李子謙，文勇立*，齊沛森，安雅靜，李 鑄，艾 鷖，趙佳琦，李 強，安德科

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，成都 610041；2.四川省畜牧總站，成都 610041；3.金川縣畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，四川 金川 624100)

牦牛分布于我國青藏高原，我國占世界總量90%以上，是當(dāng)?shù)刂匾a(chǎn)生活資料及地方經(jīng)濟發(fā)展支柱。傳統(tǒng)牦牛飼養(yǎng)依靠純天然放牧，生產(chǎn)方式落后，經(jīng)濟效益較低。隨生產(chǎn)方式改進，逐漸開展牦牛舍飼、半舍飼養(yǎng)殖。但牦牛飼料易受霉菌毒素污染，影響健康和產(chǎn)品安全。因此，研究霉菌毒素對牦牛瘤胃發(fā)酵影響利于牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展。我國部分地區(qū)飼料及原料黃曲霉毒素B1（Aflatoxins B1，AFB1）含量達11.2 μg·kg-1，粕類達47.6 μg·kg-1[1]。一般選擇酵母細胞壁提取物（Yeast cell wall extract，YCW）和蒙脫石（Montmorillonite，MMT）作霉菌毒素脫毒劑。YCW結(jié)構(gòu)中β-葡聚糖（β-glucan）是吸附活性成分，可與霉菌毒素分子相互作用結(jié)合排出體外[2-3]。YCW中甘露寡糖（Mannan-oligosaccha?rides，MOS）可促進瘤胃有益菌增殖[4-6]。MMT在干燥條件下與AFB1間主要以離子偶極相互作用或交換陽離子/羰基氧配位結(jié)合，濕潤條件下主要以交換陽離子水化膜和羰基間形成氫鍵結(jié)合[7]。Seeling等對體外瘤胃微生物靜態(tài)培養(yǎng)表明，隨AFB1濃度增加，氨氮（NH3-H）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度及甲烷產(chǎn)量下降，且抑制羧甲基纖維素酶和微晶纖維素酶活性[8-10]。除pH、NH3-H、VFA等外，微量元素通過影響瘤胃微生物代謝與發(fā)酵性能關(guān)系密切[11]。有關(guān)吸附劑及AFB1對微量元素影響，朱金林等研究表明，不同吸附劑對微量元素具有不同程度吸附作用，僅見硒（Se）對其AFB1毒性具有緩解作用[12-14]。目前研究多基于體外試驗，涉及瘤胃氨氮（NH3-H）、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）及纖維素酶活性等報道較少[15]。另外，Kutz等吸附劑研究表明，水合鋁硅酸鈣鈉（HSCAS）可降低乳中黃曲霉毒素M1（Aflatoxins M1，AFM1）轉(zhuǎn)化率，YCW物可降低機體對AFB1吸收[16-17]。本研究以牦牛為試驗對象，在飼料中添加不同水平AFB1及3種吸附劑處理：MMT、YCW、MMT+YCW，分析AFB1和吸附劑對牦牛瘤胃發(fā)酵性能影響。旨為AFB1影響瘤胃性能相關(guān)研究積累資料，為反芻動物飼料安全和吸附劑應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要儀器：pH計8362sc(購自美國哈希公司)；漩渦振蕩器XH-B（購自上海汗諾儀器有限公司）；紫外可見分光光度計UV-9000S（購自上海元析儀器有限公司）；氣相色譜儀LC-20A（購自日本島津儀器公司）；超聲波細胞破碎儀JY92-IIN（購自寧波新芝生物科技股份有限公司）；恒溫水浴搖床WHY-2A（購自常州市華怡儀器制造有限公司）；iCAP6000全譜直讀型臺式ICP光譜儀（購自美國Thermo Fisher Scientific Inc.公司）。

主要試劑：AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%），購自以色列FERMENTEK公司；蒙脫石（＞95%），購自赤峰和明生化有限公司；酵母細胞壁提取物（甘露寡糖≥20%），購自安琪酵母股份有限公司；L-乳酸（≥98%）、偏磷酸（≥98%）、對羥基聯(lián)苯（≥99%）、微晶纖維素（≥99%）、羧甲基纖維素鈉（≥99%）、水楊苷（≥98%）、木聚糖（≥95%）、濃硝酸（≥68%）等，購自上海瀚思化工有限公司。

