杜 琳，王麗芳，馮小慧，張三粉，宋 潔，姚一萍，史 培，申 捷

(1.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院，內蒙古呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區(qū)疫病預防控制中心，內蒙古呼和浩特 010010)

全球范圍內，奶牛乳房炎是影響奶業(yè)發(fā)展的重要因素之一。每年因乳房炎造成的經(jīng)濟損失巨大，每年全球因奶牛乳房炎損失將近350億美元[1]，其中美國損失20億美元[2]，英國損失3億英鎊[3]，荷蘭每頭牛因患乳房炎損失114歐元[4]，我國每年損失150億元～450億元[5]。目前治療奶牛乳房炎主要依賴于抗生素的使用，從而導致藥物殘留等問題[6]，威脅著我國的食品安全。奶牛乳房炎及其致病菌對奶牛的高感染率和強耐藥性，已經(jīng)嚴重制約奶業(yè)的健康發(fā)展，而且由于其流行范圍廣、感染部位多、多重耐藥性等也給臨床防治帶來巨大的困難[7]。我國奶業(yè)在奶牛乳房炎病原菌的防控和獸藥殘留方面面臨的問題尤為嚴峻。因此，為摸清我國奶牛被病原菌感染情況和耐藥情況，急需開展奶牛乳房炎病原菌的耐藥性風險評估，其研究成果不僅將為獸醫(yī)臨床用藥提供可靠的理論依據(jù)，防止濫用抗生素，而且將為控制細菌耐藥性的擴散提供幫助。同時通過開展不同地域奶牛感染病原菌情況的了解，掌握各地區(qū)不同病原菌的感染率，將為國家政府部門有目的、有計劃、有步驟的開展病原菌防控和獸藥殘留監(jiān)管提供指導意見[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 奶樣 對我國生鮮乳主產(chǎn)省區(qū)黑龍江、內蒙、山東、河北及上海5個省(市、自治區(qū))共247批次患乳房炎(包括臨床乳房炎與隱性乳房炎)病牛乳樣。每個省(市、自治區(qū))，選擇4種規(guī)模的牧場奶牛存欄：①500頭以下；②500頭～ 1 000頭；③1 000頭～3 000頭；④大于3 000頭，每個類型10個～15個，其中內蒙古、黑龍江、上海、河北各50份樣本，山東47份。采樣時棄去前3把乳，無菌取乳樣50 mL左右，4℃保存待檢。

1.1.2 主要試劑與培養(yǎng)基 綿羊脫纖血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB培養(yǎng)基)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司產(chǎn)品；氟苯尼考、氨曲南、利福平、氧氟沙星、復方新諾明、氯霉素、萬古霉素、頭孢西丁、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、克林霉素、苯唑西林、妥布霉素、利奈唑胺、美羅培南、奧格門汀、紅霉素、氨芐西林、頭孢噻呋、阿奇霉素、哌拉西林，由上海星佰生物技術有限公司定制成革蘭陽性菌藥敏板、革蘭陰性菌藥敏板。藥敏試驗藥物的選擇參考美國臨床與實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和農業(yè)部奶產(chǎn)品質量風險評估實驗室(北京)提出的藥敏試驗方案制定的藥敏試驗標準；2×EasyTaq?PCR Super Mix、細菌基因組DNA小量純化試劑盒，北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品；DNA標準DL 2 000、Agarose，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 取1 mL無菌采集的牛奶樣本，3 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪層，取菌體沉淀，用滅菌棉拭子分別于綿羊脫纖血瓊脂培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB 培養(yǎng)基)、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基及麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)16 h后觀察菌落形態(tài)。挑取疑似菌落染色鏡檢、進行純培養(yǎng)。并對分離獲得的流行菌株編號，對其分離時間、分離地點等信息進行記錄歸檔。

