孟亞南 張 琳 劉召強 史芳芳 劉藝平 孔德政

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 汝陽縣第一高級中學(xué)，河南 洛陽 471200)

荷花 (Nelumbonucifera) 為睡蓮科蓮屬多年生水生草本花卉，花大而美，多為紅、粉、白、黃、復(fù)色等，具有很高的觀賞價值[1]。而花色是觀賞植物最重要的品質(zhì)之一。觀賞植物花色素形成、相關(guān)基因的篩選及呈色機理的研究，為花色改良和育種工作奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)[2]。

目前，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物相關(guān)基因組的研究[3-6]。針對不同觀賞植物花色的研究也逐步從表型生理方向過渡到分子水平。如桂花 (Osmanthusfragrans)[7]、葡萄風(fēng)信子 (Muscaribotryoides)[8]、鳳丹 (Paeoniaostii)[9]、紅花 (Carth-amustinctorius)[10]、切花菊 (Chrysanthemum×mori-folium)[11]等。然而，針對荷花花色形成相關(guān)分子機制缺乏深入研究，這在一定程度上限制了其花色的改良與創(chuàng)新。本實驗采用轉(zhuǎn)錄組測序及RT-PCR技術(shù)，獲得不同花色荷花品種的差異表達基因，篩選出與花青素苷生物合成相關(guān)關(guān)鍵基因，并驗證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，為后期荷花花色改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為荷花品種 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ 栽植于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)第3生活區(qū)試驗基地。分別采集4個時期 (初蕾期、松蕾期、初花期、盛花期) 的荷花花瓣，用去離子水沖洗表面雜質(zhì)，用錫箔紙包好放于液氮中速凍，并及時轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 RNA的樣品檢測和文庫構(gòu)建

‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ 松蕾期花瓣樣品，送往北京百邁克生物科技有限公司，采用PureLink Plant RNAReagent Kit試劑盒提取總RNA。采用Nanodrop檢測RNA樣品的濃度，樣品檢測合格后，進行cDNA文庫的構(gòu)建，通過PCR富集得到cDNA文庫。采用Qubit 2.0和Agilent 2100檢測RNA的濃度和完整度，用Q-PCR法準(zhǔn)確定量文庫的有效濃度，獲得高質(zhì)量的測序數(shù)據(jù)后用Illumina Hiseq2500進行高通量測序。

1.3 序列拼接和功能注釋

用Trinity軟件對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行組裝，組裝成為Transcripts，將不同樣品組裝結(jié)果中多個可變剪接的Transcripts聚類到一個基因，得到unigene庫。通過unigene在Mapped Reads上的分布，檢驗片段化的隨機程度、基因數(shù)目的飽和情況。測序數(shù)據(jù)量可正向反映測序基因的數(shù)目，數(shù)據(jù)量越大，得到的基因數(shù)目越多。通過unigene核酸序列與數(shù)據(jù)庫的BLAST比對，可得到unigene的蛋白功能注釋信息，比對中選擇參數(shù)E-value不大于10-5。

1.4 RNA提取及實時熒光定量PCR分析

選擇與花青素苷合成的相關(guān)基因 (CHS基因、DFR基因、ANS基因、UF3GT基因) 進行RT-PCR驗證分析。采用SK8661柱式植物總RNA抽提純化試劑盒提取荷花品種 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ 花瓣的RNA。通過大連寶生物工程(大連)有限公司購買的PrimeScriptTMII1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒方法合成cDNA。以荷花18S rRNA為內(nèi)參基因，PCR引物序列運用primer premier 5.0設(shè)計，引物合成由北京Biomed公司完成，引物序列如表1所示[12]。按照Invitrogen公司的Power SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒方法配制反應(yīng)體系。

表1 荷花 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ RT-PCR所用引物序列Table 1 The primers of RT-PCR genes in lotus ′Qingyu′and ′Baiyangdianhonglian′

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果分析

2個品種荷花花瓣的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，共得到11.56 Gb的有效數(shù)據(jù)，其Q30堿基百分比均不小于87.44%，表明測序結(jié)果可靠，可用于后續(xù)的分析。對組裝結(jié)果進行統(tǒng)計，得到序列重疊群 (Contig)，轉(zhuǎn)錄本序列 (Transcript) 和單基因序列 (Unigene) 長度分布表，如表2所示?？偣伯a(chǎn)生50 154條單基因序列和78 384條轉(zhuǎn)錄本序列，N50分別為1 412 bp和1 715 bp，組裝完整性較高。其中長度區(qū)間位于200～300 bp的單基因序列數(shù)量最多，為16 788條，占33.47%。其次是長度區(qū)間位于300～400 bp和400～500 bp單基因序列數(shù)量較多。

