藏豬和長白豬對口蹄疫疫苗免疫應(yīng)答特性的比較

盧建均 ，楊霄 *，萬小平 *，呂學(xué)斌 ，王澤洲 ，高榮 **

（1.生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川省動物疫病預(yù)防與食品安全重點實驗室，四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064；2.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066；3.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

目前國內(nèi)外關(guān)于藏豬免疫遺傳特性的系統(tǒng)研究并不多見，本試驗用豬口蹄疫O型滅活苗免疫藏豬和長白豬，采集不同時期的前腔靜脈血，通過檢測免疫細(xì)胞數(shù)量變化、豬口蹄疫O型病毒特異性抗體水平以及免疫應(yīng)答相關(guān)基因表達的變化情況，深入了解免疫后藏豬和長白豬免疫應(yīng)答特性的差異。

1 材料與方法

1.1 試劑 豬口蹄疫O型滅活苗（OZK，93+OS，99株），改良型RPMI1640淋巴細(xì)胞分離液：比重為1.113±0.002，豬口蹄疫O型病毒ELISA特異性抗體檢測試劑盒，熒光定量PCR試劑So-fast evagreen supermix。

1.2 試驗豬 隨機選取8日齡、體重均約2kg的健康藏豬和長白豬各5頭，分別設(shè)為藏豬試驗組和長白豬試驗組，兩組豬均肌肉注射2頭份豬口蹄疫O型滅活苗（試驗前進行了常見病原和抗體檢測，結(jié)果均為陰性）。在免疫疫苗前（記為第0d）和免疫后6、8、12周和16周分別采集豬前腔靜脈血于抗凝管中，用于血液免疫細(xì)胞計數(shù)，并對抗豬口蹄疫O型病毒特異性抗體、免疫基因表達水平進行分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 血液免疫細(xì)胞計數(shù) 按期在無菌狀態(tài)下采集藏豬和長白豬的新鮮前腔靜脈抗凝血1mL，用血細(xì)胞自動計數(shù)儀進行血常規(guī)檢測。

1.3.2 分離血清 取新鮮的前腔靜脈抗凝血1 mL，5 000 r/min室溫下離心5 min，收集上層淡黃色血漿，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 參照豬淋巴細(xì)胞分離液使用說明，從新鮮采集的前腔靜脈抗凝血中分離免疫細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液（含青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL和10%胎牛血清）懸浮。將細(xì)胞懸液稀釋至5×106/mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)板上，在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。

1.3.4 間接ELISA法檢測血清中的特異性抗體 參照試劑盒說明書進行。

1.3.5 淋巴細(xì)胞總RNA提取和cDNA制備 取培養(yǎng)48h的藏豬和長白豬淋巴細(xì)胞，1500r/min離心5min，收集細(xì)胞，加入Trizol試劑裂解細(xì)胞。參照Trizol試劑使用說明書提取總RNA，并按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶操作指南，以O(shè)ligo（dT）和隨機引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3.6 熒光定量引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中報道的豬 β-actin、TRL4、TLR7、TLR9、CCR7、CD62L、CD4、IL-6、IL-10基因的cDNA序列，設(shè)計合成了9對擴增引物（表1）。

1.3.7 熒光定量PCR 免疫相關(guān)基因的定量PCR表達分析用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行。以藏豬和長白豬不同時期的淋巴細(xì)胞cDNA為模板，用上述引物擴增。定量PCR擴增參數(shù)為：95℃30s，95℃ 2s，60℃ 2s，共45個循環(huán)。溶解曲線參數(shù)為：65～95℃，每5s上升0.5℃。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用ΔCt法分析實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)，比較同一目的基因不同時期的相對表達水平。

表1 定量PCR擴增引物

2 結(jié)果

2.1 血液中免疫細(xì)胞數(shù)量的變化 對抗凝血常規(guī)免疫細(xì)胞分析，結(jié)果顯示：免疫后6～12周，藏豬組的白細(xì)胞數(shù)量顯著高于長白豬組（P＜0.05）；免疫后6～16周，藏豬組的紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量明顯高于長白豬組，且呈上升趨勢（P＜0.05），而長白豬組的紅細(xì)胞數(shù)量無顯著變化（P＞0.05）。

2.2 血清特異性抗體含量的變化 用間接ELISA法檢測豬口蹄疫O型病毒特異性抗體水平，結(jié)果如圖1所示。

圖1 血清中豬口蹄疫O型病毒特異性抗體的變化情況

在藏豬免疫后6～16周，其特異性抗體水平明顯高于長白豬（P＜0.05）；第6周，血清中豬口蹄疫O型病毒的特異性抗體水平最高；之后8～16周，特異性抗體保持在一個相對穩(wěn)定的水平，但均明顯高于免疫前。

圖2 RT-PCR檢測不同時期免疫基因的表達情況

2.3 免疫應(yīng)答基因表達水平的變化 從圖2免疫相關(guān)基因表達水平的定量分析結(jié)果可以看出，藏豬與長白豬的8個基因的表達水平在免疫后均明顯增高（P＜0.05）。

藏豬 TLR4、CD4、CD62L 和 IL-10 基因在 6～16周期間均表現(xiàn)為先下降后上升再下降（P＜0.05）；CCR7基因的表達量在免疫后6～16周顯著降低；TLR7的表達量在免疫后6～8周降低，而在8～16周顯著升高，這與TLR9基因表達的變化趨勢正好相反（P＜0.05）。免疫后6～12周，藏豬IL-6基因的表達量顯著升高（P＜0.05），長白豬的TLR9和 IL-6在免疫后6～8周表達量升高，而在8～16周顯著降低（P＜0.05）。長白豬CCR7、CD4和CD62L基因的表達量在免疫后6～12周降低，而IL-10基因的表達量明顯上升（P＜0.05），TLR4基因在免疫后 6～16周表達量降低（P＜0.05），TLR7在免疫后的6～16周表達量無顯著變化。

