接誘導(dǎo)脂類氧化的過(guò)氧化物具有較強(qiáng)的消除能力，Yoshimura等[18]研究表明，葡萄糖-賴氨酸反應(yīng)體系制得的大豆糖蛋白中含有焦糖化物或雜環(huán)物質(zhì)，這些化合物都能消除過(guò)氧化物，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。另外，其抗氧化能力隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增強(qiáng)，經(jīng)脫色處理后的大豆糖蛋白抗氧化能力顯著下降，這就一定程度上證明了褐色素物質(zhì)具有抗氧化作用。

圖1 不同反應(yīng)溫度和時(shí)間制得大豆糖蛋白的還原能力Fig. 1 Reducing power of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

2.2 不同反應(yīng)溫度和時(shí)間制得大豆糖蛋白的羥自由基清除能力

圖2 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白的羥自由基清除能力Fig. 2 Hydroxyl radical scavenging capacity of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

抗氧化劑可以提供氫原子與脂類的自由基反應(yīng)，使自由基結(jié)合形成比較穩(wěn)定的非活性化合物，從而干擾或阻斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的繼續(xù)進(jìn)行。蛋白質(zhì)與糖質(zhì)量比為1∶1條件下不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制取大豆糖蛋白的羥自由基清除能力見(jiàn)圖2。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，70 ℃大豆糖蛋白的羥自由基清除能力不斷增強(qiáng)，最大清除率為4.71%；同時(shí)80 ℃ 0～4 h大豆糖蛋白隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)羥自由基清除能力也呈上升趨勢(shì)，在反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)清除率達(dá)到最大為5.04%，5～6 h羥自由基清除能力呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；90 ℃大豆糖蛋白在反應(yīng)開(kāi)始隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)顯示出羥自由基清除能力的提高，在5 h時(shí)達(dá)到最高清除率5.87%，6 h大豆糖蛋白的羥自由基清除能力低于5 h的。從圖2還可以看出，高反應(yīng)溫度制得的大豆糖蛋白具有更高的羥自由基清除能力；此外，90 ℃ 5 h的大豆糖蛋白羥自由基清除能力最高，比SPI提高了0.69 倍，說(shuō)明其具有比SPI更高的羥自由基清除能力。本實(shí)驗(yàn)中制得的大豆糖蛋白具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力，且它的羥自由基清除能力隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。這是因?yàn)榇蠖固堑鞍自诎l(fā)揮抗氧化作用時(shí)，有可能是作為氫供體，其本身也是金屬螯合劑，可以螯合Fe2+，因此大豆糖蛋白擁有比較強(qiáng)的羥基自由基清除能力，也有可能與其具有螯合Fe2+的能力有關(guān)[19]。這與Vhangani等[20]的研究相一致，他們的研究結(jié)果表明賴氨酸與果糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

2.3 不同反應(yīng)溫度和時(shí)間制得大豆糖蛋白的DPPH自由基清除能力

圖3 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白的DPPH自由基清除能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

DPPH的乙醇溶液呈紫色，它是以氮為中心的穩(wěn)定自由基，在517 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。當(dāng)DPPH溶液中有自由基清除劑加入時(shí)，其孤電子被配對(duì)，導(dǎo)致其溶液在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度變小。通常清除率大小表示樣品對(duì)自由基的清除能力。如圖3所示，不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制得的大豆糖蛋白都具有一定的DPPH自由基清除能力，其DPPH自由基清除能力隨著反應(yīng)溫度的升高而增強(qiáng)。因?yàn)闇囟雀哂欣诿览路磻?yīng)，溫度越高在較短時(shí)間內(nèi)就能生成類黑精、還原酮及一系列含N、S的雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)都具有清除DPPH自由基的能力。80 ℃大豆糖蛋白和90 ℃大豆糖蛋白的DPPH自由基清除能力呈相同趨勢(shì)，0～5 h大豆糖蛋白的DPPH自由基清除率顯著增加，在反應(yīng)5 h清除率達(dá)到最高，分別為45.59%和68.55%，6 h大豆糖蛋白自由基清除能力有下降；70 ℃大豆糖蛋白DPPH自由基清除能力隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。另外，最高的大豆糖蛋白自由基清除率比SPI提高了2.68 倍。這是因?yàn)槊览路磻?yīng)達(dá)到一定程度時(shí)，美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物類黑精形成，其是美拉德中間產(chǎn)物與與氨基化合物反應(yīng)而成，而且其短肽含有抗氧化活性的支鏈氨基酸。在產(chǎn)生類黑精的同時(shí)，有一系列的美拉德反應(yīng)中間體——還原酮類物質(zhì)及雜環(huán)類化合物生成，這些產(chǎn)物也具有抗氧化等活性[8]。

