覃文婷，王小明，徐榮，宿美鳳，雒曉梅，常曉燕，陳君，石鉞*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 藥用植物研究所，北京 100193)

荒漠肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma為列當(dāng)科多年寄生植物，具有補腎壯陽、潤腸通便、延緩衰老、消除疲勞、提高免疫力、保肝護肝等功能，被載入《中華本草》《中華人民共和國藥典》等醫(yī)藥名錄?；哪馍惾卦趦?nèi)蒙古、新疆、寧夏等地均有分布，其主要有效成分為苯乙醇苷類和多糖類成分。近代藥理研究表明，苯乙醇苷類與多糖均為天然抗氧化劑，在體內(nèi)外均有明顯的抗氧化作用，可清除超氧自由基、羥自由基等多種自由基，顯著提高衰老小鼠血清和肺中的超氧化物歧化酶(SOD)活性，脂質(zhì)過氧化物(LPO)、一氧化氮濃度等明顯降低[1-5]。已有文獻(xiàn)中對苯乙醇苷類成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)、藥理活性研究較多，而荒漠肉蓯蓉多糖的含量檢測、抗氧化活性的研究較少，現(xiàn)制備荒漠肉蓯蓉總苷、醇提物及多糖，測定其有效成分含量，同時采用體外清除DPPH自由基考察三者抗氧化活性，提高肉蓯蓉活性成分的利用率，為荒漠肉蓯蓉中苯乙醇苷化合物和多糖的藥理、生物活性研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

全波長多功能酶標(biāo)儀(infinite M1000 Pro，瑞士Tecan)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-250DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLER-AB135十萬分之一電子分析天平(METTER-TOLEDO，Switzerland)。

1.2 試藥

荒漠肉蓯蓉(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所銷售部)經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所徐榮副研究員鑒定為荒漠肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖；葡萄糖(純度：99.5%，批號：SLBR0495V，SIGMA)；DPPH(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：PRPDE-JO)；屈臣氏蒸餾水(杭州哇哈哈屈臣氏有限公司)；乙腈(色譜純，Honeywell Burdick & Jackson，USA)；甲酸(色譜純，Dikma Technologies Inc.，Beijing)；其余試劑均為分析純。

Trolox(奎諾二甲基丙烯酸酯，純度：98.0%；批號：RQ17L1107，上海瑞永生物科技有限公司)；松果菊苷(成都曼思特生物科技有限公司，純度：98.88%，批號：MUST-17030701)；2’-乙酰毛蕊花糖苷(成都曼思特生物科技有限公司，純度：99.28%，批號：MUST-17031504)；管花苷A(成都曼思特生物科技有限公司，純度：98.57%，批號：MUST-16080111)；毛蕊花糖苷(成都曼思特生物科技有限公司，純度：99.57%，批號：MUST-17020715)；異毛蕊花糖苷(成都曼思特生物科技有限公司，純度：99.77%，批號：MUST-17041816)。

2 方法與結(jié)果

2.1 荒漠肉蓯蓉苯乙醇苷類成分及多糖的制備

取適度粉碎的荒漠肉蓯蓉置于圓底燒瓶，用70%乙醇回流提取2次，每次2 h，過濾，合并收集70%乙醇回流液，濃縮真空干燥，得到醇提物浸膏；藥渣揮干至無醇味，以水提醇沉法得到荒漠肉蓯蓉粗多糖；上述醇提物浸膏過AB-8大孔樹脂進(jìn)行純化，先用水去除雜質(zhì)，再用50%乙醇洗脫，直至無色，收集洗脫液，濃縮蒸干，得到荒漠肉蓯蓉總苷。