1.2.2 分子生物學鑒定

1.2.2.1 細菌基因組DNA的小量提取 參照全式金提取細菌基因組DNA小量純化試劑盒說明書進行。

1.2.2.2 16 S rDNA基因的PCR擴增 以提取出的細菌基因組DNA為模板，根據(jù)GenBank上的DNA序列設計[9]通用引物，其引物序列為：Bacterial 16s-F：ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT，Bacterial 16s-R：CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT。反應程序為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，75℃ 90 s，反應進行30個循環(huán)；72℃ 10 min。預期目的條帶大小為1 500 bp。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物的基因測序及序列分析 將PCR產(chǎn)物純化后連接pEasy-T1載體上，轉化至Trans-T1感受態(tài)細胞中，選取陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。所測基因序列與GenBank中已有序列進行Blast同源性比對。

1.2.3 藥敏試驗 對分離出的主要病原菌進行藥敏試驗，按照CLSI推薦的肉湯稀釋法進行，用大腸埃希菌標準菌株(ATCC25922)作為質控菌，根據(jù)CLSI(2016)的標準判斷其耐藥性[10]。

2 結果

2.1 細菌的形態(tài)學鑒定結果

對分離到的菌株進行形態(tài)學鑒定，金黃色葡萄球菌在高鹽甘露醇培養(yǎng)基上顯黃色，其外圍有一黃色的暈環(huán)。鏈球菌在50 mL/L綿羊脫纖血瓊脂平板上呈淡灰白色、隆起、閃光的小菌落。大腸埃希菌在伊紅美藍培養(yǎng)基上菌落中心呈紫黑色，有金屬光澤?？死撞暇邴溈祫P培養(yǎng)基上呈紅色，用接種環(huán)挑取，有明顯的拉絲現(xiàn)象。

革蘭染色并在油鏡下進行鏡檢，金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)革蘭陽性的球菌，排列成葡萄串狀。鏈球菌呈現(xiàn)革蘭陽性球菌，鏈狀排列。大腸埃希菌呈現(xiàn)革蘭陰性直桿菌，兩端鈍圓。克雷伯菌呈現(xiàn)較粗短的革蘭陰性桿菌。

2.2 分子生物學鑒定結果

用通用引物對分離株進行細菌16 S rDNA基因擴增，所得產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，均擴增出1 500 bp大小的片段。在NCBI上進行Blast比對。其中大腸埃希菌65株，占 37.14%；金黃色葡萄球菌30株，占17.14%；糞腸球菌21株，占12.00%；克雷伯菌18株，占10.29%；鏈球菌13株，占7.43%；檸檬酸桿菌12株，占6.86%；腐生葡萄球菌5株，占2.86%；變形桿菌4株，占2.29%；黏質沙雷菌3株，占1.71%；表皮葡萄球菌2株，占1.14%；產(chǎn)色葡萄球菌1株，占0.57%；鄉(xiāng)間布丘菌1株，占0.57%。每個省(市、自治區(qū))的細菌分離情況見表1。

2.3 藥敏試驗結果

2017年上半年共采集黑龍江省、內蒙古自治區(qū)、河北省、上海市及山東省5個省(市、自治區(qū))247批次患病乳房炎奶牛乳樣，分離出革蘭陽性菌72株。對分離的革蘭陽性菌進行藥敏性試驗，以確定其耐藥情況。

本年度調研中用于革蘭陽性菌耐藥性試驗的20種藥物來自11大類藥物，其中β內酰胺類7種、氨基糖苷類2種，四環(huán)素類1種，磺胺類1種，喹諾酮類2種，林可酰胺類1種，大環(huán)內酯類2種，氯霉素類1種，糖肽類1種，噁唑烷酮類1種，安莎霉素類1種。

革蘭陽性菌的藥敏試驗結果見表2。本次試驗分離到的革蘭陽性菌大部分具有不同程度的耐藥性，并且大多數(shù)為多重耐藥菌，其中耐單一藥物的6株，耐藥種類數(shù)最多的只有1株，能夠耐受11種藥物。單種藥物藥敏結果表明，所分離得到革蘭陽性菌對氨曲南的耐藥率最高，達到了100%，其次為青霉素(80.56%)、氟苯尼考(56.94%)、紅霉素(52.78%)、氧氟沙星(43.06%)、頭孢西丁(43.06%)、美羅培南(43.06%)、克林霉素(43.06%)和妥布霉素(40.28%)耐藥率均高于40%。耐藥率低于10%的為萬古霉素(全部敏感)、苯唑西林(全部敏感)、利奈唑胺(全部敏感)、奧格門汀(全部敏感)、復方新諾明(2.78%)、氯霉素(2.78%)、環(huán)丙沙星(6.94%)和氨芐西林(9.72%)。

