陳銘陽，胡小松，許貞，任廣喜，蘆海生，劉春生*

(1.北京中醫(yī)藥大學 中藥學院，北京 102488；2.中國中醫(yī)科學院 望京醫(yī)院，北京 100102)

龜甲是一種常用中藥，具有滋陰潛陽、益腎強骨、養(yǎng)血補心、固經(jīng)止崩的功效，常用于陰虛潮熱、骨蒸盜汗、頭暈目眩、虛風內(nèi)動、筋骨痿軟、心虛健忘、崩漏經(jīng)多等癥[1]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，龜甲具有抗氧化活性[2-3]、提高機體免疫力[4]、促骨髓間充質(zhì)干細胞增殖分化[5-9]等多種藥理作用。已有報道的活性成分有無機元素[10-11]、甾體類[12-14]、氨基酸與多肽類[15-16]、多酚類[17]等。但是，目前龜甲的代表活性成分依然尚不清楚。

中醫(yī)藥的臨床實踐已經(jīng)有幾千年歷史，但許多已被證明有確切療效的中藥依靠現(xiàn)有的分子醫(yī)學理論依然無法給出合理的解釋，提示了中藥中存在著未知的藥效機制。微小核糖核苷酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是指一類長度為20～22 nt、能夠調(diào)控基因表達的非編碼小分子RNA[18]，其廣泛存在于動物、植物體內(nèi)，并通過與靶基因互補或不完全互補的方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達。研究表明，miRNA能作為一種信號分子在不同生命體間傳播，跨物種對基因表達起到調(diào)控作用[19]。2011年，張辰宇課題組報道了一項重大發(fā)現(xiàn)，植物miRNAs可以通過飲食的方式進入人體血液和組織，它們可以通過調(diào)控人體內(nèi)靶基因表達而影響人體生理功能[20]。2014年，該課題組進一步發(fā)現(xiàn)中藥金銀花中的miR2911能在動物體內(nèi)傳遞并被吸收，并可通過靶向調(diào)控PB1、PB2基因抑制H1N1、H5N1、H7N9病毒的復制來治療流感[21]。

盡管外源miRNA藥效機制的相關(guān)研究在植物中已經(jīng)取得一些成果，并有許多相關(guān)文獻的支持[22-24]，但在藥用動物中的研究還是空白，龜甲等常用動物藥中是否也有穩(wěn)定存在的miRNAs尚不清楚。筆者利用轉(zhuǎn)錄組測序、實時熒光定量PCR及計算機模擬技術(shù)對龜甲可能存在活性的功能miRNA進行初步篩選，為龜甲及其他動物藥中新型活性成分的開發(fā)提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

龜甲購自河北安國藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定為《中華人民共和國藥典》所載龜甲正品。烏龜及黃喉擬水龜購自廣州水產(chǎn)品市場。樣品信息如表1所示。

表1 龜甲及相關(guān)測試樣品信息

1.2 總RNA提取

分別取適量龜甲、新鮮烏龜背甲、新鮮黃喉擬水龜背甲，使用無水乙醇洗凈后搗碎，置于-80 ℃冷凍過夜后，再在真空低溫冷凍條件下凍干備用。

總RNA的提取選用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)試劑盒，分別提取上述3個樣品的總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度，Nanodrop檢測RNA純度以及Agilent2100檢測RNA完整性。

1.3 miRNA文庫構(gòu)建和測序

采用Illumina TruSeq Small RNA試劑盒構(gòu)建龜甲miRNA文庫。以total RNA為起始樣品，1 μg為起始量，分別在miRNA的3′端和5′端加上接頭，然后使用隨機引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后經(jīng)過PCR擴增(11～12個循環(huán))，對cDNA文庫進行富集，再采用6% Novex TBE PAGE進行文庫純化。使用TBS380(Picogreen)對文庫定量，cBot上進行橋式PCR擴增后利用Hiseq測序平臺，進行SE50測序(由上海美吉生物公司完成)。其流程如圖1所示。

圖1 龜甲miRNA 文庫構(gòu)建流程

1.4 測序信息分析

測序信息分析采用Fastx-Toolkit(http：//hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/)與上海美吉生物自主開發(fā)軟件，流程圖如圖2所示。

圖2 龜甲測序信息分析流程圖

1.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控和長度分析統(tǒng)計 原始數(shù)據(jù)下機之后，先統(tǒng)計原始數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量、堿基質(zhì)量等信息。隨后對原始數(shù)據(jù)進行去接頭、去除含未知堿基序列、去低質(zhì)量堿基序列、長度篩選處理，獲得clean small RNA 序列，并對高質(zhì)量的測序結(jié)果(clean reads)進行長度分布統(tǒng)計。原始的FASTQ 數(shù)據(jù)里面含有帶接頭、低質(zhì)量的序列(reads)，為了保證后續(xù)生物信息分析的準確性，需要對raw reads 進行質(zhì)量控制，得到clean reads，之后的生物信息分析會基于clean reads 進行。具體質(zhì)控步驟：1)去除reads 中的3′接頭序列，去除由于接頭自連等原因?qū)е聸]有插入片段的reads；2)剪切3′端測序質(zhì)量較低的堿基(質(zhì)量值小于20)；3)去除含未知堿基N 的reads；4)去除長度過短的reads(<18nt)；5)去除長度過長的reads(>32 nt)。

