王建東，馬吉鋒，侯鵬霞，于 洋，梁小軍

(寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002)

高齡蛋雞由于法氏囊和胸腺等主要免疫器官退化，機(jī)能逐漸衰退[1-2]，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降。枸杞多糖(Lyciumbarbarumpolysaccharides,LBP)是中藥枸杞的主要免疫活性成分，無論是對(duì)正常動(dòng)物還是對(duì)免疫功能低下動(dòng)物，LBP均能有效提高其細(xì)胞免疫和體液免疫功能[3]。枸杞多糖主要作用于T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cell，CTL)、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)及腹腔巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和免疫監(jiān)視系統(tǒng)的功能，其主要作用是誘生免疫球蛋白和細(xì)胞因子[4]。本文主要是探索自制枸杞多糖免疫增效劑在提高高齡蛋雞免疫機(jī)能方面的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 免疫增效劑 自制蛋雞枸杞多糖免疫增效劑，劑型為單一成分散劑，枸杞多糖用量為每日0.2 g/只，其他成分為擴(kuò)容劑。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 選擇體況、品種相同的高齡蛋雞20只，每天飼喂同樣的全價(jià)粉狀飼料120 g，自制免疫增效劑用少許的粉狀飼料擴(kuò)容。一次拌好7 d的量放置陰涼處，每天定時(shí)定量飼喂含有自制蛋雞枸杞多糖免疫增效劑的飼料，試驗(yàn)周期為7 d。分別在試驗(yàn)第0、7、14天各采血1次，將0 d作為對(duì)照組，14 d、7 d和0 d進(jìn)行對(duì)照。

1.1.3 主要試劑 蛋雞免疫球蛋白G(IgG) (批號(hào)：20160820)、免疫球蛋白M(IgM) (批號(hào)：20160820)、免疫球蛋白A(IgA)(批號(hào)：20160820)、白細(xì)胞介素2(IL-2)(批號(hào)：20160822)、白細(xì)胞介素13(IL-13)(批號(hào)：20160822)、白細(xì)胞介素9(IL-9)(批號(hào)：20160812)、白細(xì)胞介素17(IL-17)(批號(hào)：20160825)、γ干擾素(IFN-γ)(批號(hào)：20160820)、腫瘤壞死因子β(TNF-β)(批號(hào)：20160814)等9項(xiàng)指標(biāo)的定量檢測(cè)卡，R&D公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀(SM-3)，北京天石天力公司產(chǎn)品；自動(dòng)洗板機(jī)(ST360W)，上海科華公司產(chǎn)品；電熱恒溫器(HH-W21-600)，天津泰斯特有限公司產(chǎn)品；離心機(jī)(TDL80-2B)，上海安亭科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)雞處理方法 試驗(yàn)雞未進(jìn)行分組，采用0、7、14 d進(jìn)行組內(nèi)比較。

1.2.2 血樣采集 各組翅下靜脈采血0.5 mL，室溫放置1 h，將血液凝固與管壁剝離，使血清充分析出，然后于2 000 r/min離心10 min，收集血清。

1.2.3 采血時(shí)間 每天飼喂同樣的飼料，同時(shí)每天定時(shí)定量飼喂自制蛋雞枸杞多糖免疫增效劑，試驗(yàn)周期7 d。分別在試驗(yàn)0、7、14 d各采血1次。

1.2.4 外周血液各種免疫因子含量的檢測(cè) 采用雞免疫球蛋白IgG、IgM、IgA和細(xì)胞因子IL-2、IL-13、IL-9、IL-17、IFN-γ、TNF-β酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，其含量測(cè)定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果應(yīng)用Excel和Spss13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異性分析。

2 結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果見表1和表2。通過檢測(cè)免疫球蛋白IgG、IgM、IgA和細(xì)胞因子IL-2、IL-13、IL-9、IL-17、IFN-γ、TNF-β等9個(gè)指標(biāo)，從其產(chǎn)生的消長(zhǎng)規(guī)律全面了解枸杞多糖免疫增效劑對(duì)提高高齡蛋雞機(jī)體免疫水平效果。

