康雪帆，李海明，陳丹潔，張 輝*，馮鳳琴

玉米醇溶蛋白（zein）是玉米加工副產(chǎn)物玉米黃粉中的主要蛋白質(zhì)成分，約占其質(zhì)量的65%[1]，每年有大量的玉米黃粉被生產(chǎn)和浪費(fèi)[2]。zein的疏水性氨基酸含量達(dá)50%以上，是一種典型的水不溶性植物蛋白。zein因?yàn)榫哂歇?dú)特的自組裝和生物兼容特性，經(jīng)常被用作疏水性藥物或營(yíng)養(yǎng)素的載運(yùn)體系，具有良好的包埋效果和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，已報(bào)道的載運(yùn)活性成分有百里香酚[3]、姜黃素[4-5]、白藜蘆醇[6]、番茄紅素[7]等。常用的zein造粒方法為反相沉淀法制備納米微粒[8-9]或者使用噴霧干燥制備微米級(jí)微粒[10-11]。而單純zein微粒粒徑雖然較小，但通常不穩(wěn)定，需要酪蛋白酸鈉、果膠、卵磷脂[12]或其美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[6]等來(lái)穩(wěn)定。有研究表明，通過(guò)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化對(duì)zein進(jìn)行糖基化改性[13]或直接采用濕法美拉德改性[14]可提高其溶解性。近年來(lái)，有關(guān)zein的改性、造粒與應(yīng)用已有較多文獻(xiàn)報(bào)道，包括蛋白納米微粒成型、干法制備玉米肽糖基化納米微粒、利用zein與多糖及蛋白質(zhì)的相互作用制成多種復(fù)合微粒（如zein/酪朊酸鈉、zein/硬脂酸、zein/甜菜果膠、zein/甲殼素復(fù)合微粒等），并對(duì)這些微粒在活性物質(zhì)輸送和乳液穩(wěn)定等領(lǐng)域做了一系列的研究[15-19]，拓寬了zein的實(shí)際應(yīng)用范圍。蝦青素富含多不飽和長(zhǎng)鏈?zhǔn)蛊渚哂泻軓?qiáng)的抗氧化性和生理活性功能，如抗腫瘤、提高免疫力、增強(qiáng)心血管功能等[20-21]。但是，由于含有較多共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，蝦青素極易被光、熱、氧氣等環(huán)境因素所破壞，而且，作為一種油溶性功能成分，蝦青素也無(wú)法均勻分散于水溶液中，很大程度上限制了其在食品中的應(yīng)用。有研究表明，利用噴霧干燥法造粒，以β-環(huán)糊精和麥芽糊精體系作為壁材，制備蝦青素包埋產(chǎn)物[22]，可有效改進(jìn)其利用效率。本研究利用葡萄糖和木糖兩種還原糖對(duì)zein進(jìn)行接枝改性，通過(guò)噴霧造粒法制備改性zein/蝦青素復(fù)合顆粒，用于包埋蝦青素，以期開(kāi)發(fā)改性zein新產(chǎn)品，擴(kuò)展其食品應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（分析純，純度≥98%） 上海阿拉丁公司；zein粉末 上海耐今實(shí)業(yè)公司；無(wú)水乙醇、D（+）-葡萄糖、D（+）-木糖，十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），考馬斯亮藍(lán)、二氯甲烷、過(guò)氧化物酶、牛血清白蛋白（均為分析純） 國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；蝦青素粉末（純度≥10%） 陜西澳源生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SU-8010冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）儀瑞士梅特勒-托利多公司；LC-2010A高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 日本島津公司；MOS-450多功能圓二色譜儀 法國(guó)比奧羅杰公司；SY-6000小型噴霧干燥儀 上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程公司；Infinite?200 PRO酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司。

1.3 方法

1.3.1 zein糖接枝樣品的制備

取6 g葡萄糖或木糖，加熱溶解于15 mL體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液中，并加入3 g zein粉，調(diào)pH值至9.00。將溶液置于安瓿瓶中，熔融封口后于油浴鍋中115 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)完畢后，利用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液將所得溶液稀釋至zein的質(zhì)量濃度為4 g/100 mL，與水體積比1∶4混合得到粒徑100 nm左右的zein納米微粒懸浮液。