1.4.2 序列去冗余、miRNA鑒定和表達量統(tǒng)計 首先，對clean reads 進行相同序列合并(去冗余)處理，這樣可以方便后續(xù)分析。隨后，將去冗余之后的clean reads與Rfam、miRBase的基因組序列比對，鑒定出已知和新的miRNA分子，分別獲得各自的表達量即count值。由于烏龜在miRBase中沒有對應物種的miRNA序列信息，研究中選擇近緣物種海龜?shù)幕蚪M作為參考，若有注釋信息，就用參考基因組中的miRNA序列注釋測得的miRNA，將其余不能比對上的sRNA比對到參考基因組上，截取其周圍序列，使用軟件進行二級結(jié)構(gòu)預測，根據(jù)預測結(jié)果利用Dicer酶切位點信息、能量值等特征進行過濾，鑒定出新的miRNA。對所有已知和新預測miRNA進行表達量統(tǒng)計，并利用Transcripts Per Million(TPM)進行表達量的均一化處理。

1.4.3 靶基因預測和功能分析 對分析得到的已知和新預測的miRNA利用miRanda軟件(www.microrna.org)進行靶基因預測。由于本研究中主要探究的是龜甲中具有藥效活性的miRNA，因此補充使用TargetScan預測工具(www.targetscan.org)對表達量較高的miRNA進行人轉(zhuǎn)錄組中靶基因預測。

1.5 實時熒光定量PCR

1.5.1 引物設計 實驗選用轉(zhuǎn)錄組測序中count值超過10 000的miRNA進行絕對定量驗證。選定測試基因后設計引物，如表2所示。

1.5.2 標準曲線的制備 將目的基因合成后克隆到質(zhì)粒中，測定質(zhì)粒濃度并計算其拷貝數(shù)，對照品以0.18 ng·μL-1的初始質(zhì)量濃度進行10倍梯度稀釋，每個質(zhì)量濃度設置3個重復進行實時熒光定量PCR反應，并繪制擴增曲線。以對照品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(X)，以測得的目的基因的Ct值為縱坐標(Y)構(gòu)建標準曲線并計算得出線性方程。NW-006622633-1-195的標準曲線為Y=-3.012X+34.137，r=0.993；NW-006642957-1-500的標準曲線為Y=-3.38X+35.568，r=0.998；xtr-mir-22的標準曲線為Y=-3.415X+34.446，r=0.993，線性關(guān)系均良好。

1.5.3 絕對定量拷貝數(shù)計算 3個miRNA在各樣品中進行實時熒光定量PCR實驗后，根據(jù)其Ct值重合在標準曲線上的位置計算出目的基因在樣品中的絕對拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 龜甲miRNA轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析

2.1.1 原始數(shù)據(jù) 原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，共產(chǎn)出11 021 113條原始序列，總堿基數(shù)為562 076 763 bp，堿基錯誤率為0.010 6%，Phred數(shù)值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比分別為99.42%和98.15%，GC含量為55.33%。

表2 龜甲測序?qū)崟r熒光定量PCR實驗引物

樣品原始數(shù)據(jù)中堿基質(zhì)量值越高，說明測序錯誤率越低。樣品原始數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量分布如圖3所示，所獲得的測序數(shù)據(jù)達到后續(xù)分析要求。

注：橫坐標是表示reads 上從5′到3′端依次堿基的排列。圖3 堿基質(zhì)量分布圖

2.1.2 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控后長度分布統(tǒng)計 從全部11 021 113條原始序列中去除接頭序列201 318條、含未知堿基N的序列3612條、長度過短(<18 nt)的序列4 756 611條、長度過長(>32 nt)的序列1 017 128條后，共得到高質(zhì)量的測序結(jié)果(clean reads)5 042 444條。質(zhì)控之后，對clean small RNA 的reads 長度分布進行統(tǒng)計，龜甲樣品在18～32 nt中大體呈正態(tài)分布，并在22 nt處出現(xiàn)高峰，統(tǒng)計結(jié)果見圖4。

圖4 clean reads 序列長度分布

2.1.3 已知miRNA鑒定及其表達分析 對龜甲樣品中測得的miRNA進行鑒定，共得到578條已知miRNA，部分統(tǒng)計結(jié)果如表3、4所示。其中xtr-miR-22的count值超過10 000，其二級結(jié)構(gòu)如圖5所示。

2.1.4 新miRNA預測及其表達分析 對龜甲樣品中測得的miRNA進行鑒定，共預測得到120條新miRNA，部分統(tǒng)計結(jié)果見表5、6。共兩條miRNA的count值超過10 000，分別命名為NW-006642957-1-500和NW-006622633-1-195，其結(jié)構(gòu)預測如圖6所示。