免疫后 8～16周，藏豬的 TLR4、TLR9和IL-6基因表達水平顯著高于長白豬（P＜0.05），6～8 周低于長白豬。免疫后6～12周，藏豬的CCR7、CD4和CD62L基因表達水平顯著高于長白豬（P＜0.05）。免疫后8～16周，長白豬的IL-10基因表達水平顯著高于藏豬（P＜0.05）。而另一個特點是，免疫后除第8周，藏豬TLR7基因的表達水平均明顯高于長白豬（P＜0.05）。

3 結(jié)論與分析

3.1 從ELISA結(jié)果分析可知，在豬口蹄疫O型病毒疫苗刺激下藏豬更易從自身B淋巴細(xì)胞分泌特異性抗體，并迅速在體內(nèi)維持相對穩(wěn)定的抗體水平。藏豬在抗FMDV的體液免疫反應(yīng)方面明顯優(yōu)于長白豬。免疫后兩個試驗組豬的8種與免疫相關(guān)的mRNA含量均顯著高于免疫前水平，表明肌注FMDV滅活疫苗有效地誘發(fā)了兩組豬的抗FMDV免疫反應(yīng)。

3.2 Toll樣受體（TLR）是模式識別受體的一類，識別與宿主不同的病原體分子。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白，能夠識別侵入體內(nèi)的微生物進而激活免疫細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，被認(rèn)為在先天性免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用[1-2]。TLR4和TLR9能夠促進樹突狀細(xì)胞的成熟，被認(rèn)為在先天免疫和誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫中有重要作用[3-4]。免疫FMDV滅活疫苗后，兩個試驗組的TLR4和TLR9表達水平較免疫前明顯提高，說明兩組中的FMDV滅活疫苗均誘發(fā)了較強的免疫防御應(yīng)答。免疫后藏豬TLR7的表達明顯高于長白豬，表明藏豬較長白豬對O型FMDV有更好的固有識別能力。此外，藏豬免疫FMDV滅活疫苗后，白細(xì)胞水平也顯著高于長白豬。以上結(jié)果均說明藏豬的先天免疫應(yīng)答能力如免疫識別等優(yōu)于長白豬。

3.3 CD4作為輔助性T細(xì)胞表面特異性抗原，它識別MHCⅡ分子，激活下游細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和分泌，調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答[5]。CCR7是一種趨化因子，確保淋巴細(xì)胞到達外周淋巴組織的正確位置。CD62L（L-選擇素）是一種淋巴細(xì)胞歸巢受體，參與淋巴細(xì)胞向外周淋巴組織遷移的粘附作用。它們共表達決定了淋巴細(xì)胞向外周淋巴組織遷移的能力[6]。此外，有研究表明CD4、CCR7和CD62還與機體的免疫記憶有關(guān)[7]。免疫后6～12周，藏豬CD4、CCR7和CD62L基因的表達水平顯著高于長白豬，提示免疫后期藏豬的免疫調(diào)節(jié)增強效應(yīng)和免疫記憶能力都優(yōu)于長白豬。

3.4 IL-6是主要由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及纖維細(xì)胞等合成的多肽，在B細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)和CD4 Th細(xì)胞分化中有重要作用。在正常生理狀態(tài)下，甲狀腺上皮細(xì)胞（TEC）僅產(chǎn)生少量IL-6，但在病理情況下，IL-6的表達會異常升高。IL-10是一類重要的抗炎免疫調(diào)節(jié)因子，它能夠抑制促炎因子如IFN-γ、IL-2、IL-3、TNF-α和GM-CSF的產(chǎn)生，負(fù)反饋調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[8]。在免疫后8～16周，長白豬IL-10的表達水平明顯高于藏豬（P＜0.05）。長白豬IL-10高表達引起的免疫應(yīng)答負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，可能是導(dǎo)致其體液免疫水平及免疫細(xì)胞數(shù)量低于藏豬的原因。

本研究初步表明：藏豬對FMDV滅活疫苗的先天免疫、體液免疫、細(xì)胞免疫、免疫記憶、免疫調(diào)節(jié)等各項指標(biāo)均優(yōu)于長白豬。因此，藏豬對FMDV感染的抵抗能力要強于長白豬。

參考文獻：

[1]Akira S，Takeda K，Kaisho T.Toll-like receptors：critical proteins linking innate and acquired immunity[J].Nat Immunol，2001，2（8）：675-680.

[2]Imler J L，Hoffmann J A.Toll receptors in innate immunity[J].Trends Cell Biol，2001，11（7）：304-311.

[3]Kawai T，Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity：update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol，2010，11（5）：373-384.

[4]Kawai T，Akira S.Toll-like receptors and their crosstalk with otherinnate receptors in infection and immunity[J].Immunity，2011，34（5）：637-650.

[5]Yu Yongmao，Rabinowitz R，Michael S，et al.Correlation between the expression of CD4 and the level of CD4 mRNA in human B-cell lines[J].Cell Immunol，2002，215（1）：78-86.

[6]Totte P，Duperray C，Dedieu L.CD62L defines a subset of pathogen-specific bovine CD4 with central memory cell characteristics[J].Dev and Comp Immunol，2010，34（2）：177-182.

[7]Unsoeld H，Pircher H.Complex memory T-cell phenotypes revealed by coexpression of CD62L and CCR7[J].J Virol，2005，79（7）：4510-4513.

[8]Mocellin S，Panelli Mc，Wang E，et al.The dual role of IL-10[J].Trends Immunol，2003，24（1）：36-43.