1.2 動物分組與處理

2017年9月在四川省阿壩藏族羌族自治州茂縣茂興牦牛養(yǎng)殖場選擇16頭健康、發(fā)育正常，36月齡公牦牛，平均體重為195.8 kg。試驗牦牛飼養(yǎng)管理條件一致，自由采食和飲水。日糧精粗比1∶4，精料為豆粕（40%）和玉米粉（60%）。試驗采用2因素4水平完全正交試驗設(shè)計法（見表1），對AFB1與吸附劑處理作主效應(yīng)方差分析，AFB1水平：A（20 μg·kg-1）、B（40 μg·kg-1），C（60 μg·kg-1）、對照組，吸附劑處理：Ⅰ（MMT 50 g·頭-1·d-1）、Ⅱ（YCW 50 g·頭-1·d-1）、Ⅲ（MMT 25 g·頭-1·d-1+YCW 25 g·頭-1·d-1）、對照組。投喂7 d。每天6:00，18:00兩次飼喂。每日6:00先將AFB1和吸附劑摻入一小撮精料中，混勻，待牦牛全部采食后，投喂剩余飼料。

表1 2因素4水平完全正交試驗設(shè)計Table 1 Two factors and four levels complete orthogonal design

1.3 樣品采集與制備

于第8天采集瘤胃液，飼喂后2 h，用負壓采集器，經(jīng)導(dǎo)管通過口腔食道，深入到瘤胃內(nèi)中部，為防止唾液污染，棄去前一部分，采集瘤胃液約100 mL。一部分樣品經(jīng)過4層紗布過濾，立即測定pH，分裝-72°C保存，用于NH3-N、VFA濃度測定；另一部分樣品不過濾，直接分裝-72°C保存，用于微生物蛋白（MCP）、纖維素酶活性（微晶纖維素酶、羧甲基纖維素酶、纖維二糖酶和木聚糖酶）測定。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 瘤胃發(fā)酵性能指標(biāo)測定

優(yōu)化對羥基聯(lián)苯法定量測定乳酸濃度，參照文獻[18]；比色法測定NH3-N濃度，參照文獻[19]；氣相色譜法外標(biāo)法測定VFA濃度，嘌呤法測定MCP濃度，參照文獻[20]；纖維降解酶活性測定參照文獻[21]。

1.4.2 瘤胃液微量元素的測定

取過濾瘤胃液5 mL于潔凈三角瓶中，加入約100 mL濃硝酸。先將電熱板溫度調(diào)至200℃低溫消解，待達到硝酸分解溫度后，將電熱板升溫至400℃。加熱期間瓶中液體低于20 mL時，可加入適量濃硝酸。待瓶內(nèi)液體澄清，所剩液體約5 mL時，取下冷卻，用10%硝酸于10 mL定容管中定容，收集濾液測定ICP-OES。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS作2因素4水平方差分析，估計因子效應(yīng)，用LSD作行多重比較。結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1對瘤胃發(fā)酵性能影響

由表2可知，AFB1顯著降低瘤胃pH、NH3-H、總VFA、乙酸、丙酸戊酸濃度、微晶纖維素酶、纖維二糖酶、木聚糖酶活性（P＜0.01或P＜0.05）。丁酸、MCP、乳酸濃度濃度、羧甲基纖維素酶活性隨AFB1濃度升高而降低（P＞0.05）。AFB1在60 μg·kg-1水平下，纖維二糖酶活性顯著低于對照組（P＜0.05），表明當(dāng) AFB1濃度達 60 μg·kg-1時，對該指標(biāo)影響具有統(tǒng)計學(xué)意義，為最低危害濃度；在40、60 μg·kg-1水平下，木聚糖酶活性顯著低于對照組（P＜0.05），表明當(dāng)AFB1濃度達到40 μg·kg-1時，對該指標(biāo)影響具有統(tǒng)計學(xué)意義，為最低危害濃度。

