張德謹(jǐn)

陳義勇3

胡雅琳1

劉 祥1

(1.宿州學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，安徽 宿州 234000；2.宿州學(xué)院精細(xì)化工產(chǎn)品開發(fā)研究所，安徽 宿州 234000；3.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 蘇州 215500)

烏飯樹古稱染菽，屬于杜鵑花科[1]。作為烏飯樹葉中的功能性成分之一，黃酮類化合物具有多種生理活性，如抗氧化[2-4]、抑菌[5-7]、抗疲勞[8]等。目前，中國(guó)對(duì)烏飯樹葉資源的利用率較低，基于烏飯樹葉黃酮的生理活性，很有必要對(duì)烏飯樹葉黃酮進(jìn)行純化，進(jìn)而提高烏飯樹葉黃酮的附加值。目前，常用的純化方法包括柱色譜、萃取、高效液相色譜、高速逆流色譜等，相比較而言，柱色譜法具有成本低、操作程序簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[9]。其中，大孔樹脂被廣泛地應(yīng)用于黃酮的分離純化[10-12]。大孔樹脂具有多孔性和較大的比表面積，主要通過物理作用從溶液中有選擇性地吸附有機(jī)物質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的[13]。另外，大孔樹脂具有化學(xué)穩(wěn)定性好、價(jià)格便宜、易于工業(yè)化等特點(diǎn)，也促使了大孔樹脂在天然產(chǎn)物有效成分純化方面的應(yīng)用越來越多。因此，本試驗(yàn)選擇大孔樹脂用于烏飯樹葉黃酮的初步純化。

目前，對(duì)于烏飯樹葉黃酮的研究主要集中在如何高效提取黃酮類化合物[14-15]，以及烏飯樹葉黃酮粗提物的功能特性[16-17]等方面，對(duì)于如何利用大孔樹脂對(duì)烏飯樹葉黃酮粗提物進(jìn)行純化缺乏系統(tǒng)性的研究，而且一些對(duì)烏飯樹葉黃酮純化方法的研究中存在黃酮純度低、工藝復(fù)雜以及溶劑有毒性等問題，影響了烏飯樹資源的開發(fā)利用。本試驗(yàn)通過對(duì)大孔樹脂純化烏飯樹葉黃酮工藝的研究，確定烏飯樹葉黃酮純化工藝，并利用多種方法對(duì)純化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，旨在為烏飯樹資源的開發(fā)利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮烏飯樹葉：產(chǎn)地江蘇宜興；

牛血清白蛋白：上海艾研生物科技有限公司；

槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品：純度>98%，貴州迪大生物科技有限公司；

葡萄糖：分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；

考馬斯亮藍(lán)G-250：上海譜振生物科技有限公司；

甲醇：色譜純，天津君博化工有限公司；

大孔樹脂SP-825、NKA-II、HZ-841、HZ-802：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，4種大孔樹脂理化性能見表1。

表1 樹脂的理化性能Table 1 Physical and chemical properties of resins

1.2 主要儀器

高效液相色譜儀：LC-20AD型，日本島津公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9030A型，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-2型，金壇市接瑞爾電器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-B95型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

可見分光光度計(jì)：722型，上海菁華科技儀器有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-A型，上海五相儀器儀表有限公司；

真空干燥箱：DZF-6050型，上海邁捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烏飯樹葉黃酮的制備 取粉碎后的烏飯樹葉粉末20 g 置于1 000 mL燒杯中，加入800 mL蒸餾水，50 ℃下浸提2 h，經(jīng)濃縮后得到烏飯樹黃酮[17]。

1.3.2 黃酮濃度的測(cè)定 分別移取0.0，0.4，0.8，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2 mL 50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液至10 mL容量瓶中，用1% AlCl3定容，在434 nm處測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，得到擬合曲線方程為：A=0.064 7C+0.004 08，線性范圍為2～14 mg/L，R2=0.999 75。

1.3.3 樹脂的預(yù)處理 參照文獻(xiàn)[18～19]，將大孔樹脂SP-825、NKA-II、HZ-841和HZ-802先后用乙醇、鹽酸以及氫氧化鈉進(jìn)行處理，最后用蒸餾水洗至中性。