表1 各個地區(qū)的細菌分布情況

表2 革蘭陽性菌的藥敏試驗結果

2017年上半年共采集黑龍江省、內蒙古自治區(qū)、河北省、北京市、上海市、山東省及四川省等5個省市自治區(qū)247批次患病乳房炎奶牛乳樣，分離出革蘭陰性菌103株。對分離的革蘭陰性菌進行藥敏性試驗，以確定其耐藥情況。

本年度調研中用于耐藥性試驗的15種藥物來自7大類藥物，其中β內酰胺類7種，氨基糖苷類1種，四環(huán)素類1種，磺胺類1種，喹諾酮類2種，氯霉素類2種，大環(huán)內酯類1種。

革蘭陰性菌的藥敏試驗結果見表3。本次試驗分離到的革蘭陰性菌大部分具有不同程度的耐藥性，并且大多數(shù)為多重耐藥菌，其中，耐單一藥物的8株(7.77%)。耐藥種類數(shù)最多的只有2株，能夠耐受10種藥物。單種藥物藥敏結果表明，所分離得到革蘭陰性菌對氨芐西林的耐藥性最高，達到了83.50%，其次為氟苯尼考(44.66%)、四環(huán)素(43.69%)耐藥率均高于40%。耐藥率低于10%的有美羅培南(全部敏感)、頭孢西丁(5.83%)和氨曲南(9.71%)。

3 討論

本試驗從黑龍江、內蒙、山東、河北和上海等地區(qū)共計247份乳房炎乳樣中分離到到細菌 175 株，通過形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定。確定最終分離到大腸埃希菌65株，金黃色葡萄球菌30株，糞腸球菌21株，克雷伯菌18株，鏈球菌13株，檸檬酸桿菌12株，腐生葡萄球菌5株，變形桿菌4株，黏質沙雷菌3株，表皮葡萄球菌2株，產(chǎn)色葡萄球菌1株，鄉(xiāng)間布丘菌1株。這說明乳房炎不僅僅是由單一細菌引起的，而是由多種細菌共同感染導致[11]。其中大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、克雷伯菌為奶牛乳房炎的主要病原菌。

從每個省(市、自治區(qū))的細菌分離情況來看，細菌分布呈現(xiàn)明顯的區(qū)域性[12]。其中內蒙古地區(qū)大腸埃希菌的分離率明顯高于其他4個地區(qū)，大腸埃希菌是引起乳房炎最重要的環(huán)境致病菌，大腸埃希菌廣泛存在于牛群的環(huán)境之中。牛舍中的糞便和牛床墊料都存在環(huán)境性病原菌，在擠奶、擠奶間歇期及干奶期時乳腺組織均可被感染，由于奶牛不斷地與環(huán)境中的病原菌接觸，加之在內蒙古地區(qū)采樣前不久，剛剛下過雨，這可能導致了奶牛的牛床和運動場較為泥濘，加重了大腸埃希菌等環(huán)境性致病菌的感染[13]。黑龍江地區(qū)的金黃色葡萄球菌分離率明顯高于其他4個地區(qū)，金黃色葡萄球菌則是引起奶牛乳房炎最重要的傳染性病原菌，金黃色葡萄球菌對乳腺組織有高度的親和力，主要損害乳房上皮細胞和腺泡的功能，導致牛奶產(chǎn)量和質量下降[14]。河北地區(qū)的病原菌則以糞腸球菌為主，糞腸球菌是哺乳動物的正常菌群的一部分，當奶牛乳頭閉鎖不全或受損時，糞腸球菌機會性的侵入乳房，引起感染。

表3 革蘭陰性菌的藥敏試驗結果

本研究通過藥物敏感性試驗進行分析，結果表明乳房炎病原菌對臨床上使用的抗菌藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，尤其革蘭陽性菌對氨曲南、青霉素、氟苯尼考、紅霉素、氧氟沙星、頭孢西丁、美羅培南、克林霉素及妥布霉素耐藥。革蘭陰性菌對氨芐西林、氟苯尼考及四環(huán)素耐藥。因此，在使用獸藥時應根據(jù)各地區(qū)流行菌株的耐藥特點，選擇敏感性高的藥物。

