董偉峰

（山東萊州市文昌路畜牧獸醫(yī)站，山東 萊州 261400)

禽流感 (Avian influenza，AI)H9N2是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒 (Avian influenza，AIV)所引起的禽類疾病[1]。該病主要通過呼吸道傳播，H9亞型禽流感病毒感染雞群后，會造成商品肉雞大面積的呼吸系統(tǒng)疾病，同時也會嚴(yán)重影響產(chǎn)蛋雞的生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞群的產(chǎn)蛋量大幅下降，且病程較長，發(fā)生感染時，死亡率增加，藥物治療效果不佳，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前我國用于禽流感H9N2防控的疫苗多為滅活疫苗，所采用的佐劑多數(shù)為注射用礦物白油佐劑，但不同廠家生產(chǎn)的注射用白油佐劑粘度和純度等質(zhì)量不一，因而其應(yīng)激、免疫吸收和抗體消長效果差異較大[3,4]。本試驗選擇3個不同廠家注射用礦物白油佐劑樣品，嚴(yán)格按照油乳劑滅活疫苗制造與檢驗規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行H9N2滅活疫苗的制備與檢驗[5]。將檢驗合格的不同廠家注射用礦物白油佐劑滅活疫苗進(jìn)行SPF雞免疫效果試驗，對免疫雞進(jìn)行采血分離血清檢測抗體效價，同時剖檢觀察注射部位藥物吸收、殘留情況，通過比較不同廠家注射用礦物白油佐劑的免疫效果差異，為獸醫(yī)生物制品行業(yè)選用合適的礦物白油提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 礦物白油佐劑 不同場家注射用白油型號分別為 WG40、WG50、DDE170，由國內(nèi)兩家不同代理商提供。

1.2 病毒滅活液與標(biāo)準(zhǔn)血清 各項檢驗合格的雞H9N2病毒滅活液由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所無特定病原雞研究室提供。標(biāo)準(zhǔn)H9N2陽性抗原、標(biāo)準(zhǔn)H9N2陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.3 培養(yǎng)基和藥品 需氧菌培養(yǎng)基、厭氧菌培養(yǎng)基、霉菌培養(yǎng)基等常用培養(yǎng)基由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所制備和保存；吐溫-80、司本-80由廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司提供。

1.4 試驗材料及設(shè)備 28日齡SPF雞，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所無特定病原雞研究室提供；FA25型剪切機(jī)，上海弗魯克公司生產(chǎn)；禽用負(fù)壓隔離器，蘇州安泰公司生產(chǎn)。

1.5 不同廠家注射用礦物白油質(zhì)量檢測 相對密度、運動粘度、稠環(huán)芳烴、重金屬含量按照《中華人民共和國獸藥典》（2010版）的相關(guān)規(guī)定方法進(jìn)行檢驗[6]。

1.6 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗制備與檢驗 按照油乳劑滅活疫苗的相關(guān)規(guī)定方法進(jìn)行制備與檢驗[6]，每個白油樣品制備油乳劑滅活疫苗各250ml。

1.7 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫效果試驗 每個白油樣品H9N2油乳劑滅活疫苗分別以0.3ml/只劑量，胸部肌肉注射接種28日齡SPF 雞 30 只， 于接種后 14、21、28、35、42d 分別無菌采血10只雞進(jìn)行血清抗體（HI）效價檢測。同時每組撲殺5只雞進(jìn)行疫苗的藥物殘留吸收檢查。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射礦物白油質(zhì)量檢測結(jié)果 不同廠家注射用礦物白油質(zhì)量檢測項目與數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

表1 不同廠家注射用礦物白油質(zhì)量檢驗結(jié)果

由表1可知，對照《中華人民共和國獸藥典》的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：運動粘度＜7.0的是礦物白油WG40；三種白油稠環(huán)芳烴含量吸光度均小于0.10；重金屬含量3種白油均ppm＜10。

2.2 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗的檢驗結(jié)果 3種注射用礦物白油佐劑配制的H9N2滅活疫苗檢驗結(jié)果：物理性狀檢驗合格；疫苗粘度分別是 WG40 為 1.7s、WG50 為 2.3s、DDE170 為 2.5s；無菌檢驗、安全檢驗均合格。