從表1可以看出，高齡蛋雞連續(xù)飼喂枸杞多糖免疫增效劑7 d，血清IgA、IgM、 IgG含量都升高，第14天時(shí)IgA、IgM、 IgG含量繼續(xù)升高，且第7、14天含量極顯著高于0 d (P<0.01)。結(jié)果表明，飼喂枸杞多糖免疫增效劑7 d后，機(jī)體免疫球蛋白的水平均大幅高于0 d。

表1 枸杞多糖免疫增效劑對(duì)高齡蛋雞免疫球蛋白含量的影響

注：同列角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters mean no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

表2 枸杞多糖免疫增效劑對(duì)蛋雞細(xì)胞因子含量的影響

注：同列角標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note：Values with same letters mean no significant difference in the same column(P>0.05),and with different small letters mean significant difference(P<0.05),and with different capital letters mean extremely significant difference(P<0.01).

從表2可以看出,飼喂枸杞多糖免疫增效劑7 d時(shí)，IL-2、IL-13、IL-17、IL-19含量都升高,到第14天時(shí)含量開始下降,低于第7天、高于0 d。統(tǒng)計(jì)分析飼喂7 d時(shí)，均極顯著高于0 d(P<0.01)；飼喂枸杞多糖免疫增效劑14 d時(shí)，IL-17含量極顯著高于0 d(P<0.01),IL-2、IL-13、IL-19含量與0 d差異不顯著(P>0.05),但均高于0 d。

TNF-β、INF-γ飼喂枸杞多糖免疫增效劑7 d時(shí)，含量都升高,到第14天時(shí)含量開始下降,低于第7天、高于0 d。統(tǒng)計(jì)分析飼喂7 d時(shí)，TNF-β在飼喂7 d、14 d TNF-β含量極顯著高于0 d(P<0.01) ，表明飼喂枸杞多糖免疫增效劑7 d后，機(jī)體腫瘤壞死因子的水平均大幅高于飼喂前。INF-γ在飼喂枸杞多糖免疫增效劑7 d時(shí)，含量極顯著高于0 d(P<0.01), 飼喂枸杞多糖免疫增效劑14 d，INF-γ含量與0 d差異不顯著(P>0.05)，但含量高于0 d。表明飼喂枸杞多糖免疫增效劑7 d后，機(jī)體γ干擾素的水平均高于飼喂前。由此可以看出，飼喂7 d后，高齡蛋雞機(jī)體各種免疫因子均高于飼喂前。

3 討論

3.1 中草藥對(duì)蛋雞及高齡蛋雞免疫力影響

免疫器官是動(dòng)物實(shí)現(xiàn)免疫的重要場(chǎng)所，高齡蛋雞免疫器官開始退化。在此期間，有研究表明,添加一定量的多糖或者維生素都能提高部分免疫指數(shù)，張玉等[5]研究表明，葡萄原花青素能提高產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能和抗氧化能力，李曉麗等[6]研究表明，甘草提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能及蛋品質(zhì)都有所提高，王建東等[7]研究表明，中草藥中的有機(jī)酸能調(diào)節(jié)胃腸道pH，防止有害菌的繁殖,能提高酶的活性，加快雞體內(nèi)蛋白質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化，提高蛋雞的生產(chǎn)性能。

3.2 枸杞多糖對(duì)高齡蛋雞體液免疫功能的影響

產(chǎn)蛋后期蛋雞外周血中免疫球蛋白含量的高低能反映該時(shí)期的免疫力，免疫球蛋白可以間接反映動(dòng)物機(jī)體的體液免疫功能。本試驗(yàn)通過檢測(cè)外周血中IgG、IgA、IgM含量的變化，從而反映該時(shí)期蛋雞機(jī)體免疫狀態(tài)[8]。有研究表明，中草藥配方能有效提高產(chǎn)蛋后期蛋雞免疫力，促進(jìn)腸道有益微生物的增殖，試驗(yàn)組IgG、IgM、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和IL-2均顯著升高[9]。連續(xù)飼喂7 d枸杞多糖免疫增效劑，IgA、IgM、 IgG含量呈上升的趨勢(shì)，且第7、14天含量極顯著高于0 d (P<0.01)。表明飼喂7 d后，機(jī)體免疫球蛋白的水平均大幅高于飼喂前，說明飼喂7 d，即可提高雞機(jī)體免疫力。蛋雞在產(chǎn)蛋后期階段免疫下降，表現(xiàn)為免疫球蛋白的減少，這些變化可能是導(dǎo)致產(chǎn)蛋后期蛋雞發(fā)病率較高的原因之一。本試驗(yàn)結(jié)果說明在產(chǎn)蛋后期蛋雞飼喂枸杞多糖，均可提高蛋雞外周血中免疫球蛋白含量。