1.3.2 接枝產(chǎn)物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和接糖量的測(cè)定

采用GB 50095—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中凱氏定氮法測(cè)定接枝產(chǎn)物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。反應(yīng)產(chǎn)物與空白組的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)差值即為蛋白中的接糖量。

1.3.3 利用SDS-PAGE表征糖蛋白

對(duì)接枝產(chǎn)物進(jìn)行SDS-聚丙烯凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）后染色，以表征新增的糖蛋白。電泳步驟如下：以體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液制備1 mg/mL蛋白溶液，取樣15 μL，15%分離膠，5%濃縮膠，80 V恒壓3 h。糖染色采用改進(jìn)的席夫試劑糖染色法，蛋白質(zhì)染色采用考馬斯亮藍(lán)染色法，以牛血清白蛋白作為非糖蛋白的標(biāo)記，以辣根過(guò)氧化物酶作為糖蛋白的標(biāo)記[23]。

席夫試劑的配制[24]如下：將1 g堿性品紅溶于200 mL 100 ℃蒸餾水中，攪拌5 min；冷卻至50 ℃過(guò)濾，加入20 mL 1 mol/L鹽酸過(guò)濾；冷卻至25 ℃，加入2 g亞硫酸鈉，避光放置24 h，加入2 g活性炭攪拌1 min過(guò)濾，避光保存。

1.3.4 圓二色譜表征結(jié)構(gòu)的變化

將糖接枝產(chǎn)物溶于體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中，調(diào)節(jié)其蛋白質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，進(jìn)行圓二色譜掃描。掃描波長(zhǎng)190～250 nm，樣品池光程為 10 mm，掃描速率100 nm/min，掃描步長(zhǎng)1.0 nm。每個(gè)樣品掃描3 次，累加取平均光譜作為樣品的最終光譜[25]，對(duì)光譜解析后計(jì)算蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.5 噴霧造粒微粒的制備

取25 g蝦青素粉末，加入300 mL二氯甲烷，攪拌并超聲30 min后加入233.3 mL無(wú)水乙醇，再次攪拌并超聲10 min，以2 000 r/min離心5 min，取上清液即為V（二氯甲烷）：V（無(wú)水乙醇）＝9∶7的蝦青素溶液。調(diào)節(jié)蝦青素質(zhì)量濃度為0.4 g/mL。向該溶液中加入相應(yīng)質(zhì)量的zein粉或經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)糖接枝改性后的zein粉，40 ℃超聲振蕩30 min使蛋白質(zhì)充分溶解，將蛋白質(zhì)量濃度控制在2 g/mL，2 000 r/min離心5 min去除不溶性雜質(zhì)，即可得到zein/蝦青素混合溶液。將上述所得溶液噴霧造粒，造粒條件為：進(jìn)風(fēng)口溫度115 ℃，進(jìn)料速率15 mL/min，噴霧氣流1 000 L/h，通針頻率4 次/分。所得微粒4 ℃條件下密閉避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 微粒的形貌特征觀察

利用冷場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察分析造粒產(chǎn)物的形貌特征。電子顯微鏡觀察方法如下：將少量待檢測(cè)微粒涂抹于導(dǎo)電膠上，使用離子噴鍍儀噴金，噴金電流15 mA，噴鍍時(shí)間90 s，于3 kV電壓下觀察樣品。

1.3.7 DSC法分析微粒的熱特性

稱取不同處理的復(fù)合微粒各5.00 mg，在40 μL鋁坩堝中壓制均勻，采用氮?dú)鈿夥?，升溫速?0 ℃/min，吹掃氮?dú)?50 mL/min，掃描溫度0～250 ℃。數(shù)據(jù)使用STARe Evaluation軟件處理分析。空白對(duì)照組采用zein和蝦青素以9∶1（m/m）混合均勻后取樣。