1.3.4 吸附樹脂的選擇

(1) 樹脂的吸附與解吸性能比較：分別稱取預(yù)處理的大孔樹脂SP-825、NKA-II、HZ-841、HZ-802各1 g (干重)，各加入30 mL烏飯樹黃酮溶液(濃度為0.55 mg/mL)中，然后放到溫度為25 ℃的恒溫振蕩器中，以120 r/min振蕩12 h，按式(1)、(2)計(jì)算樹脂的吸附容量與吸附率。

(1)

(2)

式中：

Qe——吸附容量，mg/g；

E——吸附率，%；

C0——液相中黃酮的初始濃度，mg/mL；

Ce——達(dá)到吸附平衡時(shí)的黃酮濃度，mg/mL；

Vi——樣品溶液體積，mL；

W——樹脂的質(zhì)量，g。

將吸附飽和的樹脂用蒸餾水洗凈，加入30 mL 體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇，在25 ℃下以120 r/min振蕩12 h，按式(3)計(jì)算樹脂的解吸率。

(3)

式中：

D——解吸率，%；

Cd——液相中黃酮濃度，mg/mL；

Vd——洗脫液體積，mL。

(2) 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線：準(zhǔn)確稱取1 g預(yù)處理后的大孔樹脂，加入濃度為0.5 mg/mL的烏飯樹黃酮溶液30 mL，在25 ℃下以120 r/min轉(zhuǎn)速恒溫振蕩，至吸附達(dá)到平衡前，每隔一定時(shí)間測(cè)定液相中黃酮的濃度，計(jì)算各個(gè)時(shí)間的吸附量。

1.3.5 烏飯樹葉黃酮純化工藝

(1) 上樣濃度對(duì)吸附率的影響：準(zhǔn)確稱取1 g預(yù)處理后的大孔樹脂，裝入層析柱中(柱體積為14 mL)，分別用黃酮濃度為0.25，0.50，0.75，1.00，1.25，1.50 mg/mL的烏飯樹葉黃酮溶液上樣，上樣流速1 mL/min，上樣體積30 mL，考察不同上樣濃度對(duì)吸附率的影響。

(2) 動(dòng)態(tài)穿透曲線：準(zhǔn)確稱取1 g預(yù)處理后的大孔樹脂，裝入層析柱中(內(nèi)徑3 cm)，烏飯樹葉黃酮溶液上樣濃度0.75 mg/mL，上樣流速1 mL/min，用自動(dòng)收集器收集流出液，每管收集3.5 mL，測(cè)定收集管中黃酮的濃度，繪制動(dòng)態(tài)穿透曲線。

(3) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響：按照1.3.5(2)中的上樣條件進(jìn)行上樣，用蒸餾水洗脫至洗脫液無色，再分別用10%，30%，50%，70%，90%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液以1 mL/min 洗脫流速洗脫，比較不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇對(duì)解吸率的影響。

(4) 洗脫流速對(duì)解吸率的影響：按照1.3.5(2)中的上樣條件進(jìn)行上樣，上樣結(jié)束后，先用蒸餾水洗脫至洗脫液無色，然后用50%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液洗脫，洗脫流速分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL/min，比較不同洗脫流速對(duì)解吸率的影響。

(5) 動(dòng)態(tài)解吸曲線：在確定的最佳工藝條件下上樣，上樣結(jié)束后先用蒸餾水洗脫至洗脫液為無色，然后用50%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇溶液以1 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，用自動(dòng)收集器收集洗脫液，測(cè)定洗脫液中的黃酮濃度，繪制動(dòng)態(tài)解吸曲線。

1.3.6 純化效果評(píng)價(jià)

(1) 多糖含量及脫除率的計(jì)算：參見文獻(xiàn)[20]，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程為：A=0.008 6C+0.033 2，R2=0.993 5。按式(4)、(5)計(jì)算純化前后多糖含量及多糖脫除率。

(4)

(5)

式中：

w1——多糖含量，%；

R1——多糖脫除率，%；

c1——多糖濃度，mg/mL；

v——樣品溶液體積，mL；

m——固形物質(zhì)量，mg；

m1——純化前多糖質(zhì)量，mg；

m2——純化后多糖質(zhì)量，mg。

(2) 蛋白質(zhì)含量及脫除率的計(jì)算：參見文獻(xiàn)[21]，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定烏飯樹葉提取物中的蛋白質(zhì)含量。線性回歸方程為：A=0.002 0C-0.002 0，R2=0.999 1。按式(6)、(7)計(jì)算蛋白質(zhì)脫除率。