表2 unigene組裝結(jié)果統(tǒng)計Table 2 Statistics of unigene assembly result

2.2 功能分類

為獲得unigene的功能分類信息，從NR蛋白分析、GO分析、COG分析、KEGG分析等幾個方面進行注釋分析。在NR蛋白分析中，共有32 194條 (64.19%) unigene在設(shè)定的E值范圍內(nèi) (E-value ≤ 10-5)，可以對比分析到NR蛋白數(shù)據(jù)庫中。通過比對分析，同源蛋白質(zhì)序列和相似功能蛋白質(zhì)序列中具有數(shù)量最多是葡萄 (Vitisvinifera) (39.5%) 和可可樹 (Theobromacacao) (10.6%)。其次，還有碧桃 (Amygdaluspersicavar.persicaf.duplex) (5.9%)、楊樹 (Populussp.) (5.5%)、蓖麻 (Ricinuscommunis) (5.0%)。

在本實驗的轉(zhuǎn)錄本中，能夠注釋到GO分類的unigene有23 753條 (47.36%)，被分成了56個類別，被分成細胞組分 (16個)、分子功能 (16個)、生物學(xué)工程 (24個) 3類。有10 374條unigene可注釋到COG數(shù)據(jù)庫中，占總unigene的20.68%。其中有2 792條unigene注釋到未知功能基因，占26.91%。其次數(shù)目較多的為重組和修復(fù)功能 (1 310條，12.63%)，轉(zhuǎn)錄功能 (1 247條，12.02%)，核糖體結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運、分子伴侶。

將unigene比對到KEGG數(shù)據(jù)庫中，共有9 550條unigene參與了194個代謝通路，占總unigene的19.04%，分為五大代謝通路類型，分別是細胞過程、新陳代謝、生物系統(tǒng)、基因信息過程、環(huán)境信息過程，參與新陳代謝途徑unigene的數(shù)量最多，其次為基因信息過程代謝途徑。本研究集中花色形成相關(guān)因素富集分析，其中，共有40條unigene參與黃酮類化合物生物合成代謝通路，有34條unigene參與胡蘿卜素生物合成代謝通路，有8條unigene參與黃酮和黃酮醇生物合成代謝通路，有92條unigene參與苯丙烷生物合成代謝通路。

2.3 差異表達基因分析

通過對樣本 ‘青玉’ 花瓣和 ‘白洋淀’ 松蕾期的花瓣2個轉(zhuǎn)錄本文庫進行差異基因的表達分析，共獲得1 142條差異基因，包括587條上調(diào)基因，555條下調(diào)基因。在本研究中，以FDR < 0.01且FC ≥ 2為篩選標(biāo)準(zhǔn)。上調(diào)基因中差異較顯著的有16條，下調(diào)基因中差異較顯著的基因有13條。

2.3.1差異表達基因的功能注釋和富集分析

對樣本 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀’ 的差異表達基因進行GO功能富集分析，能注釋到的unigene有800條，分布在生物過程 (BP)、細胞組分 (CC)、分子功能 (MF) 三大類別上。其中，在細胞組分分類中，差異表達基因GO二級節(jié)點為：細胞成分、細胞、細胞器、生物膜、細胞器組分的分布數(shù)量最多；在分子功能分類中，差異表達基因GO二級節(jié)點分布數(shù)量較多的為催化活性、結(jié)合性；在生物學(xué)過程分類中，差異表達基因GO二級節(jié)點分布數(shù)量最多的為代謝過程、細胞過程、刺激應(yīng)答、生物調(diào)控，具體結(jié)果見圖1。

橫坐標(biāo)表示GO三大分類下的二級節(jié)點；縱坐標(biāo)表示注釋到該節(jié)點的基因數(shù)目及占所有基因數(shù)的百分比；右邊縱坐標(biāo)括號中代表DEG Unigene。