3.3 枸杞多糖對(duì)高齡蛋雞細(xì)胞免疫功能的影響

細(xì)胞因子可分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等，可以間接反映動(dòng)物細(xì)胞免疫功能，產(chǎn)蛋后期蛋雞外周血中細(xì)胞因子含量的高低能反映該時(shí)期的免疫力。通過本試驗(yàn)檢測(cè)外周血中IL-2、IL-13、IL-9、IL-17、IFN-γ、TNF-β含量的變化，從而反映該時(shí)期蛋雞機(jī)體免疫狀態(tài)，在飼喂7 d時(shí)，IL-2、IL-13、IL-17、IL-19含量均極顯著高于0 d(P<0.01)，飼喂14 d時(shí)，IL-17含量極顯著高于0 d(P<0.01),IL-2、IL-13、IL-19含量與0 d差異不顯著(P>0.05),但均高于0 d。說明飼喂7 d即可提高雞細(xì)胞免疫力。

TNF-β在飼喂7 d和14 d時(shí)，含量極顯著高于0 d(P<0.01) ，表明飼喂7 d后，機(jī)體腫瘤壞死因子的水平均大幅高于飼喂前。INF-γ在飼喂7 d時(shí)含量極顯著高于0 d(P<0.01), 飼喂14 d，INF-γ含量與0 d差異不顯著(P>0.05)，但含量高于0 d。表明飼喂7 d后，機(jī)體INF-γ的水平均大幅高于飼喂前，說明飼喂7 d，即可提高雞機(jī)體免疫力。枸杞多

糖能在體內(nèi)或體外通過提高細(xì)胞因子的分泌量或其基因表達(dá)或增強(qiáng)細(xì)胞因子的作用而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。據(jù)報(bào)道，通過一定量的枸杞多糖能使淋巴細(xì)胞INF-γ mRNA的表達(dá)水平明顯升高；枸杞多糖能促進(jìn)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和TNF-α，并呈現(xiàn)濃度依賴性[10]。

參考文獻(xiàn):

[1] 王 棚.牛蛙皮膚抗菌肽Catesbeianin-1在PichiaPink中表達(dá)條件的優(yōu)化及其粗提物對(duì)產(chǎn)蛋后期雞的影響[D].吉林長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2016.

[2] 裴躍明,邵 強(qiáng),吳桂龍,等.枯草芽孢桿菌制劑對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、免疫及腸道菌群的影響[J].中國(guó)畜牧雜志,2016,52(7):61-65，70.

[3] Kevin K P,Joseph W L,Jackie N C,et al.Protective effect ofLyciumbarbarumpolysaccharides on dextromethorphan-induced mood impairment and neurogenesis suppression[J].Brain Res Bull,2017,134(9):10-17.

[4] 劉英娟,杜金梁,賈 睿,等．枸杞多糖對(duì)四氯化碳致建鯉急性肝損傷的保護(hù)作用[J]．浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，27(1):37-43．

[5] 張 玉,武書庚,王 晶,等．葡萄原花青素對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能和抗氧化能力的影響[J]．動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2016，28(4):1129-1136.

[6] 李曉麗,何萬領(lǐng),張 才,等．甘草提取物對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞生產(chǎn)性能及蛋品質(zhì)的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,35(8):1361-1364.

[7] 王建東，馬吉鋒，李艷艷，等.枸杞多糖對(duì)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2014(15):66-68.

[8] 孫曉雨,崔子寅,張明亮，等.枸杞多糖和茯苓多糖對(duì)免疫抑制小鼠免疫增強(qiáng)及對(duì)腸道黏膜的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015(35):450-453.

[9] 曹滿湖，莫迎春，龍虹錦，等.中草藥劑型對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞免疫力的影響[J].湖南飼料,2016(3)：35-38.

[10] Zhu X,Hu S,Zhu L,et al.Effects ofLyciumbarbarumpolysaccharides on oxidative stress in hyperlipidemic mice following chronic composite psychological stress intervention[J].Mol Med Rep,2015,11(5):3445-3450.