多壁碳納米管固相萃取/氣相色譜質(zhì)譜測(cè)定蔬菜中的苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留

張彥軍,洪 霞,周鑫魁,柴宗龍,王杰斌,袁彩霞,賈亞莉,錢瀅文,*

(1.甘肅省商業(yè)科技研究所有限公司,甘肅蘭州 730010; 2.甘肅中商食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)有限公司,甘肅蘭州 730010)

苯醚甲環(huán)唑又名惡醚唑,是一種三唑類殺真菌劑,在三唑類殺菌劑中占有極重要的地位,已經(jīng)成為蔬菜種植中使用最廣泛的殺菌劑之一。其內(nèi)吸性強(qiáng),殺菌譜廣,通過抑制麥角甾醇(構(gòu)成細(xì)胞膜的重要成分,對(duì)細(xì)胞膜的滲透性起重要作用)的生物合成,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能,從而達(dá)到殺菌目的,對(duì)蔬菜多種真菌性病害具有很好的保護(hù)和治療作用[1-2]。苯醚甲環(huán)唑殘留于蔬菜中通過食用進(jìn)入人體,累積后可能會(huì)危害人體健康。Li等[3]用熒光光譜法測(cè)定了苯醚甲環(huán)唑與人血清白蛋白的結(jié)合作用,結(jié)果表明在37 ℃條件下苯醚甲環(huán)唑與人血清白蛋白結(jié)合率高,造成血液中苯醚甲環(huán)唑濃度增大,導(dǎo)致血液中毒。劉永霞等[4]對(duì)80只大鼠分組連續(xù)90 d每天經(jīng)口灌胃染毒苯醚甲環(huán)唑后,動(dòng)物體重降低,肝及腎組織增大。Mu等[5]將斑馬魚胚胎暴露于苯醚甲環(huán)唑水溶液中,研究了苯醚甲環(huán)唑?qū)Π唏R魚胚胎發(fā)育的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,苯醚甲環(huán)唑在斑馬魚胚胎的發(fā)育過程中引起了心率下降、自主運(yùn)動(dòng)異常、生長(zhǎng)抑制以及多種致畸作用等一系列的不良影響。因此,建立簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、可靠測(cè)定蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留量的檢測(cè)方法,對(duì)于保護(hù)食用者健康具有重要的意義。目前蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留量的檢測(cè)方法有氣相色譜(GC)[6],氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[7-8]和液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[9-10]等。毛久浪等[11]采用氣相色譜電子捕獲器檢測(cè)(GC-ECD)毛豆樣品中苯醚甲環(huán)唑的殘留,結(jié)果證明苯醚甲環(huán)唑主要?dú)埩粼诿骨v中,去莢可降低毛豆仁苯醚甲環(huán)唑殘留的風(fēng)險(xiǎn)。王遠(yuǎn)等[12]建立HPLC-MS檢測(cè)蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留的分析方法,結(jié)果顯示苯醚甲環(huán)唑質(zhì)量濃度在0.001～0.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,檢出限為 0.001 mg/kg。薄海波[13]建立GC-MS法測(cè)定水果和蔬菜中苯醚甲環(huán)唑殘留的分析方法,檢出限為0.005 mg/kg,方法靈敏度高,選擇性好,抗干擾能力強(qiáng),適合苯醚甲環(huán)唑殘留量的定性確證分析和定量分析。

多壁碳納米管(MWCNTs)作為一種新型前處理凈化吸附材料,具有機(jī)械強(qiáng)度高、表面積大、吸附能力強(qiáng)、耐熱性好和pH適用范圍寬等特點(diǎn),可有效去除色素和疏水性物質(zhì)[14],適用于固相萃取[15]、固相微萃取[16]和分散性固相萃取[17]等技術(shù),應(yīng)用于水質(zhì)[18]、環(huán)境污染物[19]、農(nóng)藥殘留[20]和獸藥殘留[21]等的檢測(cè)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蔬菜中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的檢測(cè)研究主要集中在氧化鋁[7]、石墨化碳黑[22]和硅酸鎂[23]等方面,對(duì)MWCNTs應(yīng)用于蔬菜中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留檢測(cè)的報(bào)道較少。因此,本文研究了MWCNTs固相萃取柱對(duì)蔬菜基質(zhì)的凈化效果,以期建立GC-MS法檢測(cè)了蔬菜中的苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的方法,以達(dá)到簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水硫酸鎂 分析純,使用前650 ℃下灼燒4 h,備用,天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司;乙酸乙酯 色譜純,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;二氯甲烷 色譜純,山東禹王實(shí)業(yè)有限公司化工分公司;乙腈 色譜純,北京百靈威科技有限公司;丙酮 色譜純,西隴科技股份有限公司;多壁碳納米管(MWCNTs) 直徑20～40 nm,長(zhǎng)度:1～2 μm,純度:≥95%,深圳納米港有限公司;氦氣 純度:99.999%,中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所;丙酮中苯醚甲環(huán)唑溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)081913) 濃度為100 μg/mL,北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)有限責(zé)任公司;芹菜、番茄、黃瓜、花椰菜、金針菇、韭菜、菠菜、大白菜、茄子和結(jié)球甘藍(lán)等樣品 每種10個(gè)共80批次,隨機(jī)購(gòu)于市場(chǎng)及超市。