2.2 荒漠肉蓯蓉總苷、醇提物中5種苯乙醇苷類成分含量的測定

2.2.1 UPLC色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC?BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)；流速:0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃；波長：330 nm；梯度洗脫條件：0～8 min，2%A；8～16 min，12%A；16～19 min，16%A；19～22 min，16%A～22%A；22～25 min，22%A；25～30 min，22%A～25%A；30～32 min，25%A；32～35 min，25%A～30%A；35～38 min，30%A～40%A；38～40 min，40%A～50%A。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密稱取松果菊苷1.69 mg、毛蕊花糖苷0.70 mg、管花苷A 1.06 mg、異毛蕊花糖苷0.99 mg、2’-乙酰毛蕊花糖苷0.85 mg，分別用2 mL甲醇溶解，依次稀釋到適當(dāng)濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 5種苯乙醇苷類成分標(biāo)準(zhǔn)曲線

注：A.對照品；B.總苷、醇提物；按出峰時間順序峰1～5分別為松果菊苷、毛蕊花糖苷、管花苷A、異毛蕊花糖苷、2’-乙酰毛蕊花糖苷。圖1 對照品、總苷、醇提物UPLC圖

2.2.3 方法學(xué)考察 精密度試驗：按照2.2.1項色譜條件，總苷樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，計算結(jié)果顯示，5種苯乙醇苷類成分峰面積RSD均小于3.0%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：在上述色譜條件下，總苷樣品溶液分別在0、4、8、16、24 h進(jìn)樣，測得5種苯乙醇苷類成分含量在24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD均小于3.0%(n=5)。

重復(fù)性試驗：精密稱取總苷樣品10.0 mg，2 mL蒸餾水溶解，在上述色譜條件下進(jìn)樣，5種苯乙醇苷類成分峰面積RSD均小于3.0%(n=5)，表明該方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗：以總苷樣品進(jìn)行加樣回收試驗，以樣品已知含量的80%、100%、120%等比例加入各對照品適量，平行測定3份，考察結(jié)果見表2。

2.2.4 各樣品5種苯乙醇苷類成分含量的測定 稱取2.1項下制得醇提物與總苷樣品，配制成質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的供試品溶液，測定其中5種苯乙醇苷含量[6-8]，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=3)

表3 樣品含量測定結(jié)果 μg

2.3 多糖含量的測定

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葡萄糖適量，蒸餾水溶解，配制成質(zhì)量濃度為80 μg·mL-1的葡萄糖儲備液，依次稀釋成質(zhì)量濃度為40、20、5、2.5 μg·mL-1系列溶液，充分混勻后取2 mL置于具塞試管，再精密加入1 mL 6%苯酚溶液，5 mL濃硫酸，水浴加熱20 min，取出，流水冷卻，于490 nm處測定吸光度[9-10]，得到回歸方程Y= 8.892 9X+0.022 8，r=0.999 4，表明樣品濃度在2.5～80 μg·mL-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 方法學(xué)考察 精密度試驗：取2 mL多糖儲備液按2.3.1項下操作測定其吸光度，連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD為1.78%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2 mL多糖儲備液在2.3.1項下操作，測定反應(yīng)后0、20、40、60、80、120 min后樣品吸光度，RSD值為1.99%，表明2 h穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：精密稱取多糖樣品2.5 mg，平行5份，上述操作下測定多糖平均含量為86.87%，RSD值為1.90%。

加樣回收率：精密移取已知含量的多糖樣品溶液1 mL，分別等比例加入80%、100%、120%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述操作測定其吸光度，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率測定結(jié)果(n=9)

注：樣品平均含量為0.021 7 mg·mL-1。

2.3.3 多糖含量的測定 精密稱取2.5 mg多糖樣品，蒸餾水定容至100 mL容量瓶，配制成C1濃度(0.025 mg·mL-1)的供試品溶液，同樣按上述操作測定樣品吸光度，根據(jù)回歸方程得出樣品中的質(zhì)量濃度為C2(0.021 7 mg·mL-1)，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：W =C2/C1×V(稀釋倍數(shù))，測得多糖中平均含量為86.87%，RSD為1.90%(n=5)。

