趙楊 李昉璇 郭豐麗 穆坤 吳楠 張海蓮 劉俊田

吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）是肝臟外唯一可以代謝色氨酸的限速酶，很多惡性腫瘤患者的癌組織中IDO高表達且外周血中IDO活性增加[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌化療耐藥后IDO表達增高[1]，乳腺癌患者外周血IDO活性高于正常人且與化療療效有關[2-3]。本研究旨在分析行新輔助化療乳腺癌患者的癌組織中IDO表達及外周血中IDO活性與化療療效的相關性，為臨床預測化療是否敏感提供一定信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 收集2015年9月至2016年12月53例于天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院經(jīng)粗針穿刺活檢術證實為乳腺癌并行新輔助化療患者的臨床病理資料及化療前腫瘤組織穿刺標本、血液標本。53例患者的年齡為24～68歲，中位年齡50歲。

1.1.2 試劑 IDO抗體Clone 10.1（美國Milliper公司）、DAB顯色劑及抗體稀釋液ZLI-9030（北京中杉金橋生物技術有限公司）、犬尿氨酸（上海君創(chuàng)生物科技有限公司）、L-色氨酸（上海藍季科技發(fā)展有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學法 穿刺組織標本經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋后4 μm厚連續(xù)切片，SP法進行IDO蛋白免疫組織化學染色，PBS代替一抗作陰性對照。陽性細胞定位于細胞漿染成棕黃色，采用半定量積分法評價。根據(jù)每張切片的陽性細胞指數(shù)及著色強弱計分：陽性細胞＜5%（0分），5%～30%（1分），31%～70%（2分），＞71%（3分）；按著色強弱評分：未著色0分，弱著色1分，中等著色2分，強著色3分。IDO表達最終評分標準：兩者評分相加0～1分IDO（-），2～3分IDO（+），4～5分IDO（++），6分IDO（+++）。0～3分定義為IDO低表達，4～6分為高表達[4]。陽性細胞指數(shù)=陽性細胞數(shù)/計數(shù)細胞總數(shù)×100%。

1.2.2 高效液相色譜法 配制色氨酸（tryptophan,Trp）和犬尿氨酸（kynurenine,Kyn）標準儲備液，放入冰箱備用。收集53例乳腺癌患者新輔助化療前空腹外周靜脈血3 mL，分離血清于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩ＩV檢測條件為色譜柱：Kromasil RP-C18柱（內(nèi)徑4.6 mm，長度150 mm，粒徑5 μm）；流動相：15 mmol/L乙酸鈉-乙酸溶液（含5%乙腈、pH為4.0）；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；進樣量：20 μL；數(shù)據(jù)處理：Anstar色譜工作站。Kyn、Trp采用外標法測定峰面積定量分析。外周血IDO活性采用血清Kyn/Trp的比值評估。

1.2.3 化療療效評估 標準新輔助化療療效從臨床療效及病理完全緩解兩方面評估。臨床療效采用實體瘤療效評價標準RECIST 1.1版評估，分為完全緩解（complete response，CR）、部分緩解（partial response，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進展（progressive disease，PD）。新輔助化療臨床療效敏感組為CR與PR，臨床療效不敏感組為SD與PD。病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）采用美國乳腺與腸道外科輔助治療研究組（national surgical adjuvant breast and bowel project，NSABP）評估標準。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料均數(shù)比較采用t檢驗和單因素方差分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗、Fisher確切概率法，多因素分析采用二元Logistic回歸。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌患者臨床病理特征

根據(jù)AJCC癌癥分期手冊（第7版）中的TNM分期，53例乳腺癌患者新輔助化療前Ⅱ期4例，Ⅲ期48例，Ⅳ期1例。新輔助化療1～8個周期，中位化療3個周期。紫杉類聯(lián)合蒽環(huán)類化療方案50例，單純蒽環(huán)類方案2例，單純紫杉類方案1例。組織學分類中乳腺浸潤性癌45例，其他8例。參照2011年St.Gallen共識分子分型，Luminal型35例，HER-2過表達型11例，Basal-like型7例。53例患者中新輔助化療臨床療效敏感組為30例，pCR組為10例。

2.2 乳腺癌患者新輔助化療前IDO表達及活性

53例乳腺癌患者新輔助化療前28例癌組織中IDO高表達（52.83%），25例IDO低表達（47.17%），見圖1。新輔助化療前外周血中IDO平均活性為0.044±0.015，其中患者A外周血IDO高活性為0.052（圖2A），患者B外周血IDO低活性為0.031（圖2B）。新輔助化療前癌組織IDO高表達者的外周血IDO平均活性為0.050±0.017，IDO低表達者的IDO平均活性為0.038±0.009，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義（t=-3.08，P=0.004，圖3）。

2.3 乳腺癌患者新輔助化療前IDO表達及活性與臨床病理特征的相關性分析

新輔助化療前癌組織中IDO表達隨著臨床T分期（P=0.006）、N分期（P=0.020）、臨床分期（P=0.045）的增高而增強，且ER陽性者IDO高表達（P=0.014）；新輔助化療前外周血中IDO活性同樣隨著臨床T分期（P=0.019）和N分期的增高而升高（P=0.047，表1）。