圖1差異表達基因GO二級節(jié)點注釋統(tǒng)計
Fig.1 GO branch classification of DEG genes

利用topGO軟件，結(jié)合樣品 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ 轉(zhuǎn)錄組的注釋信息，對有GO功能的DEG gene進行分析，進行2組樣品間的DEG gene的GO功能富集研究。以P-value ≤ 0.05為篩選顯著GO term的標(biāo)準(zhǔn)。以CC為例，找出顯著富集的GO term，并對顯著富集的節(jié)點在GO體系中以有向無環(huán)圖的形式進行直觀展示。得知，topGO_CC term下顯著富集到的功能分類中，顯著性最高的GO term功能分類為葉綠體，KS值為2.50 × 10-9，注釋到該term的基因數(shù)為3 547個，注釋到該term的DEG gene數(shù)目為140個，注釋到該term的DEG gene數(shù)目的期望值為113.99個。其次，在分子功能中顯著性較高的GO term功能分類依次為光系統(tǒng)II (1.80 × 10-7)、光系統(tǒng) (2.80 × 10-6)、葉綠體基質(zhì) (3.10 × 10-6)、葉綠體類囊體膜 (1.30 × 10-5)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (2.80 × 10-5)、細胞質(zhì) (5.50 × 10-5)、質(zhì)外體 (6.30 × 10-5)、細胞壁 (7.60 × 10-5)、質(zhì)體小球 (0.000 2)、高爾基體 (0.000 24) (表3)。

表3 差異表達基因topGO富集結(jié)果 (細胞組分)Table 3 TopGO enrichment results of DEG genes (cellular component)

注：GO.ID為GO節(jié)點編號；Term為GO節(jié)點名稱；Annotated為所有基因注釋到該功能的基因數(shù)；Significant為DEG注釋到該功能的基因數(shù)；Expected為注釋到該功能DEG數(shù)目的期望值；KS為富集節(jié)點的顯著性統(tǒng)計，KS值越小，表明富集越顯著。

由表4可知：topGO_BP term下顯著富集到的功能分類中，鎘的響應(yīng)是最為顯著富集的GO term，DEG gene注釋到該功能的基因數(shù)為24個，期望值為22.35，KS值為2.50 × 10-9，其次較顯著GO term的功能分類分別為鹽脅迫效應(yīng) (8.00 × 10-8)、蛋白酶體核心 (4.30 × 10-6)、異戊烯二磷酸生物合成 (9.50 × 10-6)、過氧化氫反應(yīng) (2.10 × 10-5)、葉綠體組織 (2.30 × 10-5)、細胞質(zhì)運輸 (4.50 × 10-5)等。

表4 差異表達基因topGO生物學(xué)過程富集結(jié)果Table 4 TopGO enrichment results of DEG genes (biological process)

topGO_MF (molecular function) term下顯著富集到的功能分類中，顯著性最高的GO term功能分類為葉綠體結(jié)合，KS值為2.20 × 10-6。注釋到該term的基因數(shù)為40個，注釋到該term的DEG gene數(shù)目為17個，注釋到該term的DEG 數(shù)目的期望值為1.44。隨后，在分子功能中顯著性較高的GO term功能分類依次為絲氨酸內(nèi)肽酶活性 (6.00 × 10-5)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性 (0.000 11)、類固醇脫氫酶活性 (0.000 28)、烷烴加氧酶活性 (0.000 28)、鐵離子結(jié)合 (0.001 11)、熱休克蛋白結(jié)合 (0.001 13)、電子載體 (0.001 40)、木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶活性 (0.002 34)、鋅離子結(jié)合 (0.002 49)、氧化還原酶活性 (0.003 03)、水通道活性 (0.003 28) (表5)。

表5 差異表達基因topGO富集結(jié)果 (分子功能)Table 5 TopGO enrichment results of DEG genes (molecular function)

在 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ 的轉(zhuǎn)錄本中，能夠注釋到COG數(shù)據(jù)庫的差異表達基因共有370個。分別為：基因功能預(yù)測、生物學(xué)功能、蛋白質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄、能量生產(chǎn)與節(jié)能。利用該數(shù)據(jù)庫可以對基因產(chǎn)物進行直系同源分類，利用不同的功能分類，結(jié)合特定時間和條件下研究對象的分布，預(yù)測對應(yīng)時期和對應(yīng)環(huán)境下的某一類偏向，從而做出科學(xué)的篩選分析 (圖2)。

圖2差異表達基因COG注釋分類統(tǒng)計
Fig.2 COG classification statistics of DEG genes

在 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ 的轉(zhuǎn)錄本中，能夠注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫的差異表達基因247個，共參與到76條pathway中。其中，歸入unigene數(shù)目最多的5條KEGG途徑分別為核糖體、光合作用、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉與蔗糖代謝、檸檬酸循環(huán)。