1.3.8 蝦青素含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取5.00 mg蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，加入0.5 mL二氯甲烷溶解，然后用二氯甲烷-無(wú)水乙醇（1∶9，V/V）溶液定容到250 mL，此為蝦青素母液。將蝦青素母液適當(dāng)稀釋后，用酶標(biāo)儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描以確定其最大吸收波長(zhǎng)。

取蝦青素母液，以相同溶劑體系制得質(zhì)量濃度為0、1、2、4、6、8、10、12、14 μg/mL的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用HPLC法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中蝦青素含量，建立蝦青素含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPLC條件如下：ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)475 nm；流動(dòng)相為95%體積分?jǐn)?shù)甲醇溶液；流速1 mL/min；自動(dòng)進(jìn)樣量20 μL。

1.3.9 復(fù)合微粒對(duì)蝦青的包埋效果

復(fù)合微粒表面蝦青素質(zhì)量濃度的測(cè)定：取樣品20 mg，加入無(wú)水乙醇250 mL，磁力攪拌5 min，取上清液，12 000 r/min離心1 min，將離心所得溶液過(guò)0.22 μm有機(jī)系濾器后，利用HPLC在最大吸收波長(zhǎng)475 nm處測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝245 768x+3 943.5，R2＝0.999 9，其中y表示HPLC檢測(cè)所得峰面積，x為蝦青素質(zhì)量濃度/（mg/L）），計(jì)算不同溶液中蝦青素的質(zhì)量濃度。

復(fù)合微粒中蝦青素總質(zhì)量濃度的測(cè)定：取樣品10 mg，加入混合溶劑（V（二氯甲烷）∶V（無(wú)水乙醇）＝9∶7）20 mL，超聲3 min使微粒溶解均勻，取1 mL該混合溶液用無(wú)水乙醇適當(dāng)稀釋后測(cè)定蝦青素總質(zhì)量濃度。

復(fù)合微粒表面蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、復(fù)合微粒蝦青素載運(yùn)率、復(fù)合微粒蝦青素包埋率計(jì)算如式（1）～（3）所示。

1.3.10 復(fù)合微粒的緩釋效果分析

取復(fù)合微粒25 mg，加入無(wú)水乙醇250 mL，常溫磁力攪拌，分別于5 min和12 h時(shí)取上清液1 mL，12 000 r/min離心1 min，經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾器過(guò)濾后測(cè)定蝦青素質(zhì)量濃度。比較5 min、12 h后溶液中自由蝦青素質(zhì)量濃度，按式（4）計(jì)算蝦青素釋放率。

1.3.11 復(fù)合微粒中蝦青素?zé)岱€(wěn)定性

取10 mg蝦青素粉末或者50 mg蝦青素包埋粉末，加入25 mL去離子水，振蕩均勻后95 ℃水浴8 h。冷卻至室溫后使用二氯甲烷和混合溶劑（V（二氯甲烷）∶V（無(wú)水乙醇）＝9∶7）提取各實(shí)驗(yàn)組中的蝦青素，然后將該提取液用無(wú)水乙醇稀釋25 倍后測(cè)定蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（式（5））并計(jì)算蝦青素的破壞率（式（6））。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0的Duncan模型進(jìn)行方差分析與多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 zein的糖接枝

表1 糖接枝反應(yīng)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)和接糖量Table 1 Protein contents and sugar contents of zein and its grafts%

通過(guò)凱氏定氮法分別測(cè)定了原料zein、空白處理zein、zein-葡萄糖、zein-木糖的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，通過(guò)反應(yīng)前后蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化值即可計(jì)算出接枝產(chǎn)物的接糖量。從表1可知，原料中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.25%，經(jīng)過(guò)空白處理后，原料蛋白進(jìn)一步提純，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)從90.25%提高到99.86%。接枝反應(yīng)后，zein-葡萄糖、zein-木糖的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為97.27%、97.33%。經(jīng)計(jì)算可知美拉德接枝產(chǎn)物中葡萄糖、木糖與zein的反應(yīng)程度相同，反應(yīng)產(chǎn)物新增加還原糖量約為2.6%。

圖1 席夫試劑染色（A）和考馬斯亮藍(lán)染色（B）的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE of zein with Schiff staining (A) and Coomassie blue staining (B)