2.4 乳腺癌患者新輔助化療前IDO表達及活性與化療療效的關系

在新輔助化療臨床療效不敏感組中，癌組織中的IDO表達較高（P=0.012）且外周血IDO活性較強（P=0.004）；在非pCR組中IDO表達增強（P=0.004）、IDO活性升高（P=0.001，表2）。

圖1 免疫組織化學法檢測乳腺癌組織中IDO表達（SP×400）

圖3 乳腺癌組織中IDO表達與外周血中IDO活性的關系

2.5 乳腺癌患者新輔助化療療效的單因素分析

新輔助化療臨床療效與化療前臨床T分期（P=0.049）、ER狀態(tài)（P=0.025）及分子分型（P=0.014）有關，化療前臨床T3、T4期、ER陽性及Luminal型乳腺癌患者化療敏感性較差；pCR與化療前臨床T分期相關（P=0.014），化療前臨床T1、T2期的患者更易達到pCR（表3）。

2.6 乳腺癌患者新輔助化療療效的多因素二元Lo?gistic回歸分析

新輔助化療前外周血中的IDO活性是影響pCR唯一的獨立因素（P=0.032）。新輔助化療臨床療效中分子分型是其獨立因素（P=0.041），而外周血中的IDO活性非其獨立因素可能與樣本數(shù)量較少有關（P=0.053，表4）。

表1 53例乳腺癌患者新輔助化療前癌組織中IDO表達及外周血中IDO活性與臨床病理特征的相關性

表1 53例乳腺癌患者新輔助化療前癌組織中IDO表達及外周血中IDO活性與臨床病理特征的相關性（續(xù)表1）

表2 53例乳腺癌患者新輔助化療前癌組織中IDO表達及外周血中IDO活性和化療療效的關系

表3 53例乳腺癌患者新輔助化療療效的單因素分析

表3 53例乳腺癌患者新輔助化療療效的單因素分析（續(xù)表3）

表4 乳腺癌患者新輔助化療療效的多因素二元Logistic回歸分析

3 討論

多種惡性腫瘤患者的癌組織中IDO表達增強或外周血中IDO活性升高，研究證實某些癌組織中IDO的表達與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移、激素受體狀態(tài)等臨床病理因素相關[1-2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者癌組織中的IDO高表達與較晚臨床分期及淋巴結轉移相關[5]。Isla Larrain等[6]研究也證實IDO表達與臨床分期呈正相關。本研究中乳腺癌患者癌組織中的IDO表達隨著臨床T分期、N分期及臨床分期的提高而增強；且ER陽性患者IDO表達水平高。

以往研究揭示腫瘤IDO表達和全身Trp代謝相關，腫瘤IDO高表達常伴隨外周血中Trp濃度降低、Kyn濃度升高以及異常的Kyn/Trp比值，如在子宮內(nèi)膜癌組織中IDO mRNA的升高伴隨著外周血Kyn/Trp比值的增大[7]，在乳腺癌組織中IDO高表達與外周血中Kyn/Trp高比值相關[8]。一項乳腺癌研究發(fā)現(xiàn)，外周血中Kyn/Trp比值在腫瘤遠處轉移組及局部復發(fā)組均升高，且遠處轉移組高于局部復發(fā)組、多處轉移組高于單一轉移組，而遠處轉移組的生存率明顯低于局部復發(fā)組[9]。以上研究表明Kyn/Trp比值與局部癌組織中的IDO表達相關，且與腫瘤的進展及預后有關。本研究證實新輔助化療前外周血中IDO活性與乳腺癌組織中IDO表達及腫瘤T、N分期呈正相關，以Kyn/Trp比值評估IDO活性可以提示局部癌組織中IDO表達及腫瘤進展情況。

研究發(fā)現(xiàn)化療藥物對腫瘤細胞IDO表達及活性均有影響，同時IDO酶也與化療耐藥相關[3，10]。本研究顯示，乳腺癌患者新輔助化療前IDO表達及活性與化療療效相關，在療效不敏感及非pCR組中，化療前腫瘤IDO表達增高、外周血IDO活性增強，且化療前外周血中IDO活性是影響pCR的獨立因素。卵巢癌的研究發(fā)現(xiàn)，紫杉醇耐藥卵巢癌細胞系及難治性卵巢癌組織中IDO高表達[1]。非小細胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，鉑類化療敏感患者血液單核細胞中IDO表達較低[11]，肺癌患者經(jīng)過鉑類或紫杉醇化療聯(lián)合放療后，療效敏感者Kyn/Trp比值高于不敏感者[12]。在乳腺癌中IDO表達或活性與化療耐藥間的關系尚不明確，但在乳腺癌內(nèi)分泌治療中證實使用氟維司群耐藥者IDO活性下降不顯著[13]。這些均與本研究得到的結論是一致的。

綜上所述，新輔助化療前癌組織中IDO表達及外周血中IDO活性與化療療效相關，可以為臨床預測化療是否敏感提供一定信息。

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