本研究對差異表達基因的pathway進行了全面注釋分析，可知在76條pathway中，黃酮類化合物生物合成4個、花青素苷合成1個、胡蘿卜素生物合成1個、黃酮和黃酮醇生物合成1個、苯丙烷生物合成5個等5條代謝途徑與花色素形成有密切的關(guān)系。通過所選擇的5個與本研究相關(guān)的KEGG通路注釋圖，共找到相關(guān)類基因c35395.graph_c0、c27798.graph_c0、c34747.graph_c0、c37226.graph_c0、c40064.graph_c0、c41744.graph_c0、c32055.graph_c0、c37518.graph_c0等。

對差異表達基因進行KEGG代謝通路富集分析，結(jié)果顯示，富集效果最為顯著的代謝通路是丙氨酸，天門冬氨酸和谷氨酸代謝，其次是α-亞麻酸代謝、花青素苷生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、丁酸代謝、檸檬酸循環(huán)、黃酮類化合物生物合成、半乳糖代謝、糖酵解途徑、氮代謝 (圖3)。

圖3差異表達基因KEGG通路富集散點圖
Fig.3 KEGG pathway enrichment scatter diagram of DEG genes

2.3.2荷花花色素苷相關(guān)基因篩選

通過對 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ 松蕾期花瓣的測序結(jié)果進行功能注釋、功能分類及代謝途徑分析，共找到與花青素苷代謝途徑相關(guān)類差異表達基因如表6所示，其中ANS基因9個，分別是c37436.graph_c0、c47965.graph_c0、c41915.graph_c0、c47362.graph_c0、c35395.graph_c0、c50030.graph_c0、c37243. graph_c0、c38760.graph_c0、c1962-9.

graph_c0，包括6條基因呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，3條基因呈下調(diào)趨勢，推測不同的ANS基因有不同的調(diào)節(jié)作用；CHS基因c42578.graph_c0，表達為上調(diào)；DFR基因c35275.graph_c0、c45153.graph_c0；UF3GT基因c35395.graph_c0等。其中有KEGG注釋信息的差異表達基因有c35395.graph_c0、c41915.

graph_c0、c47362.graph_c0、c38760.gra-ph_c0，分別參與的KEGG pathway有ko00942 (花青素苷生物合成)、ko00561 (甘油酯代謝) 和ko00564 (甘油磷脂代謝)、ko00190 (氧化磷酸化)、ko00020 (檸檬酸循環(huán))。

2.4 荷花花色苷相關(guān)基因的實時熒光定量PCR驗證

以荷花18S rRNA作為內(nèi)參基因，用相對定量的方法 (按2-ΔΔCt公式) 進行實時熒光定量PCR分析，并進行基因表達水平的比較，由圖4～7：實時熒光定量PCR分析花青素苷相關(guān)基因c42578.graph_c0 (CHS基因)、c45153.graph_c0 (DFR基因)、c38760.graph_c0 (ANS基因)、c35395.graph_c0 (UF3GT基因) 的相對表達量，4個基因在2種類型花瓣不同時期中均有表達，表達量有顯著差異。 ‘青玉’ 花瓣表達量總體明顯低于 ‘白洋淀紅蓮’ 花瓣表達量。

表6 荷花 ‘青玉’ 和 ‘白洋淀紅蓮’ 轉(zhuǎn)錄組測序中花色相關(guān)差異基因的表達與功能Table 6 Expression and function of DEG genes related to flower color in transcriptome sequencing