2.4 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白的游離氨基含量

圖4 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白的游離氨基含量Fig. 4 Free amino group contents of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

游離氨基含量的變化關(guān)系著美拉德反應(yīng)程度，游離氨基減少越多，反應(yīng)進(jìn)行的程度就越大[21]。由圖4可以看出，反應(yīng)過(guò)程中隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)游離氨基含量顯著降低（P＜0.05），70、80、90 ℃ 大豆糖蛋白的游離氨基含量由6.79 mmol/L分別降到6.14、5.93、5.68 mmol/L，這是因?yàn)殡S著反應(yīng)的進(jìn)行葡萄糖和SPI的—NH2聚合成高分子質(zhì)量的大豆糖蛋白，從而使游離氨基含量逐漸降低。另外，隨著反應(yīng)溫度的提高游離氨基含量降低幅度增大，說(shuō)明溫度的提高有利于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的生成，在美拉德反應(yīng)過(guò)程中，游離氨基含量隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行消耗的越多，其游離氨基含量的變化一定程度上反映美拉德反應(yīng)的進(jìn)程。Naranjo等[22]研究了酪蛋白與還原糖進(jìn)行美拉德反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸含量也逐漸降低。這個(gè)結(jié)果表明，當(dāng)加熱進(jìn)行時(shí)，蛋白質(zhì)或氨基酸的α-或ε-NH2基團(tuán)更大程度地與糖共價(jià)結(jié)合形成糖基化蛋白，同時(shí)，大豆糖蛋白重新排列成一個(gè)更穩(wěn)定的酮胺或Amadori產(chǎn)物。

2.5 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白的褐變程度

表1 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白的褐變程度Table 1 Effect of different reaction temperatures and time on browning degree of soy glycoprotein

蛋白質(zhì)與糖接枝反應(yīng)往往伴隨著褐變現(xiàn)象，反應(yīng)后期形成一種大分子質(zhì)量的棕褐色聚合產(chǎn)物，這一類物質(zhì)統(tǒng)稱為類黑精。美拉德反應(yīng)的末期階段，SPI和葡萄糖片段縮合成大分子的褐色素類黑精，類黑精在420 nm波長(zhǎng)處有明顯吸收，420 nm波長(zhǎng)處吸光度越高說(shuō)明褐色素類黑精的生成量越多，反應(yīng)體系溶液顏色越深。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，形成色素物質(zhì)越來(lái)越多，反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度也隨之加深。反應(yīng)褐變程度對(duì)大豆糖蛋白的抗氧化活性也有影響[23]，本研究通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液在420 nm波長(zhǎng)處的吸光度表示褐變程度，反映類黑精的生成量。由表1可以看到，同一溫度下隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，褐變程度逐漸增大且差異性顯著（P＜0.05），5 h大豆糖蛋白在420 nm波長(zhǎng)處吸光度有所降低，到6 h褐變程度又顯示出升高趨勢(shì)，這與其還原能力的變化一致。這可能是由于美拉德反應(yīng)的初始階段，還原糖和氨基酸反應(yīng)可生成不穩(wěn)定的無(wú)色氨基還原酮，反應(yīng)后期形成褐色物質(zhì)類黑精。主要有3 種結(jié)構(gòu)的類黑精：蛋白質(zhì)與低分子質(zhì)量著色化合物交聯(lián)產(chǎn)生的以蛋白質(zhì)為基本成分的類黑精；由呋喃或吡咯重復(fù)單元組成的類黑精聚合物；醇醛縮合形成糖降解產(chǎn)物中的以碳水化合物為基礎(chǔ)的類黑精。在類黑精混合體中，類黑精是一種以短肽和色素相結(jié)合的混合體，其短肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)具有抗氧化肽的特征。所以類黑精類物質(zhì)具有相同顯著的抗氧化和消除活性氧等性能，其抗氧化強(qiáng)度可與食品中常用的抗氧化劑相當(dāng)[24]。Murakami等[25]指出早期階段產(chǎn)生的無(wú)色產(chǎn)物的自由基清除活性比有色產(chǎn)物的自由基清除活性小，隨著反應(yīng)加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反應(yīng)產(chǎn)物裂解退化為前期產(chǎn)物。這也是隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)大豆糖蛋白的還原能力變化的原因。另外，隨著反應(yīng)溫度的升高，褐變程度不斷增大且具有顯著性差異（P＜0.05），可能是因?yàn)闇囟仍礁咴接欣诿览路磻?yīng)高級(jí)階段的進(jìn)行。