2.4 荒漠肉蓯蓉苯乙醇苷類成分及多糖清除DPPH自由基能力的測定

2.4.1 DPPH自由基乙醇溶液的配制 精密稱取DPPH自由基粉末3.32 mg于100 mL棕色容量瓶中，加95%乙醇定容至刻度，超聲5 min，充分混勻，得到濃度約為0.08 mmol·L-1的DPPH自由基儲備液，現(xiàn)用現(xiàn)配，避光放置。

2.4.2 多糖樣品溶液的配制 稱取多糖12.5 mg定容于10 mL的容量瓶中，以水溶解，得到1.25 mg·mL-1的多糖儲備液，分別稀釋成0.078 125、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25 mg·mL-1的系列溶液。

2.4.3 荒漠肉蓯蓉醇提物及總苷樣品溶液的配制 分別稱取樣品10 mg定容于10 mL容量瓶，以水溶解，得到1 mg·mL-1的樣品儲備液，依次稀釋成12.5、25、50、100、200 μg·mL-1的系列溶液。

2.4.4 測定方法 參照文獻(xiàn)方法[11-15]，將1 mL的DPPH自由基乙醇溶液分別與1 mL不同濃度的樣品試液反應(yīng)，充分混勻，暗室靜置反應(yīng)30 min，以蒸餾水調(diào)零，于519 nm處用酶標(biāo)儀測定樣品溶液與DPPH自由基反應(yīng)后的吸光度A2，同時測定空白組(1 mL不同濃度樣品試液+1 mL蒸餾水)吸光度A1和對照組(1 mL DPPH自由基乙醇溶液+1 mL 蒸餾水)吸光度A0，每組平行測定3份，取平均值計算其清除DPPH自由基能力，通過GraphPad prism 5計算IC50的樣品試液濃度。

(1)

2.4.5 荒漠肉蓯蓉苯乙醇苷類成分及多糖清除·DPPH能力的測定結(jié)果 見圖2及表5。

序號受試物IC50/μg·mL-11醇提物44 572多糖類261 33總苷14 394Trolox3 66

由以上結(jié)果可知，Trolox抗氧化能力最強，與其相比，苯乙醇苷類成分具有較強的抗氧化能力，且其清除DPPH自由基能力與含量呈現(xiàn)正相關(guān)，在濃度達(dá)到一定程度時，清除率保持在穩(wěn)定水平；70%醇提物經(jīng)純化后，其效強增加2倍；與苯乙醇苷類成分相比，多糖抗氧化能力較弱，其效強僅為苷類成分的1/18，據(jù)此推測，苯乙醇苷類成分可能是發(fā)揮抗氧化作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 討論

為更全面地評價荒漠肉蓯蓉中有效成分的含量與活性，此次實驗中建立的UPLC色譜條件能使5種苯乙醇苷類成分在40 min內(nèi)獲得良好的分離度，在250～350 nm進(jìn)行全波長掃描，苯乙醇苷類成分在330 nm處有最大吸收；含量測定結(jié)果表明，荒漠肉蓯蓉中所含松果菊苷含量最高，其次為毛蕊花糖苷，兩者含量總和達(dá)到1.9%，符合《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，而醇提物經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化后，兩者含量顯著增加，達(dá)到17%，含量提高約9倍；所測的5種苯乙醇苷類成分中，管花苷A的含量最少，僅為0.33%，但經(jīng)分離純化后，達(dá)到3.36%，說明使用大孔吸附樹脂能夠很好地分離純化苯乙醇苷，不僅高效，且操作簡便安全；本實驗所建立的UPLC測定方法簡便快速、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確。搜索近4年苯乙醇苷類成分含量檢測的相關(guān)文獻(xiàn)可知，研究人員均采用HPLC、UPLC或與質(zhì)譜聯(lián)用建立色譜條件，色譜條件會依據(jù)藥物性質(zhì)、儀器性能等因素作出相應(yīng)調(diào)整。有研究[16-17]建立HPLC色譜條件檢測肉蓯蓉不同加工方式對苯乙醇苷類成分含量的影響，結(jié)果表明，蒸制肉蓯蓉切片5～7 min時苯乙醇苷含量有顯著提高。Wang X等[18]建立UPLC色譜條件檢測肉蓯蓉不同部位中苯乙醇苷類成分含量，研究顯示，不同部位中苯乙醇苷類成分含量差異明顯，且呈規(guī)律性變化。