(6)

(7)

式中：

w2——蛋白質(zhì)含量，%；

R2——蛋白質(zhì)脫除率，%；

c2——蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；

m3——純化前蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；

m4——純化后蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg。

(3) 黃酮純度的計(jì)算：根據(jù)1.3.2中黃酮的定量方法，計(jì)算純化前后黃酮純度，按式(8)計(jì)算黃酮純度。

(8)

式中：

P——黃酮純度，%；

c3——黃酮濃度，mg/mL。

(4) 純化前后烏飯樹葉黃酮HPLC譜圖的比較：純化前與純化后的烏飯樹黃酮溶液用0.22 μm的微孔膜過濾，進(jìn)行HPLC分析。HPLC分析條件：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm；色譜柱VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇∶水=0.44∶0.36(體積比)；柱溫30 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；時(shí)間30 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附樹脂的選擇

2.1.1 樹脂的吸附與解吸比較 樹脂的吸附和解吸性能與吸附劑的結(jié)構(gòu)以及被吸附物的化學(xué)性質(zhì)都有一定的關(guān)系[22]。由圖1可知，4種樹脂中，SP-825和NKA-II的吸附率與吸附量相對(duì)較高，這是由于SP-825和NKA-II2種樹脂極性與烏飯樹葉中黃酮類化合物極性較為接近，較易發(fā)生吸附行為。因此選擇SP-825和NKA-II 2種樹脂進(jìn)行進(jìn)一步的性能比較。

圖1 靜態(tài)吸附與解吸試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Results of static adsorption and desorption experiment

2.1.2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 由圖2可知，NKA-II樹脂在3 h達(dá)到吸附平衡，SP-825樹脂在4 h達(dá)到吸附平衡，并且NKA-II樹脂對(duì)烏飯樹葉黃酮的最大吸附量大于SP-825樹脂的。因此選擇大孔樹脂NKA-II用于烏飯樹葉黃酮的初步純化。

2.2 烏飯樹葉黃酮純化工藝的確定

2.2.1 上樣濃度對(duì)吸附率的影響 由圖3可知，隨著上樣濃度的增大，黃酮的吸附量增加，但同時(shí)黃酮的吸附率卻下降。這是由于大孔樹脂本身吸附位點(diǎn)是一定的，隨著上樣濃度的提高，大孔樹脂吸附位點(diǎn)接近飽和，致使黃酮損失嚴(yán)重，此外，隨著上樣濃度的增大，與黃酮發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附的雜質(zhì)濃度同樣增大，影響了大孔樹脂對(duì)烏飯樹葉黃酮的吸附過程?？紤]到高效地利用烏飯樹葉黃酮，選擇上樣濃度為0.75 mg/mL。

圖2 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Figure 2 Static adsorption kinetics curves

圖3 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響Figure 3 Effect of initial concentration of flavones on adsorption

2.2.2 動(dòng)態(tài)穿透曲線 穿透曲線是工業(yè)上吸附過程設(shè)計(jì)和操作的基礎(chǔ)，由圖4可知，當(dāng)上樣體積為2.0 BV時(shí)，流出液濃度基本穩(wěn)定，說明吸附過程基本趨于平衡。因此確定合適的上樣體積為2.0 BV。

圖4 動(dòng)態(tài)穿透曲線Figure 4 Dynamic breakthrough curve

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸率的影響 大孔樹脂吸附烏飯樹葉黃酮后，選擇洗脫劑時(shí)主要考慮其極性對(duì)洗脫效果的影響，NKA-II樹脂為中等極性的大孔樹脂，因此選擇中等極性溶劑洗脫。由圖5可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃酮的解吸率也相應(yīng)地增大，但是當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)>50%以后，解吸率變化緩慢，并且隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，洗脫溶液中醇溶性雜質(zhì)不斷增加，最終導(dǎo)致烏飯樹葉黃酮純度下降。為了節(jié)約有機(jī)溶劑、提高純化后黃酮純度，選擇50%的乙醇作為洗脫劑。

2.2.4 洗脫流速對(duì)解吸率的影響 由圖6可知，隨著洗脫流速的增加，解吸率逐漸降低，這是因?yàn)檫^高的洗脫流速，致使解吸過程中溶劑與黃酮類化合物接觸時(shí)間較短，難以高效地將烏飯樹葉黃酮洗脫?？紤]到洗脫流速為0.5 mL/min時(shí)洗脫時(shí)間太長(zhǎng)，因此選擇洗脫流速為1.0 mL/min。