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司;KS260控制型圓周振蕩搖床 艾卡儀器設(shè)備有限公司;RJ-TDL-60B離心機(jī) 無錫市瑞江分析儀器有限公司;JJ500電子天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠;固相萃取空管柱 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的提取與凈化 稱取5.00 g蔬菜可食部分粉碎后的樣品于50 mL帶蓋的聚丙烯離心管中,準(zhǔn)確加入10 mL乙酸乙酯溶液,再加入適量無水硫酸鎂,振蕩30 min,于3000 r/min離心1 min,用注射器吸取1.0 mL乙酸乙酯上清液待凈化。將10 mg MWCNTs和150 mg無水硫酸鎂用研缽研細(xì),填入固相萃取空管柱。將吸有1.0 mL乙酸乙酯上清液的注射器與MWCNTs凈化柱連接,向下推至進(jìn)樣瓶,然后向上吸至注射器,再向下推收集于進(jìn)樣瓶,供GC-MS分析。

1.2.2 萃取條件的優(yōu)化

1.2.2.1 萃取溶劑的選擇 以黃瓜和結(jié)球甘藍(lán)為基質(zhì)添加0.1 μg/mL苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液按照1.2.1步驟處理,考察乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷等不同萃取溶劑對(duì)樣品中苯醚甲環(huán)唑回收率的影響。

1.2.2.2 MWCNTs量的優(yōu)化 MWCNTs的用量影響凈化效果和回收率,為了獲得最佳的凈化效果及回收率,按1.2.1過程在黃瓜和樣結(jié)球甘藍(lán)品中添加濃度為0.1 μg/mL苯醚甲環(huán)唑,分別以5、8、10、12以及15 mg MWCNTs和150 mg無水硫酸鎂填充固相萃取柱,觀察不同用量MWCNTs對(duì)乙酸乙酯提取液的凈化效果和比較不同用量MWCNTs對(duì)回收率的影響。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確移取1 mL 100 μg/mL的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品溶液至10 mL容量瓶中,用丙酮定容,配成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,吸取以上標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,并用丙酮稀釋至質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 氣相色譜條件 DB-5MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度260 ℃;升溫程序:初始溫度70 ℃保持5 min,以25 ℃/min升至150 ℃;以3 ℃/min升至200 ℃,再以8 ℃/min升至280 ℃,保持10 min;進(jìn)樣量1.0 μL,不分流進(jìn)樣。

1.2.5 質(zhì)譜條件 EI電離源,電離電壓70 eV;離子源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;傳輸線溫度280 ℃;溶劑延遲:5 min;選擇監(jiān)測(cè)離子:定量離子m/z 323;定性離子m/z 325,325,265,267。

1.2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 采用對(duì)陰性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度和精密度,即對(duì)本底不含苯醚甲環(huán)唑的黃瓜、結(jié)球甘藍(lán)、番茄和韭菜樣品,分別添加相當(dāng)于0.01、0.10和1.00 μg/mL的苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液,每個(gè)添加水平做5個(gè)平行樣,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次,計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 實(shí)樣分析 利用本方法按1.2.1樣品處理步驟對(duì)芹菜、番茄、黃瓜、花椰菜、金針菇、韭菜、菠菜、大白菜、茄子和結(jié)球甘藍(lán)等10種80個(gè)代表性蔬菜樣品進(jìn)行定性定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

萃取溶劑的選擇、加標(biāo)回收率和實(shí)樣分析數(shù)據(jù)均采用Excel軟件進(jìn)行計(jì)算分析,MWCNTs量的優(yōu)化和線性范圍采用Origin8.5軟件進(jìn)行計(jì)算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取溶劑的選擇