目前，細菌的耐藥性已得到了國內和國際上的廣泛關注[15-16]，我國為了加強獸用抗菌藥物管理，保障動物源性食品安全和公共衛(wèi)生安全，我國農業(yè)部獸醫(yī)局在2017年組織起草了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃(2017年-2020年)》，對生鮮乳中主要病原微生物的分離鑒定以及耐藥性的檢測，為獸藥殘留監(jiān)控、動物源性細菌耐藥監(jiān)測、監(jiān)管體系建設與完善提供專業(yè)指導，為牧場和奶牛的飼養(yǎng)管理提供更切實有效的用藥方案，切實保障養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、動物性食品安全、公共衛(wèi)生安全和生態(tài)環(huán)境安全。

參考文獻：

[1] Mungube E,Tenhagen B,Regassa F,et al.Reduced milk production in udder quarters with subclinical mastitis and associated economic losses in crossbred dairy cows in Ethiopia[J].Trop Anim Health Pro,2005,37(6): 503-512.

[2] Kayitsinga J,Schewe R L,Contreras G A,et al.Antimicrobial treatment of clinical mastitis in the eastern United States: The influence of dairy farmers' mastitis management and treatment behavior and attitudes.[J].J Dairy Sci,2016,100(2):1388-1407.

[3] Down P M,Bradley A J,Breen J E,et al.A Bayesian micro-simulation to evaluate the cost-effectiveness of interventions for mastitis control during the dry period in UK dairy herd:[J].Prev Vet Med,2016,133:64-72.

[4] Harel D A.IDF : Les chance de guerre s’accroissent sur les fronts libanais et syrien[J].J Dairy Sci,2015,98(4):2369-2380.

[5] 曹立亭.乳酸鏈球菌素治療奶牛臨床型乳房炎的研究[D].浙江杭州：浙江大學,2009.

[6] Barkema H W,Schukken Y H,Lam T J G M,et al.Incidence of clinical mastitis in dairy herds grouped in three categories by bulk milk somatic cell counts[J].Dairy Sci,1998,81:411-419.

[7] 李新圃,李宏勝,羅金印,等.奶牛乳房炎致病菌的分離鑒定及耐藥性研究[J].動物醫(yī)學進展,2015,36(11):36-39.

[8] 蘇 洋,蒲萬霞,陳智華,等.牛源金黃色葡萄球菌的耐藥性及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測[J].中國農業(yè)科學,2012,45(17):3602-3607.

[9] Weisburg W G,Barns S M,Pelletier D A,et al.16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J].J Bacteriol,1991,173(2):697.

[10] Jorgensen J H.Methods for antimicrobial dilution and disk susceptibility testing of infrequently isolated or fastidious bacteria; approved guideline[M].United States:Clinical and Laboratory Standards Institute,2015.

[11] 韓 笑,刀筱芳,張煥容,等.奶牛隱性乳房炎主要病原菌分離鑒定及耐藥性分析[J].動物醫(yī)學進展,2015,36(7):131-134.

[12] 郝景鋒,李靜姬,張宇航,等.吉林省奶牛乳房炎病原菌分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫(yī)學進展,2016,37(12):126-129.

[13] 趙建榮.奶牛環(huán)境性乳腺炎滅活疫苗的研制及效果評價[D].內蒙古呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學,2009.

[14] 唐吉思,吳金花,布日額,等.牛乳腺炎金黃色葡萄球菌腸毒素A基因的克隆及序列分析[J].中國動物傳染病學報,2011,19(3):38-42.

[15] Tian J,Zhang J,Yang J,et al.Conjugated polymers act synergistically with antibiotics to combat bacterial drug resistance[J].Acs Appl Mater Inter,2017,9(22):18512-18520.

[16] 張純萍,宋 立,吳辰斌,等.我國動物源細菌耐藥性監(jiān)測系統(tǒng)簡介[J].中國動物檢疫,2017,34(3):34-38.