圖5 乙醇濃度對(duì)洗脫效果的影響Figure 5 Effect of ethanol aqueous solution on desorption

圖6 洗脫流速對(duì)洗脫效果的影響Figure 6 Effect of flow rate of elution on desorption

2.2.5 動(dòng)態(tài)解吸曲線 由圖7可知，NKA-II樹脂吸附烏飯樹葉黃酮較易洗脫，在洗脫劑用量為1 BV時(shí)，洗脫濃度達(dá)到最高，洗脫峰較為集中，當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到3 BV后，烏飯樹葉黃酮基本被洗脫完。因此確定合適的洗脫體積為3 BV。

圖7 動(dòng)態(tài)解吸曲線Figure 7 Dynamic desorption curve

2.3 純化效果評(píng)價(jià)

2.3.1 蛋白質(zhì)、多糖脫除率以及黃酮純度變化 純化前后的烏飯樹黃酮溶液在真空條件下進(jìn)行干燥，對(duì)烏飯樹黃酮溶液中的主要成分進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由表2可知，NKA-II樹脂能夠有效脫除烏飯樹黃酮溶液中蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，大大提高了烏飯樹葉黃酮純度。

2.3.2 純化前后烏飯樹葉黃酮HPLC譜圖比較 王立等[23]已經(jīng)從烏飯樹葉的提取物中分離出槲皮素，因此本研究利用槲皮素作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物，考察純化前后烏飯樹葉槲皮素純度的變化。純化前后HPLC譜圖變化的結(jié)果見圖8。由圖8可知，純化后槲皮素的相對(duì)峰面積明顯提高，說明經(jīng)過NKA-II樹脂的純化后，烏飯樹葉槲皮素純度明顯提高。

表2 烏飯樹葉黃酮提取物中蛋白質(zhì)、多糖含量及黃酮純度Table 2 Content of protein and polysaccharide and purity of flavones from VBTL %

3 結(jié)論

大孔樹脂已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于黃酮類化合物的分離純化，樹脂的結(jié)構(gòu)和極性是影響其吸附性能的主要因素。本試驗(yàn)中所用的大孔樹脂有極性、非極性和弱極性，通過靜態(tài)吸附與解吸性能的比較，確定NKA-II樹脂用于烏飯樹葉黃酮的純化，是由于烏飯樹葉黃酮類化合物中的酚羥基具有一定的極性，有利于極性樹脂的吸附。通過NKA-II樹脂吸附于解吸烏飯樹葉黃酮試驗(yàn)，確定烏飯樹葉黃酮純化工藝條件為：上樣濃度0.75 mg/mL，上樣流速1 mL/min，上樣體積2.0 BV，洗脫流速1.0 mL/min，洗脫劑為50%(體積分?jǐn)?shù))的乙醇，洗脫體積3 BV。在該純化工藝條件下，蛋白質(zhì)脫除率為76.32%，多糖脫除率為65.45%，黃酮純度達(dá)48.92%。通過純化前后HPLC譜圖的變化對(duì)純化效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明經(jīng)過NKA-II樹脂純化后，烏飯樹葉提取物中槲皮素純度明顯提高。但是，純化后總黃酮含量偏低，需要后期進(jìn)行進(jìn)一步研究，從而達(dá)到降低純化過程中烏飯樹葉黃酮損失的目的。除此之外，通過本試驗(yàn)并未得到黃酮類化合物單體，需要后期結(jié)合其他分離純化手段對(duì)烏飯樹葉黃酮進(jìn)行進(jìn)一步分離。

圖8 純化前后烏飯樹葉黃酮HPLC譜圖比較Figure 8 HPLC analysis of flavones from VBTL before and after purification

[1] 余清, 陳紹軍, 龐杰.烏飯樹葉有效成分的研究及其開發(fā)應(yīng)用[J].食品與機(jī)械, 2007, 23(3): 171-174.

[2] 蔡凌云.烏飯樹葉中總黃酮體外抗氧化活性[J].中成藥, 2011, 33(6): 1 054-1 057.