為了驗(yàn)證糖蛋白的產(chǎn)生，本研究采用SDS-PAGE技術(shù)分離不同亞基分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，并采用高碘酸-席夫試劑和考馬斯亮藍(lán)法先后對(duì)同一電泳凝膠進(jìn)行染色（圖1A、B），檢測(cè)得到糖蛋白的具體信息。其中泳道2、4分別是質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg/mL 的辣根過(guò)氧化物酶，一種典型的糖蛋白用于糖蛋白染色的陽(yáng)性標(biāo)記物；泳道3是牛血清白蛋白，因不含糖蛋白而用做陰性標(biāo)記物。泳道5和泳道6分別是原料zein和熱處理后的原料zein，其條帶經(jīng)糖染色后顯色微弱，說(shuō)明原料zein中本身糖基含量較少，且加熱并不會(huì)增加其含糖量。泳道7、8分別為zein和葡萄糖、木糖的反應(yīng)產(chǎn)物，相較于泳道5和6，其在21 kDa條帶處糖染色較深，說(shuō)明有糖蛋白產(chǎn)物生成。而且zein-木糖顏色深于zein-葡萄糖，說(shuō)明糖基化反應(yīng)程度zein-木糖大于zein-葡萄糖。造成這種結(jié)果的可能原因是：木糖為五碳糖，發(fā)生美拉德反應(yīng)的速率會(huì)大于作為六碳糖的葡萄糖以及雙糖的麥芽糖。

2.2 糖接枝后zein的結(jié)構(gòu)變化

表2 糖接枝產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Table 2 Secondary structures of zein and its grafts%

圓二色譜紫外區(qū)段（190～240 nm），主要生色團(tuán)是肽鏈，這一波長(zhǎng)范圍主要包含了生物大分子主鏈構(gòu)象的信息。本實(shí)驗(yàn)對(duì)zein及其糖接枝產(chǎn)物進(jìn)行圓二色譜檢測(cè)，并應(yīng)用DichroWeb在線網(wǎng)站分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，使用SELCON3分析方法獲取數(shù)據(jù)。從表2中可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)糖接枝處理后蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量顯著減少，而β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加。這可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)糖接枝改性后，蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，從而使蛋白質(zhì)更加展開(kāi)。α-螺旋是一種緊密且沒(méi)有空腔的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)中存在較多的氫鍵，導(dǎo)致規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的剛性。而β-折疊結(jié)構(gòu)是二級(jí)結(jié)構(gòu)中的較為無(wú)序的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的有序性與蛋白質(zhì)的某些功能性質(zhì)存在協(xié)同性，β-折疊含量的增加會(huì)提高蛋白質(zhì)的柔韌性和擴(kuò)展性，從而發(fā)揮蛋白質(zhì)的某些功能性質(zhì)[26]。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在糖基化反應(yīng)之后的這種變化表明，zein整個(gè)分子構(gòu)象從有序向無(wú)序的轉(zhuǎn)化，這也預(yù)示其相應(yīng)功能的變化。

2.3 復(fù)合微粒的包埋

圖2 蝦青素微粒（A）、zein/蝦青素復(fù)合微粒（B）和經(jīng)過(guò)液氮處理后的zein/蝦青素復(fù)合微粒（C）的場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 FESEM pictures of pure astaxanthin particles (A), zein/astaxanthin composite particles (B) and particles treated with liquid nitrogen (C)

圖2 為場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察的蝦青素微粒以及改性zein包埋蝦青素復(fù)合微粒的形貌圖。從圖中可以看出，蝦青素本身微粒粒徑較?。▓D2A），經(jīng)zein包埋后形成的復(fù)合微粒粒徑顯著增大（圖2B），證明在該實(shí)驗(yàn)條件下能實(shí)現(xiàn)較好的包埋效果，包埋的完整率也較高。圖2C表明，經(jīng)過(guò)液氮處理后的微粒凍破后呈現(xiàn)空心狀態(tài)。這是因?yàn)殡S著溶液中zein的添加，單位時(shí)間里噴出的蛋白與液滴中的有機(jī)溶劑結(jié)合，后者在瞬間揮發(fā)時(shí)恰好形成實(shí)心或者壁層更厚的中空球，這種結(jié)構(gòu)的形成與zein本身的性質(zhì)有關(guān)。這種表面圓滑的中空結(jié)構(gòu)能夠更好地包埋蝦青素，從而達(dá)到保護(hù)蝦青素的效果。