綜合所述，建立HPLC/UPLC色譜條件對苯乙醇苷類成分進(jìn)行定性定量分析已成為一種成熟手段，且UPLC色譜系統(tǒng)可使化學(xué)成分獲得更佳的分離效果，在保證分析結(jié)果質(zhì)量的同時，提高工作效率。

在前期摸索測定多糖含量時，測得多糖中蛋白含量小于3%，同時在查閱已有文獻(xiàn)后，獲知苯酚硫酸法操作簡便、重復(fù)性好，且基本不受蛋白質(zhì)的影響，故采用苯酚硫酸法進(jìn)行實驗，結(jié)果測得多糖平均含量為86.87%，但該實驗反應(yīng)劇烈，操作時應(yīng)注意安全。

體外抗氧化實驗前期摸索中發(fā)現(xiàn)，清除DPPH自由基實驗中藥物靈敏度高于清除超氧陰離子自由基、羥基自由基這2項實驗中所測結(jié)果，又由于測定體外總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒所需樣品量少，容易引起誤差，故本文采用體外清除DPPH自由基實驗評價苯乙醇苷類成分與多糖的抗氧化能力，且在上述Peng F、Wang X等人實驗中同樣采用此方法，說明體外清除DPPH自由基實驗簡單快速、結(jié)果可靠。文章結(jié)果顯示，苯乙醇苷類成分抗氧化能力顯著高于多糖，醇提物、總苷與多糖的抗氧化效價比分別為1∶6、1∶18，且經(jīng)純化后得到的總苷抗氧化能力高于醇提物，效價比為1∶3，這與李麗等[19]、吳海虹等[20]得到的觀點一致，同時在楊建華等[21]的研究中表明，苯乙醇苷類成分抗氧化能力除與含量相關(guān)外，也與其所連接的苷元、酚羥基的數(shù)量與位置、空間位阻的大小等因素相關(guān)。中藥多糖的抗氧化相關(guān)研究顯示，不同種多糖清除DPPH自由基能力差異較大，提取工藝、炮制方法、分子量段等因素都會影響多糖的抗氧化能力[22-28]。

文章首次同時對荒漠肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分與多糖進(jìn)行含量與抗氧化能力的測定，為全面評價荒漠肉蓯蓉品質(zhì)，提高有效成分利用率提供數(shù)據(jù)參考。

[1] 高曉霞，陳君，彭艷麗.肉蓯蓉多糖藥理作用研究概況[J].食品與藥品，2015，17(2)：136-139.

[2] 丁燕，張開梅，蒼小鑫，等.肉蓯蓉屬化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，35(6)：395-402.

[3] 趙微，潘英妮.肉蓯蓉苯乙醇苷類成分藥理作用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2013，9(5)：77-79.

[4] 方鑒.肉蓯蓉的藥理研究進(jìn)展[J].光明中醫(yī)，2017，32(14)：2140.

[5] 曲正義，金銀萍，張玉偉，等.列當(dāng)屬藥用植物化學(xué)成分、生物活性及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2018，5(1)：209-216.

[6] 韓國慶，李彩峰，王曉琴，等.列當(dāng)中苯乙醇苷類成分的含量測定[J].中國中藥雜志，2015，40(21)：4218-4222.