2.2 AFB1對瘤胃液微量元素含量影響

由表3可知，隨AFB1水平升高，瘤胃液Fe、Cu、Zn、Mn、Se含量極顯著或顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。

表2 AFB1對瘤胃發(fā)酵性能影響Table 2 Effect of AFB1 on the rumen fermentation performance

表3 AFB1對微量元素影響Table 3 Effect of AFB1 on trace elements (mg·L-1)

2.3 吸附劑對瘤胃發(fā)酵性能影響

由表4可知，3種吸附劑處理均不同程度降低乙丙比和提高總VFA、乙酸、丙酸、丁酸MCP濃度、羧甲基纖維素酶活性，效應(yīng)順序為Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ，但僅見YCW具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。

混合處理組（MMT+YCW）效果大于對照組和MMT組，但小于YCW組。

2.4 吸附劑對瘤胃液微量元素影響

由表5可知，3種吸附劑處理均不同程度降低Fe、Cu、Zn、Mn、Se含量（P＞0.05），其降低程度由高到低為Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅱ。

表4 吸附劑對瘤胃發(fā)酵性能影響Table 4 Effects of adsorbents on the rumen fermentation performance

表5 吸附劑對微量元素影響Table 5 Effects of adsorbents on trace elements(mg·L-1)

3 討 論

3.1 AFB1對瘤胃發(fā)酵性能影響

對照組pH為6.25，處于正常范圍[22]。處理組為5.51～5.83。Mould等研究指出，當(dāng)pH≤6.0時，纖維降解菌活性完全受抑制[23]。顯示牦牛瘤胃纖維降解受AFB1影響。齊琪基于瘤胃微生物體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AFB1對羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶和纖維分解菌酶活性有抑制作用[10]。本研究結(jié)果與體外試驗報道結(jié)果一致，表明AFB1降低牦牛瘤胃pH同時影響瘤胃纖維降解作用。對照組NH3-H濃度為8.96 mg·dL-1，處于正常范圍，處理組為6.77～7.22 mg·dL-1，低于正常范圍[24]。由于NH3-H濃度與蛋白利用率有關(guān)，表明AFB1影響牦牛蛋白利用率。Dengler等VFA轉(zhuǎn)運的分子機制研究認為，VFA與組織新陳代謝有關(guān)[25]，Jiang等通過瘤胃微生物體外靜態(tài)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)AFB1濃度升高，總VFA、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸濃度下降[26]，本試驗結(jié)果與其相符，因此驗證體內(nèi)試驗與體外試驗結(jié)果一致，顯示牦牛新陳代謝受到AFB1抑制。Mojtahedi等通過體外發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)在含有AFB1培養(yǎng)基中，干物質(zhì)消化率顯著降低[27-28]。Burmeister等采用主要成分為AFB1的霉菌毒素（AFs）粗提物，研究微生物對該粗提物敏感性，發(fā)現(xiàn)與MCP合成相關(guān)芽孢桿菌、梭菌和鏈霉菌受抑制[29]，與本研究AFB1影響MCP結(jié)果一致。目前未見AFB1對瘤胃乳酸濃度影響報道，但瘤胃乳酸濃度過高可引起動物急性酸中毒，還可導(dǎo)致動物出現(xiàn)瘤胃炎和肝水腫等疾病[30-32]。本研究發(fā)現(xiàn)AFB1影響乳酸代謝，可能引起牦牛酸中毒或發(fā)生瘤胃及肝臟疾病風(fēng)險。目前未見AFB1對微量元素影響相關(guān)研究，Se可以降低AFB1對動物毒性，但作用機制尚不明確[13-14]。本研究AFB1降低瘤胃液Se、Fe、Cu、Zn、Mn含量（P＞0.05），推測Se等微量元素與AFB1存在與吸附劑類似結(jié)合作用，可能在動物體內(nèi)與AFB1結(jié)合排出體外，降低瘤胃液中微量元素含量。