為了進(jìn)一步分析得到有關(guān)zein與蝦青素復(fù)合微粒結(jié)構(gòu)的重要信息，對(duì)不同處理的微粒進(jìn)行DSC分析。zein為生物大分子，具有復(fù)雜的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)和四級(jí)亞基結(jié)構(gòu)，在一定的條件下，總是在折疊（自然態(tài)）和展開(kāi)（變性態(tài)）構(gòu)象之間保持平衡，而熱處理會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象變化，使非共價(jià)鍵重新分配導(dǎo)致熱吸收[27]。DSC可測(cè)量因熱變性造成的去折疊熱焓（?H），熱躍遷中點(diǎn)（Tm，即蛋白質(zhì)完全變性點(diǎn)）等指標(biāo)[28]。當(dāng)zein與蝦青素發(fā)生了分子層面的結(jié)合時(shí)，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和鍵位都會(huì)發(fā)生一定的變化，從而導(dǎo)致熱量吸收的變化。

表3 原料及其復(fù)合微粒的DSC熱吸收峰Table 3 Thermal absorption peaks of raw materials and composite particles

DSC結(jié)果表明（表3），蝦青素在220 ℃處有特征熱吸收峰，zein在90 ℃處有特征吸收峰，zein和蝦青素的簡(jiǎn)單混合物在90 ℃和220 ℃處同時(shí)出現(xiàn)吸收峰，而zein/蝦青素和改性zein/蝦青素微粒在220 nm波長(zhǎng)處均無(wú)明顯吸收峰，說(shuō)明復(fù)合微粒中zein和蝦青素形成了致密交聯(lián)的狀態(tài)，蝦青素均勻分布在球體中，而并非典型的殼核結(jié)構(gòu)。糖接枝改性后的zein/蝦青素復(fù)合微粒的特征吸熱峰從90 ℃偏移至84 ℃左右，這可能是因?yàn)橄啾仍系鞍祝又Ξa(chǎn)物引入了新的糖鏈導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)更加展開(kāi)與無(wú)規(guī)則，進(jìn)而與蝦青素氫鍵的相互作用更強(qiáng)烈[29-30]。

表4 復(fù)合微粒對(duì)蝦青素的包埋效果Table 4 Encapsulation efficiency of astaxanthin in composite particles%

表4比較了相同造粒條件下，zein、zein-葡萄糖、zein-木糖復(fù)合微粒對(duì)蝦青素的包埋效果。從表4可知，糖接枝（zein-葡萄糖、zein-木糖）改性后的產(chǎn)物相比zein對(duì)蝦青素的包埋率分別提高了12.55%、15.09%，說(shuō)明蛋白質(zhì)的糖接枝反應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變對(duì)包埋效果產(chǎn)生了有利的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)糖接枝改性的大豆分離蛋白對(duì)番茄紅素的包埋同樣具有提高的效果[31]。

2.4 復(fù)合微粒的緩釋效果

表5 復(fù)合微粒的蝦青素釋放率Table 5 Release rates of astaxanthin from composite particles%

表5所示為復(fù)合微粒和蝦青素粉末在無(wú)水乙醇中蝦青素的釋放情況?？梢钥吹皆跀嚢璩跗冢? min），沒(méi)有經(jīng)過(guò)包埋的蝦青素粉末已經(jīng)幾乎完全溶解在無(wú)水乙醇中，結(jié)合表4可知，復(fù)合微粒僅表面附著的蝦青素溶解在無(wú)水乙醇溶液中。攪拌12 h后，未包埋的蝦青素粉末溶解度沒(méi)有顯著變化，而復(fù)合微粒的無(wú)水乙醇溶液中蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定程度的上升，但糖接枝改性zein/蝦青素復(fù)合微粒的蝦青素釋放率顯著低于未經(jīng)過(guò)糖接枝改性的zein/蝦青素復(fù)合微粒的蝦青素釋放率。這說(shuō)明復(fù)合微粒對(duì)蝦青素有很好的包埋緩釋作用，且糖接枝改性有助于提升zein對(duì)蝦青素包埋的蝦青素緩釋效果更佳。