2.6 不同溫度和反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白紫外光譜二階導(dǎo)數(shù)分析結(jié)果

圖5 不同溫度、反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白的紫外光譜二階導(dǎo)數(shù)分析Fig. 5 Secondary derivative UV spectral analysis of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

蛋白質(zhì)中苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸這些芳香族氨基酸能產(chǎn)生紫外吸收光譜，這3 種氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)在280 nm波長(zhǎng)處都有特征吸收峰，由于譜峰的信號(hào)疊加很難分辨出峰的具體特征。因此對(duì)紫外吸收光譜進(jìn)行求導(dǎo)得到其二階導(dǎo)數(shù)光譜，用于分析近紫外區(qū)域復(fù)雜的蛋白譜圖遷移信息和描述3 種芳香族氨基酸的結(jié)構(gòu)變化[26]。SPI在250～300 nm范圍內(nèi)存在兩個(gè)正吸收峰（269 nm和296 nm）和兩個(gè)負(fù)吸收峰（259 nm和279 nm）。296 nm波長(zhǎng)處的正峰被認(rèn)為是色氨酸的貢獻(xiàn)[16]。如圖5所示，相對(duì)于SPI，大豆糖蛋白的色氨酸吸收峰發(fā)生不同程度的紅移，即原來(lái)蛋白分子表面的芳香族氨基酸減少。70 ℃大豆糖蛋白色氨酸吸收峰紅移不明顯，80 ℃和90 ℃大豆糖蛋白的色氨酸吸收峰紅移程度變大，且90 ℃條件下制得的大豆糖蛋白色氨酸吸收峰紅移程度大于80 ℃反應(yīng)體系，這可能是隨著糖基化的進(jìn)行，暴露的色氨酸吲哚結(jié)構(gòu)中的—NH基團(tuán)發(fā)生美拉德反應(yīng)而導(dǎo)致其含量降低，有研究報(bào)道美拉德反應(yīng)的蛋白側(cè)鏈芳香族氨基酸殘基是較強(qiáng)的自由基清除劑，因?yàn)樗鼈兛商峁湓咏o自由基，達(dá)到猝滅自由基的效果，同時(shí)通過(guò)共振結(jié)構(gòu)保持自身穩(wěn)定[27]，大豆蛋白與葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生的大豆糖蛋白結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致自由基清除能力有差異。

2.7 不同反應(yīng)溫度和時(shí)間制得大豆糖蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

圖6 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間制得大豆糖蛋白的SDS-PAGEFig. 6 SDS-PAGE analysis of soy glycoprotein obtained at different reaction temperatures and times