[3] 程素嬌, 鄧璐璐, 章海燕, 等.烏飯樹樹葉多糖提取及純化工藝優(yōu)化研究[J].食品與機(jī)械, 2012, 28(6): 142-146.

[4] DANIELA B, LUISA T, FRANCESCA D G, et al.Antioxidant activities of sicilian prickly pear (opuntia ficus indica) fruit extracts and reducing properties of its betalains: betanin and indicaxanthin[J].Agricultural and Food Chemistry, 2002, 50(23): 6 895-6 901.

[5] 章海燕, 王立, 張暉.烏飯樹樹葉水溶性黃酮的抑菌作用的研究[J].中國(guó)食品添加劑, 2010(5): 62-67.

[6] EDZIRI H, MASTOURI M, AMMAR S, et al.Antimicrobial, antioxidant, and antiviral activities of retama raetam (forssk) webb flowers growing in Tunisia[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(12): 2 933-2 940.

[7] GOMAH N.Antimicrobial activity of Calotropis procera Ait.(Asclepiadaceae) and isolation of four flavonoid glycosides as the active constituents[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2013, 29(7): 1 255-1 262.

[8] 黃麗娜, 馬文領(lǐng), 周健, 等.烏飯樹葉醇提物抗大鼠精神疲勞作用[J].中國(guó)公共衛(wèi)生, 2008, 24(8): 964-966.

[9] LIU Wei, ZHANG Su, ZU Yuan-gang, et al.Preliminary enrichment and separation of genistein and apigenin from extracts of pigeon pea roots by macroporous resins[J].Bioresource Technology, 2010, 101(12): 4 667-4 675.

[10] 邵金華, 何福林, 陳霞, 等.梓樹根皮總黃酮分離純化及其抑菌活性研究[J].食品與機(jī)械, 2017, 33(2): 140-144.

[11] LI Jie, CHEN Zhen-bin, DI Duo-long.Preparative separation and purification of Rebaudioside A from Stevia rebaudiana Bertoni crude extracts by mixed bed of macroporous adsorption resins[J].Food Chemistry, 2012, 132(1): 268-276.

[12] 劉雪輝, 張思, 張志旭, 等.大孔吸附樹脂純化薄荷總黃酮工藝優(yōu)選[J].食品與機(jī)械, 2016, 32(8): 156-158.

[13] 劉火安, 賈云, 戴傳云, 等.葛根總黃酮分離純化的研究[J].生物技術(shù)通訊, 2005(5): 522-524.

[14] 陳義勇, 張德謹(jǐn).烏飯樹葉黃酮超聲—微波輔助提取工藝的優(yōu)化[J].食品與機(jī)械, 2016(1): 148-153.

[15] 王立, 姚惠源.烏飯樹樹葉中黃酮類色素的提取與分離純化[J].食品與發(fā)酵工業(yè), 2004, 30(9): 120-125.

[16] 王立, 唐小舟, 姚惠源, 等.烏飯樹樹葉中黃酮類色素清除活性氧自由基的研究[J].食品科學(xué), 2005, 26(12): 98-102.

[17] 章海燕, 王立, 張暉.基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化的烏飯樹葉樹葉水溶性黃酮提取條件[J].食品工業(yè)科技, 2010, 31(2): 260-263.

[18] 劉穎, 魏元峰, 蔣偉, 等.大孔樹脂對(duì)黃芩黃酮吸附的初步研究[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 7(2): 28-30.

[19] 張靜.銀杏黃銅純化及生物活性研究[D].無錫: 江南大學(xué), 2010: 24-25.

[20] 孟凡欣, 蔣朝軍, 于笑坤, 等.刺五加多糖的提取及含量測(cè)定[J].食品工業(yè)科技, 2005, 26(7): 110-112.

[21] 王文平, 郭祀遠(yuǎn), 李琳, 等.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定野木瓜多糖中蛋白質(zhì)的含量[J].食品研究與開發(fā), 2008, 29(1): 115-117.

[22] LIU Yong-feng, LIU Jun-xi, CHEN Xiao-fen, et al.Prepar-ative separation and purification of lycopene from tomato skins extracts by macroporous adsorption resins[J].Food Chemistry, 2010, 123(4): 1 027-1 034.

[23] 王立, 姚惠源, 陶冠軍, 等.烏飯樹樹葉中槲皮素的提取分離與鑒定[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2005, 24(4): 89-91.