表3 部分已知miRNA的count值統(tǒng)計結(jié)果

表4 部分已知miRNA的TPM值統(tǒng)計結(jié)果

圖5 xtr-miR-22的二級結(jié)構(gòu)

miRNA名稱CountsNW?006642957?1?50019129NW?006622633?1?19510441NW?006615969?1?774606NW?006656176?1?6044543NW?006633404?1?3494538NW?006631183?1?3173736NW?006637514?1?4523088NW?006657619?1?6153071

表6 新預測miRNA的部分TPM值統(tǒng)計結(jié)果

圖6 NW-006622633-1-195和NW-006642957-1-500的二級結(jié)構(gòu)

2.1.5 靶基因預測 Count值最高的已知miRNA(xtr-miR-22)的靶基因預測結(jié)果如表7所示，在人轉(zhuǎn)錄組中靶基因預測結(jié)果如表8所示，得分最高的是PML基因，為早幼粒細胞白血病相關(guān)基因。

表7 xtr-mir-22靶基因預測結(jié)果

表8 xtr-mir-22靶基因預測結(jié)果

2.2 實時熒光定量PCR實驗結(jié)果分析

實驗選用count值超過10 000的1條已知miRNA(xtr-miR-22)和2條新預測miRNA(NW-006622633-1-195，NW-006642957-1-500)進行絕對定量驗證，對各樣品中3條miRNA的拷貝數(shù)進行計算，每個樣品進行3個重復，結(jié)果如圖7所示。

注：nw-1-195及nw-1-500分別代表2條新預測miRNA(NW-006622633-1-195，NW-006642957-1-500)；**表示該miRNA在各樣品中的拷貝數(shù)有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。圖7 3個miRNA在各樣品中的拷貝數(shù)計算結(jié)果

將實驗獲得的數(shù)據(jù)采用SAS8.2軟件進行處理及單因素方差分析，結(jié)果顯示NW-006622633-1-195在龜甲、烏龜動物背甲及烏龜同屬動物黃喉擬水龜?shù)谋臣字锌截悢?shù)無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而NW-006642957-1-500及xtr-mir-22在各樣品中拷貝數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中xtr-miR-22在烏龜背甲中的拷貝數(shù)顯著高于黃喉擬水龜背甲，在龜甲中的拷貝數(shù)顯著高于烏龜背甲。

3 結(jié)論與討論

本研究中采用miRNA轉(zhuǎn)錄組高通量測序?qū)敿字锌赡艽嬖诘膍iRNA的結(jié)構(gòu)進行預測，共得到三條count值超過10 000的miRNA序列：xtr-miR-22，NW-006642957-1-500以及NW-006622633-1-195。實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示xtr-miR-22在烏龜背甲中的拷貝數(shù)明顯高于同屬的常用混偽品基原動物黃喉擬水龜?shù)谋臣?，且其在龜甲中未發(fā)生明顯的降解，可能為龜甲中具有藥理活性的miRNA。靶基因預測結(jié)果顯示xtr-miR-22可作用于PML基因以抑制其表達，而PML基因的表達能夠抑制早幼粒細胞白血病HL-60細胞凋亡并促進其增殖[25]，因此xtr-miR-22具有潛在的治療早幼粒細胞白血病的藥理活性。

盡管目前已有很多有關(guān)龜甲藥效及其物質(zhì)基礎的報道，但由于龜甲本身成分極為復雜，這些研究多數(shù)停留于提取物及動物或細胞的表觀變化上，而鮮有觸及作用機制和藥效物質(zhì)基礎的報道。有研究表明，益血生膠囊和補髓生血解毒湯等含龜甲的制劑能夠治療急性白血病化療后的全血細胞減少癥并降低不良反應[26-27]，龜甲在其中主要起到改善骨髓造血機制、提高機體免疫力的作用。雖然與本研究在龜甲中發(fā)現(xiàn)的xtr-miR-22的靶基因預測結(jié)果并不一致，但考慮到計算機靶基因預測具有局限性，且miRNA在時空表達中往往能夠靶向調(diào)控多個基因，因此并不能排除miRNAs作為龜甲中具有生物活性的藥效物質(zhì)，筆者后續(xù)將設計靶向驗證實驗加以驗證。

張辰宇課題組[21]在金銀花miR2911的研究中證實植物類中藥中存在結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定的miRNA，不僅在高溫煎煮中沒有發(fā)生大量降解，而且能夠通過胃腸道后由腸上皮細胞傳遞至其他組織和器官，并通過靶向調(diào)控基因發(fā)揮其生物活性。對于人與小鼠等哺乳動物，植物miRNA屬于外源miRNA，其結(jié)構(gòu)與動物miRNA有一定區(qū)別，尚且能夠跨界調(diào)控動物的基因，提示動物藥中的miRNA亦具有通過胃腸道傳遞進入人體內(nèi)并調(diào)控人基因的潛力。

本研究以龜甲為例，首次測序并驗證了中藥動物藥中存在miRNAs，可能為中藥中一類新型的具有藥理作用的活性物質(zhì)，為中藥動物藥活性物質(zhì)研究及中藥新藥開發(fā)提供了新的思路及理論依據(jù)。

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