[7] 張瑜，楊健，詹志來，等.UPLC-MS/MS測定不同產(chǎn)地吊石苣苔中苯乙醇苷類成分含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2017，19(4)：504-508.

[8] 易滿，封傳華，湯小林，等.不同產(chǎn)地車前草中總苯乙醇苷和毛蕊花糖苷含量測定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2017，24(9)：84-86.

[9] 李莉，曹進(jìn).分光光度法測定肉蓯蓉多糖含量[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2017，8(7)：2419-2423.

[10] 范傳潁，陶正明，吳志剛.苯酚硫酸法與蒽酮硫酸法測定鐵皮石斛中多糖含量的比較[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013(7)：799-801.

[11] 談利紅.體外抗氧化評價體系在中藥中的拓展應(yīng)用[D].重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2016.

[12] 劉伯言.肉蓯蓉苯乙醇苷的提取、純化和抗氧化活性研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2014.

[13] 王力偉.肉蓯蓉成分的分離鑒定、定量分析及生物活性研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué)，2016.

[14] 劉洋，修效友，汪維云.響應(yīng)面分析法優(yōu)化肉蓯蓉苯乙醇苷提取反應(yīng)及其抗氧化反應(yīng)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，42(2)：294-298.

[15] 俞慧紅，竺巧玲，戴飛，等.多糖抗氧化作用的研究現(xiàn)狀[J].食品研究與開發(fā)，2008，29(3)：172-176.

[16] Peng F，Xu R，Wang X，et al.Effect of the Steaming Process on Quality of Postharvest Cistanche deserticola for Medicinal Use during Sun Drying[J].Biol Pharm Bull，2016，39(12)：2066-2070.

[17] Peng F，Chen J，Wang X，et al.Changes in Levels of Phenylethanoid Glycosides，Antioxidant Activity，and Other Quality Traits in Cistanche deserticola Slices by Steam Processing[J].Chem Pharm Bull(Tokyo)，2016，64(7)：1024-1030.

[18] Wang X，Wang J，Guan H，et al.Comparison of the Chemical Profiles and Antioxidant Activities of Different Parts of Cultivated Cistanche deserticola Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry and a 1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl-Based Assay[J].Molecules，2017，22(11)：E2011.

[19] 李麗，劉質(zhì)凈，時東方，等.車前草中苯乙醇苷類化合物的抗氧化活性研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(1)：275-277.

[20] 吳海虹，玄國東，劉春泉，等.肉蓯蓉苯乙醇苷的純化及其抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2008(6)：190-193.

[21] 楊建華，胡君萍，熱娜·卡斯木，等.肉蓯蓉屬植物中六種苯乙醇苷類化合物抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系研究[J].中藥材，2009，32(7)：1067-1069.

[22] 汪瑞敏，朱秋勁，張春花，等.不同提取方法對天麻多糖抗氧化活性的影響[J].食品科技，2015，40(3)：208-213.

[23] 姜寧，劉曉鵬，陳芳，等.厚樸多糖提取工藝及其體外抗氧化活性[J].食品科學(xué)，2015，36(6)：12-17.

[24] 趙永安，陳冠，陶遵威.苦豆子多糖及其衍生物的體外抗氧化活性[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(5)：229-232.

[25] 徐叢玥，林款，梁征，等.不同提取方法對米邦塔仙人掌粗多糖體外抗氧化性的影響[J].食品工業(yè)科技，2018，39(3)：56-60.

[26] 嚴(yán)成，嚴(yán)夏.枸杞多糖提取工藝比較及體外抗氧化性研究[J].食品科學(xué)，2008，29(7)：183-187.

[27] 李寒冰，苗靜靜，李根林，等.生、熟地黃的體外抗氧化活性測定方法研究[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10(9)：393-395.

[28] 郝杰，查學(xué)強，鮑素華，等.霍山石斛不同分子量多糖體外抗氧化研究[J].食品科學(xué)，2009，30(15)：94-98.