注：Log2FC為表達量差異倍數(shù)的對數(shù)值。

圖4荷花CHS基因相對表達量
Fig.4 The relative expression ofCHSgene in lotus

圖5荷花DFR基因相對表達量
Fig.5 The relative expression ofDFRgene in lotus

圖6荷花ANS基因相對表達量
Fig.6 The relative expression ofANSgene in lotus

圖7荷花UF3GT基因相對表達量
Fig.7 The relative expression ofUF3GTgene in lotus

分析得知，在 ‘青玉’ 花瓣中各個時期CHS基因表達量明顯低于 ‘白洋淀紅蓮’，松蕾期表達量最高。在 ‘白洋淀紅蓮’ 花瓣中，初花期的表達量相對較高，在花朵開放過程中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，在盛花期的表達量稍低于初花期。DFR基因在 ‘青玉’ 花瓣中表達量均較低，盛花期表達量僅為0.04，此基因在2個荷花品種中表達量存在顯著差異。在 ‘白洋淀紅蓮’ 花瓣中，松蕾期的表達量相對較高，在花朵開放過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在初蕾期到松蕾期上升效果明顯。推測DFR基因可能是紅色著色所必須的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因。ANS基因在 ‘青玉’ 花瓣各個時期中表達量明顯低于CHS、DFR基因，推測ANS基因是后期花青素苷結(jié)構(gòu)基因，在白色花中表達信號極弱。2個品種相比較而言，差異倍數(shù)較大，在松蕾期， ‘白洋淀紅蓮’ 基因表達量相較 ‘青玉’ 呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)一致。UF3GT基因在 ‘白洋淀紅蓮’ 花瓣中表達量較高，初花期為其表達量最高的時期。2個品種相比較而言，差異倍數(shù)較大，尤其是初花期與盛花期，差異倍數(shù)為131倍和127倍。在松蕾期，白洋淀紅蓮基因表達量相較青玉，呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，與轉(zhuǎn)錄組測序上調(diào)趨勢一致，推測此基因表達量的高低，可能對花色的呈色起關(guān)鍵指導(dǎo)作用。

3 結(jié)論與討論

通過Illumina Hiseq2500測序技術(shù)平臺，共獲得數(shù)據(jù)11.56 Gb clean data，共產(chǎn)生50 154條unigene。對樣本 ‘青玉’ 花瓣和 ‘白洋淀紅蓮’ 松蕾期花瓣2個轉(zhuǎn)錄本文庫進行差異基因的表達分析 (DEG分析)，共獲得1 142條差異表達基因，包括587條上調(diào)基因，555條下調(diào)基因。其中上調(diào)基因中差異較顯著的有16條，下調(diào)基因中差異較顯著的有13條。經(jīng)過差異表達基因生物蛋白功能注釋分析，在KEGG代謝途徑中查找與花色相關(guān)的代謝途徑，共找到與花色相關(guān)代謝通路5個，相關(guān)表達基因16個，并找到花青素苷相關(guān)基因4個，分別是CHS基因、DFR基因、ANS基因、UF3GT基因，對其進行實時熒光定量PCR表達驗證，得知這4個基因在2個品種花瓣不同時期條件下，表達量存在顯著差異，各個時期的表達量在 ‘白洋淀紅蓮’ 中比 ‘青玉’ 較高。在白色荷花品種 ‘青玉’ 花瓣中，各個時期花青素苷基因的表達量均較低，推測其花青素苷積累量可能較低。CHS基因、ANS基因、UF3GT基因在 ‘白洋淀紅蓮’ 中初花期的表達量最大，而在 ‘青玉’ 中松蕾期的表達量大。DFR基因在 ‘白洋淀紅蓮’ 中松蕾期的表達量最大。其中，在本實驗中花青素苷合成晚期結(jié)構(gòu)基因表達中，UF3GT基因在 ‘白洋淀紅蓮’ 花瓣中表達量遠遠大于 ‘青玉’ 花瓣。后期可以篩選不同花色的荷花品種，深入研究與花青素苷形成的相關(guān)基因，并分析出其關(guān)鍵基因。關(guān)于花青素苷的研究在其他植物中也有相關(guān)研究[13-16]，與花色素苷相關(guān)的基因逐漸豐富，為后期花色的創(chuàng)新研究打下基礎(chǔ)。在未來研究中，可進一步結(jié)合HPLC分析花青素苷的種類及含量。如鄧嬌等對108種不同花色的荷花花瓣類黃酮色素及著色機理進行研究，得知不同品種荷花花瓣中含有5種花青素，并對2個品種的荷花做蛋白組學(xué)分析，驗證了相關(guān)基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白組水平的一致性[17]。另外，花青素的生物合成受結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的共同控制，對花青素的代謝研究會有更加深刻的認識[18-20]。許傳俊等人對不同花色、不同階段的蝴蝶蘭 (Phalaenopsisaphrodite) 進行研究，得知影響其花色素苷合成途徑的10個結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達量存在差異[21]。在本研究中，篩選出與荷花花瓣中花青素苷合成相關(guān)的4個結(jié)構(gòu)基因，相關(guān)基因進行篩選與表達分析，后期也可以結(jié)合花青素生物合成的調(diào)節(jié)基因共同研究。深入挖掘影響花青素苷代謝途徑的相關(guān)因素，為闡明荷花花色形成的機理提供理論依據(jù)，為荷花的花色改良分子育種奠定基礎(chǔ)。

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