2.5 復(fù)合微粒中蝦青素的熱穩(wěn)定性

表6 熱處理對(duì)復(fù)合微粒中蝦青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Table 6 Effect of heating treatment on astaxanthin contents in particles

將蝦青素粉末和復(fù)合微粒進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間劇烈熱處理，檢測(cè)蝦青素的破壞率。由表6可見(jiàn)，沒(méi)有經(jīng)過(guò)包埋造粒的蝦青素經(jīng)過(guò)熱處理后破壞率高達(dá)75.29%，而包埋造粒后蝦青素的破壞率下降至25%左右，這些損失大部分來(lái)源于包埋微粒上表面附著的蝦青素。在95 ℃的水溶液中，被包埋的蝦青素受到了良好的保護(hù)，基本保留了下來(lái)，說(shuō)明復(fù)合造粒對(duì)蝦青素有良好的熱穩(wěn)定性保護(hù)作用。且經(jīng)過(guò)糖接枝改性的復(fù)合微粒相比原料zein包裹的復(fù)合微粒，對(duì)蝦青素的保護(hù)效果更好[32]。在水溶液中，加熱會(huì)引起zein分子展開(kāi)而產(chǎn)生聚集變性。而經(jīng)過(guò)糖基化改性后，zein與糖之間的共價(jià)作用抑制了同樣條件下zein結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，因此可以很好地改善zein的熱穩(wěn)定性，從而使得其復(fù)合微粒的包埋熱穩(wěn)定性提升。

3 結(jié) 論

本研究以糖接枝改性的zein為研究對(duì)象，制備得到了單糖接枝改性zein，并以此建立改性zein/蝦青素復(fù)合微粒載運(yùn)體系，考察復(fù)合微粒包埋載運(yùn)蝦青素效果的影響。主要研究結(jié)論如下：

將zein與兩種單糖（木糖、葡萄糖）進(jìn)行糖接枝反應(yīng)，zein-葡萄糖/木糖的接糖量分別為2.59%和2.53%。SDS-PAGE后經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色和席夫試劑染色，充分證明了糖接枝反應(yīng)的發(fā)生并生成了糖蛋白。圓二色譜結(jié)果表明，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了一些變化，其中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減小，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量增加，表明糖接枝后蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定程度的展開(kāi)。

通過(guò)低溫噴霧造粒法，制備了改性zein/蝦青素的復(fù)合微粒。場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察表明復(fù)合微粒可能為空心塌陷的微粒，DSC研究表明zein/蝦青素形成了均一的復(fù)合體系，而不是簡(jiǎn)單的混合狀態(tài)，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)非典型的殼核結(jié)構(gòu)，而是蝦青素和zein相互作用，蝦青素均勻分布于微粒中。HPLC法檢測(cè)蝦青素包埋效率，發(fā)現(xiàn)相比未改性的zein，糖接枝的zein對(duì)蝦青素的載運(yùn)量沒(méi)有明顯變化，而對(duì)蝦青素的包埋率卻提高了10%。復(fù)合微粒對(duì)蝦青素具有很強(qiáng)的緩釋作用，在無(wú)水乙醇體系下溶解12 h，未包埋的蝦青素釋放率達(dá)99.8%，而zein/蝦青素、zein-葡萄糖/蝦青素、zein-木糖/蝦青素復(fù)合微粒中蝦青素釋放率分別為49.7%、31.7%和30.2%，經(jīng)過(guò)糖接枝改性后的復(fù)合微粒對(duì)蝦青素的包埋率提高，緩釋效果更為顯著，且明顯提高了蝦青素的熱穩(wěn)定性。

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