對(duì)乙酸乙酯、乙腈和二氯甲烷提取苯醚甲環(huán)唑5平行效果進(jìn)行了比較。由表1可知,回收率在97.3%～99.5%之間,說明以上3種有機(jī)溶劑對(duì)苯醚甲環(huán)唑的提取具有良好的效率。對(duì)于含色素較高結(jié)球甘藍(lán)樣品經(jīng)二氯甲烷溶劑提取后,在苯醚甲環(huán)唑出峰位置處或附近有干擾現(xiàn)象。而經(jīng)乙酸乙酯提取樣品選擇性好,干擾少,且乙腈和二氯甲烷溶劑毒性較強(qiáng),因此本研究選擇乙酸乙酯溶劑作為提取溶劑。

表1 蔬菜中苯醚甲環(huán)唑在0.1 μg/kg添加水平下的平均回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 Average recoveries and the RSD of difenoconazole at 0.1 μg/mL spiked in vegetables(n=5)

2.2 MWCNTs量的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨MWCNTs用量增加，乙酸乙酯提取液的顏色逐漸變淺,幾乎接近于純乙酸乙酯顏色,說明MWCNTs對(duì)于提取液中干擾物具有良好的吸附性,且隨碳納米管量的增加凈化效果越好。

由圖1可知,在結(jié)球甘藍(lán)和黃瓜基質(zhì)中苯醚甲環(huán)唑回收率分別為73.5%～96.4%和75.7%～97.9%,呈先增大后降低的趨勢(shì),當(dāng)MWCNTs的量達(dá)到10 mg時(shí)回收率最高。綜合凈化效果和回收率,本研究選擇10 mg MWCNTs的量填充固相萃取柱凈化提取液。

圖1 不同MWCNTs米管用量對(duì)方法回收率的影響Fig.1 Effects of amount of MWCNTs on method recoveries

2.3 線性范圍和檢出限

取1.2.3配制的苯醚甲環(huán)唑系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定,苯醚甲環(huán)唑的保留時(shí)間為9.752 min,苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖和掃描質(zhì)譜圖,分別見圖2和圖3。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)(如圖4所示),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=157086X+922,相關(guān)系數(shù)r=0.9997,在0.005～2.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,以3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限為0.001 mg/kg,以10倍信噪比(S/N=10)定量限為0.003 mg/kg,滿足殘留定量分析要求。

圖2 苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 μg/mL)的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of difenoconazole standard solution(0.1 μg/mL)

圖3 苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1 μg/mL)的掃描質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of difenoconazole standard solution(0.1 μg/mL)

圖4 苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of the difenoconazole

2.4 回收率和精密度

由表2可知,3個(gè)添加水平的回收率在84.2%～111.3%的范圍內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差介于5.3%～11.9%之間,表明此方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。因此,實(shí)驗(yàn)中開發(fā)的方法滿足苯醚甲環(huán)唑殘留分析的要求,可用于黃瓜、結(jié)球甘藍(lán)、番茄和韭菜等樣品中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。

表2 蔬菜中苯醚甲環(huán)唑在3個(gè)添加水平下的平均回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Average recoveries and the RSD of difenoconazole at three spiked levels in vegetables(n=5)

2.5 實(shí)樣分析

由表3可知,其中番茄、黃瓜和結(jié)球甘藍(lán)等5個(gè)樣品檢出苯醚甲環(huán)唑殘留,其余樣品均未檢出苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留,對(duì)檢出樣品5平行檢測(cè),苯醚甲環(huán)唑含量在0.0407～0.4699 mg/kg之間。根據(jù)GB2763-2016[24]檢出樣品均未超過國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 實(shí)樣檢測(cè)結(jié)果Table 3 Sample test results

3 結(jié)論

建立了以MWCNTs作為固相萃取柱吸附劑,應(yīng)用于蔬菜樣品前處理中,聯(lián)合GC-MS檢測(cè)蔬菜中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留量的方法,方法的線性范圍為0.005～2.0 μg/mL,相關(guān)系數(shù)為0.9997,檢出限和定量限分別為0.001和0.003 mg/kg,樣品加標(biāo)回收率為84.2%～111.3%,應(yīng)用于實(shí)樣檢測(cè),檢出苯醚甲環(huán)唑殘留樣品的RSD介于3.3%～9.9%之間。該方法具有操作步驟簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間、溶劑消耗量少、凈化效果好和檢出限低等優(yōu)點(diǎn),能夠滿足蔬菜中苯醚甲環(huán)唑農(nóng)藥殘留的檢測(cè)要求。

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