柳 青 歐曉紅

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2. 西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

染色體作為生物遺傳物質(zhì)的載體，在各生物類(lèi)群中，染色體的數(shù)目、大小、形態(tài)、組型、減數(shù)分裂行為及異染色質(zhì)分布等特征都具有相對(duì)穩(wěn)定性[1-2]。因此，與形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)一樣，染色體特征數(shù)據(jù)已經(jīng)成為生物鑒別分類(lèi)和親緣關(guān)系界定的基本數(shù)據(jù)之一[3]。通過(guò)研究和分析不同生物類(lèi)群染色體特征，可以解決基于形態(tài)分類(lèi)中不能解決的許多疑難問(wèn)題。

云南蝗 (Yunnanitescoriacea) 隸屬直翅目 (Orthoptera) 蝗總科 (Acridoidea) 瘤錐蝗科 (Chrotogonidae) 云南蝗屬 (Yunnanites)，為我國(guó)特有種，主要分布于我國(guó)西南地區(qū)的云南、貴州和四川等地[4]。前期野外調(diào)查時(shí)在云南省昆明西山和東川分別采到云南蝗標(biāo)本，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，2個(gè)種群云南蝗在個(gè)體大小、觸角長(zhǎng)短和后足股節(jié)下膝側(cè)片顏色3個(gè)方面表現(xiàn)出明顯差別。因此，本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的液氮冰凍壓片法及BSG顯帶法對(duì)云南蝗2個(gè)種群的染色體核型和C帶帶型進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步明確云南蝗不同種群的染色體特征，為云南蝗細(xì)胞學(xué)研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

云南蝗標(biāo)本均采自野外，具體采集信息見(jiàn)表1。

表1 云南蝗標(biāo)本來(lái)源及研究個(gè)體數(shù)量Table 1 Specimen source and number of studied individuals of Y.coriacea

1.2 染色體玻片制備

將采集的云南蝗雄蟲(chóng)按個(gè)體編號(hào)，依據(jù)個(gè)體大小不同，活體腹腔注射0.05%的秋水仙素溶液4～6 μL，經(jīng)6～8 h后解剖取出精巢，放入0.08%的生理鹽水中低滲10～15 min，再浸入甲醇冰醋酸 (體積比3∶1) 固定液內(nèi)固定6～12 h，然后移入75%酒精內(nèi)常溫保存[5]。制片時(shí)取出預(yù)先保存好的精巢材料，在體視解剖鏡下用解剖針挑取精小管盲端部分2～3根置于潔凈的載玻片上，滴加45%冰醋酸軟化5～10 min，蓋上蓋玻片進(jìn)行壓片，隨后置于液氮罐中冰凍3～5 min，取出后快速揭片，在室溫下無(wú)塵處自然老化2～6 d。

1.3 C帶核型處理

C帶核型處理采用BSG法進(jìn)行。將老化好的玻片置于5%新配制的飽和Ba (OH)2溶液中50 ℃恒溫水浴處理15～20 min，取出后用同溫度的蒸餾水沖洗，再經(jīng)2 × SSC于60 ℃恒溫水浴處理1 h，用同溫度的蒸餾水沖洗晾干，5% Giemsa染液 (pH 6.8) 染色10～15 min，蒸餾水沖洗，自然干燥，鏡檢[6-7]。使用Nikon ECLIPSS E800進(jìn)行顯微拍照，每種選取5～10個(gè)染色體形態(tài)清晰、分散良好的分裂相細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)、C帶核型參數(shù)的測(cè)量和計(jì)算，并用Adobe Photoshop CS6軟件對(duì)染色體圖像切割配對(duì)，染色體類(lèi)型依據(jù)Levan等[8]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆明西山貓兒箐種群的染色體特征

2.1.1昆明西山貓兒箐種群的染色體核型

云南蝗昆明西山貓兒箐種群染色體核型見(jiàn)圖1，可知其染色體數(shù)目為2n(♂)=19，染色體臂指數(shù)NF=19；染色體類(lèi)型為端著絲粒染色體；性別決定機(jī)制均為XO型。該種群有絲分裂中期染色體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表2，其中染色體按照相對(duì)長(zhǎng)度 (RL) 可以分為3組：L組 (大型染色體) 3對(duì) (L1～L3)，RL值為10.33～13.06；M組 (中型染色體) 6對(duì) (M4～M9)，RL值為6.49～9.85；無(wú)小型染色體；性染色體X屬大型染色體，RL值為16.16，其相對(duì)長(zhǎng)度位居第1 (圖1, 表2)。因此其染色體組式為3L + 6M + X。

圖1云南蝗昆明西山貓兒箐種群染色體核型
Fig.1 Karyotype ofY.coriaceapopulation from Maoerqing

表2 云南蝗昆明西山貓兒箐種群有絲分裂中期染色體數(shù)據(jù)Table 2 Mitotic metaphase chromosome data of Y.coriacea population from Maoerqing

2.1.2昆明西山貓兒箐種群的C帶帶型

由圖2可知，云南蝗昆明西山貓兒箐種群染色體C帶帶型單一，每條染色體僅具有著絲粒帶，而無(wú)其他帶型。異染色質(zhì)在整個(gè)染色體組中的總含量為10.67%，M9染色體異染色質(zhì)含量最高，為14.88%，L2次之，其異染色質(zhì)含量為13.98%，性染色體X的異染色質(zhì)含量在整個(gè)染色體組中最低，為6.34% (表2)。

圖2云南蝗昆明西山貓兒箐種群染色體C帶核型模式圖
Fig.2 Chromosome C-banding karyotype pattern ofY.coriaceapopulation from Maoerqing