本實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)亞基分子質(zhì)量的組成。經(jīng)過(guò)SDS處理后的蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)都被破壞；同時(shí)，蛋白質(zhì)分子二硫鍵被疏基乙醇破壞導(dǎo)致鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵被還原。蛋白質(zhì)因?yàn)檫@兩種因素而發(fā)生變性，變性蛋白多肽鏈與SDS以質(zhì)量比1∶4結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)混合物，使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)超過(guò)其本身所帶有的電荷，這種情況下，SDS-蛋白質(zhì)的電泳遷移率取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小，而不取決于蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)。大分子物質(zhì)在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中移動(dòng)時(shí)受到較大的阻力，因此滯留在凝膠的上方，較小的分子則具有較大的遷移率，分布在凝膠的下方。通過(guò)電泳分析糖基化改性對(duì)蛋白的降解或聚合作用。圖6很清晰地顯示出未經(jīng)處理的SPI的各亞基條帶，其中α’、α和β為大豆β-伴球蛋白的3 個(gè)亞基，A和B分別是大豆球蛋白的酸性多肽鏈和堿性多肽鏈。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)大豆糖蛋白的α’和α亞基條帶逐漸變淺，最終幾乎消失，這說(shuō)明了糖基化溫度為90 ℃時(shí)糖基化反應(yīng)速度快，生成的糖基化SPI多。這與Diftis等[28]的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)SPI與羧甲基纖維素的接枝物中，7S亞基完全消失不見(jiàn)。同時(shí)，還可以看出，80 ℃和90 ℃反應(yīng)生成的大豆糖蛋白在凝膠頂部存在的一些顏色較暗的條帶，很可能就是SPI中的亞基與葡萄糖發(fā)生了聚合作用，形成了大分子聚合物，這種聚合物可能是類黑素，它們的分子質(zhì)量過(guò)大，不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)絡(luò)，因此堆積在膠的頂部，而70 ℃反應(yīng)生成的大豆糖蛋白在濃縮膠與分離膠接縫處基本沒(méi)有條帶，推測(cè)70 ℃條件下制得的大豆糖蛋白起抗氧化作用的主要物質(zhì)可能為還原酮或揮發(fā)性雜環(huán)化合物。從大豆糖蛋白的電泳圖中也不難看出，大豆糖蛋白均隨著溫度的升高，亞基譜帶減少，特別是90 ℃、6 h制得的大豆糖蛋白的電泳圖譜上基本看不到亞基的條帶，這是因?yàn)榭捡R斯亮藍(lán)通常情況下在酸性環(huán)境中通過(guò)靜電等非共價(jià)作用與蛋白質(zhì)分子上的自由氨基等活性基團(tuán)結(jié)合，從而呈現(xiàn)顏色反應(yīng)，隨著反應(yīng)溫度的升高和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，SPI和葡萄糖進(jìn)行更加充分的糖基化作用，使得蛋白質(zhì)中自由氨基含量減少，同時(shí)考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)分子的結(jié)合也就相應(yīng)地減少，使大豆糖蛋白的電泳凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)顏色變淡或消失。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在濃縮膠和分離膠的接縫處新條帶的生成，并且該化合物分子質(zhì)量大于200 kDa，這說(shuō)明SPI經(jīng)過(guò)美拉德反應(yīng)后生成了大分子化合物。

3 結(jié) 論

大豆糖蛋白的抗氧化性隨著反應(yīng)溫度的升高逐漸增強(qiáng)，同時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆糖蛋白的抗氧化性也會(huì)相應(yīng)提高，當(dāng)達(dá)到一定反應(yīng)時(shí)間時(shí)，大豆糖蛋白中的抗氧化成分發(fā)生裂解導(dǎo)致抗氧化能力降低。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，大豆糖蛋白的游離氨基含量都明顯下降，反應(yīng)溫度越高、反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，其游離氨基含量下降越多。同時(shí)，大豆糖蛋白溶液顏色均有不同程度的加深且差異顯著（P＜0.05），且溫度越高大豆糖蛋白的褐變程度越大，即其中類黑精含量越高。另外，通過(guò)其紫外光譜二階導(dǎo)數(shù)分析可知，經(jīng)過(guò)反應(yīng)后蛋白中色氨酸發(fā)生偏移，芳香族氨基酸暴露出來(lái)，導(dǎo)致大豆糖蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，而從SDS-PAGE的分析中也看出蛋白與糖發(fā)生聚合。物質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，大豆糖蛋白的抗氧化性和其結(jié)構(gòu)存在著密切聯(lián)系，由于美拉德反應(yīng)的復(fù)雜性，需要考慮多重因素，對(duì)大豆糖蛋白的抗氧化機(jī)理有待于更深入的研究。

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