2.3 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫藥物吸收、殘留剖檢結(jié)果 見表2。

表2 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗胸部肌肉注射藥物吸收、殘留剖檢結(jié)果

由表2可知，經(jīng)過5次注射部位剖檢檢查藥物殘留情況綜合統(tǒng)計，結(jié)果顯示其白油佐劑吸收較好的順序是：WG40＞W(wǎng)G50＞DDE170。

2.4 注射用礦物白油佐劑H9N2滅活疫苗免疫HI抗體檢測結(jié)果 見圖1。

圖1 不同礦物白油H9N2滅活疫苗免疫抗體消長曲線

將5次血清抗體檢測數(shù)據(jù)繪成由圖1可知：不同礦物白油樣品H9N2滅活疫苗抗體監(jiān)測平均值比較發(fā)現(xiàn)，WG40 在接種后 14、21、28、35、42d 的抗體均比WG50和DDE170高，且抗體上升快。而WG50和DDE170組在整個免疫期抗體差異不大，從抗體水平看，WG40白油適合用于H9N2油乳劑疫苗的佐劑。

3 討論

免疫佐劑是指與抗原同時或先于抗原使用，能增強(qiáng)機(jī)體針對抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)[7]。選擇佐劑時不僅要考慮其免疫促進(jìn)作用，也要兼顧佐劑的安全性及佐劑與抗原適當(dāng)比例配制后疫苗的粘度、穩(wěn)定性等是否符合要求。目前，滅活疫苗尤其是禽用滅活疫苗，通常使用的佐劑是礦物油佐劑，抗體滴度維持時間較長。但是，不同油佐劑對疫苗免疫效果的增強(qiáng)作用可能存在差異[8]。

本試驗選擇了3種進(jìn)口油佐劑，與禽流感(H9N2亞型)病毒液配制成滅活疫苗，免疫接種28日齡的SPF雞均未出現(xiàn)局部腫塊及不良反應(yīng)，說明3種佐劑的生物兼容性較好，易吸收，無毒副作用。經(jīng)試驗，3種進(jìn)口油佐劑配制的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗免疫28日齡的SPF雞進(jìn)行效力檢驗結(jié)果顯示，不同佐劑制備的滅活疫苗的抗體效價確實存在明顯差異，只有WG40作為佐劑

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電話：（0531）85990243；85975852的疫苗，免疫后2周H9N2流感病毒的抗體達(dá)到合格水平，其余佐劑則在免疫3周后才能達(dá)到合格水平。實驗結(jié)果認(rèn)為WG40白油可以作為30日齡左右育成雞的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗的理想佐劑，但是以WG40為佐劑的禽流感(H9N2亞型)滅活疫苗在產(chǎn)蛋禽上的實際應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步試驗驗證。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳伯倫,張澤紀(jì),陳偉斌.禽流感研究 I.雞 A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定 [J].中國獸醫(yī)雜志,1994(10)∶3-5.

[2] 唐秀英,付朝陽.H9亞型禽流感的流行與防制[J].預(yù)防獸醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2000(4)∶1-3.

[3] 李明義,范根成,杜元釗,等.禽流感(H5、H9亞型)二價油乳劑滅活疫苗試驗研究[J].中國動物檢疫,2005,22(4)∶22-24.

[4] 白軍,劉淑紅.H9亞型禽流感疫苗研究進(jìn)展[J].畜牧與 飼 料 科 學(xué),2016(11)∶102-103.

[5] 喬榮岑,習(xí)向鋒,孫進(jìn)忠,等.雞新城疫、H9亞型禽流感二聯(lián)滅活疫苗的制備方法,CN101607084[P].2009.

[6] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2011.

[7] 沈克飛,曹蘭,尹繼剛,等.免疫佐劑研究進(jìn)展[J].動物醫(yī) 學(xué) 進(jìn) 展,2007,28(s1)∶34-36.

[8] 王振輝,慈洪波,武桂梅,等.不同來源注射用白油佐劑免疫效果分析[J].中國家禽,2013,35(19)∶48-50.