2.2 昆明東川拖布卡種群的染色體特征

2.2.1昆明東川拖布卡種群的染色體核型

云南蝗昆明東川拖布卡種群染色體核型見(jiàn)圖3。可知其染色體數(shù)目為2n(♂)=19，染色體臂指數(shù)NF=19；染色體類(lèi)型為端著絲粒染色體；性別決定機(jī)制均為XO型。該種群有絲分裂中期染色體數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表3，其中染色體按照相對(duì)長(zhǎng)度可以分為3組：L組 (大型染色體) 3對(duì) (L1～L3)，RL值為10.37～13.52；M組 (中型染色體) 6對(duì) (M4～M9)，RL值為6.48～9.40；無(wú)小型染色體；性染色體X屬大型染色體，RL值為18.47，其相對(duì)長(zhǎng)度位居第1 (圖3, 表3)。因此其染色體組式為3L + 6M + X。

圖3云南蝗昆明東川拖布卡種群染色體C帶核型
Fig.3 C-banding karyotype ofY.coriaceapopulation from Tuobuka

2.2.2昆明東川拖布卡種群的C帶帶型

由圖4觀察發(fā)現(xiàn)，昆明東川拖布卡種群具有著絲粒帶和端帶，且?guī)Ъy條數(shù)較多，除10條著絲粒帶外，端帶8條分別位于L1、L2、L3、M4、M5、M6、M9和性染色體X上，該種群的異染色質(zhì)總含量占29.53%。由表3可知：在染色體組中，M5染色體異染色質(zhì)含量最高，為46.42%；M9染色體次之，其異染色質(zhì)含量為42.71%；M7染色體的異染色質(zhì)含量在整個(gè)染色體組中最低，為14.87%；性染色體X的異染色質(zhì)含量為15.09%。

表3 云南蝗昆明東川拖布卡種群有絲分裂中期染色體數(shù)據(jù)Table 3 Mitotic metaphase chromosome data of Y.coriacea population from Tuobuka

圖4云南蝗昆明東川拖布卡種群染色體C帶核型模式圖
Fig.4 Chromosome C-banding karyotype pattern ofY.coriaceapopulation from Tuobuka

2.3 2種種群染色體特征對(duì)比分析

大量的研究表明，基于染色體數(shù)據(jù)的細(xì)胞分類(lèi)是傳統(tǒng)形態(tài)分類(lèi)的很好補(bǔ)充。染色體的數(shù)目、組式可以作為科級(jí)或?qū)偌?jí)階元的分類(lèi)指標(biāo)，而染色體C帶異染色質(zhì)分布位置、大小、數(shù)量、異染色質(zhì)總含量及性染色體X的位次等可以作為屬、種及種下階元的分類(lèi)指標(biāo)[2,9-11]。從2個(gè)種群的染色體特征來(lái)看，云南蝗昆明西山貓兒箐種群和昆明東川拖布卡種群染色體特征具有較高的相似性，兩者在常規(guī)染色體核型包括染色體數(shù)目、類(lèi)型、臂指數(shù)、組式、性別決定機(jī)制及性染色體位次等方面均表現(xiàn)出高度一致，反映出兩者染色體特征在種內(nèi)水平上的穩(wěn)定性；兩者的差異主要表現(xiàn)在染色體C帶帶型和異染色質(zhì)總含量方面，前者C帶帶型相對(duì)單一，每條染色體僅具有著絲粒帶，而無(wú)其他帶型，異染色質(zhì)總含量為10.67%，而后者具有著絲粒帶和端帶，帶紋條數(shù)較多，除10條著絲粒帶外還具有8條端帶，異染色質(zhì)總含量明顯高于前者，為29.53%，反映出染色體C帶核型用于種及種下階元鑒別分類(lèi)的重要作用。

3 結(jié)論與討論

前期的野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南蝗昆明西山貓兒箐種群和昆明東川拖布卡種群在外部形態(tài)上表現(xiàn)出3點(diǎn)明顯差異：1) 昆明西山貓兒箐種群個(gè)體較東川拖布卡種群個(gè)體明顯小；2) 東川拖布卡種群的觸角明顯較前者的長(zhǎng)；3) 后足股節(jié)下膝側(cè)片的顏色不同，昆明西山貓兒箐種群的為綠色，而東川拖布卡種群的為淡紅色。再結(jié)合本研究云南蝗2個(gè)種群在染色體C帶帶型和異染色質(zhì)總含量方面的差異，建議可將云南蝗2個(gè)地理種群視為2個(gè)不同的地理亞種。

翅對(duì)昆蟲(chóng)的覓食、求偶、遷移和擴(kuò)散等方面都具有十分重要的作用，昆蟲(chóng)分布生境發(fā)生變化，昆蟲(chóng)的翅也會(huì)呈現(xiàn)出相應(yīng)的適應(yīng)性變化[12]?，F(xiàn)有的研究表明，隨海拔升高，蝗蟲(chóng)的翅退化強(qiáng)烈[12-13]。云南蝗前翅柳葉狀，側(cè)置，僅達(dá)第2腹節(jié)背板，為典型的短翅型蝗蟲(chóng)種類(lèi)，因此，其遷移擴(kuò)散能力弱，這在很大程度上限制了云南蝗不同種群之間的基因交流，從而推動(dòng)不同地理種群間物種分化的形成。本研究?jī)H研究了云南蝗2個(gè)地理種群的染色體C帶核型，今后應(yīng)在更大范圍采集不同地區(qū)的云南蝗標(biāo)本，結(jié)合外生殖器解剖和DNA分子標(biāo)記等技術(shù)方法對(duì)云南蝗不同種群進(jìn)行更為深入細(xì)致的研究。

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