3.2 吸附劑對發(fā)酵性能影響

本研究通過測定瘤胃發(fā)酵性能等相關(guān)指標(biāo)分析MMT和YCW對AFB1吸附效果，表明兩種吸附劑具有較好作用。MMT屬硅鋁酸鹽類吸附劑，可以吸水膨脹形成觸變凝膠體，具有離子交換能力，且可以調(diào)節(jié)瘤胃微生物發(fā)酵。在飼料中添加硅鋁酸鹽類鈉基膨潤土，可使總VFA濃度升高[33-35]。本研究MMT提高總VFA濃度與其吸附作用和對瘤胃微生物調(diào)節(jié)作用有關(guān)。針對YCW吸附作用研究，Ehrlich等認為特殊鍵結(jié)方式和分子氫鍵使YCW中β-葡聚糖呈螺旋結(jié)構(gòu)可與多種霉菌毒素形成互補構(gòu)造，通過腸道排出動物體外[35-37]。同時，YCW中甘露寡糖（MOS）具有改善瘤胃菌群結(jié)構(gòu)和內(nèi)環(huán)境功能作用。陳志龍等研究表明，日糧中添加MOS顯著提高瘤胃中原蟲、真菌數(shù)量，提高VFA、MCP濃度[5-6]。本研究顯示YCW效果優(yōu)于MMT，可能因YCW在吸附AFB1同時，疊加其結(jié)構(gòu)中MOS對瘤胃菌群結(jié)構(gòu)有益生理效應(yīng)。朱金林等研究表明，吸附劑可以吸附Cu、Fe、Mn、Zn等微量元素，其中無機類吸附劑吸附效果顯著高于有機類[12]。本研究3種吸附劑處理均降低微量元素含量，且MMT效應(yīng)大于YCW，吸附劑雖可抑制AFB1毒性，同時也吸附動物所需微量元素，影響機體對微量元素利用。因此，生產(chǎn)上應(yīng)用吸附劑的同時，還應(yīng)考慮補充微量元素。由于YCW對AFB1吸附作用大于MMT，但對微量元素吸附作用小于MMT，說明YCW綜合效果較優(yōu)。

本研究中，當(dāng) AFB1 濃度為 20 μg·kg-1時，NH3-H、戊酸濃度及微晶纖維素酶活性差異顯著（P＜0.05），因此有必要在20 μg·kg-1以下范圍設(shè)置濃度梯度試驗，確定最低危害濃度。此外，目前尚未見吸附劑最優(yōu)劑量報道。本研究僅采用產(chǎn)品推薦劑量，應(yīng)通過兩種吸附劑濃度梯度試驗確定MMT與YCW最優(yōu)劑量；MMT+YCW處理組結(jié)果尚不能說明是否存在協(xié)同效應(yīng)，可能與未設(shè)置吸附劑濃度梯度有關(guān)。

4 結(jié)論

AFB1對牦牛瘤胃發(fā)酵具有負面影響，且濃度越高，影響越大；AFB1可降低瘤胃液微量元素含量；3種吸附劑處理均可抑制AFB1對牦牛瘤胃微生物毒性，其中YCW效果較優(yōu)。

[參考文獻]

[1] 劉鳳芝,李鋒,王永麗.2017年上半年我國部分地區(qū)飼料及飼料原料中霉菌毒素的污染狀況分析[J].糧食與飼料工業(yè),2017(11):46-50.

[2] Yiannikouris A,Poughon L,Cameleyre X,et al.A novel tech?nique to evaluate interactions between Saccharomyces cerevisiae cell wall and mycotoxins:Application to zearalenone[J].Biotech?nology Letters,2003,25(10):783-789.

[3] Yiannikouris A,André G,Buléon A,et al.Comprehensive confor?mational study of key interactions involved in zearalenone com?plexation with beta-D-glucans[J].Biomacromolecules,2004,5(6):2176-2185.

[4] Jawhara S,Habib K,Maggiotto F,et al.Modulation of intestinal inflammation by yeasts and cell wall extracts:Strain dependence and unexpected anti-inflammatory role of glucan fractions[J].Plos One,2012,7(7):e40648.

[5] 陳志龍,曾燕霞,王林,等.不同精粗比飼糧中添加甘露寡糖對綿羊體外瘤胃發(fā)酵的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2016,28(10):3292-3300.

[6] 郭婷婷,胡丹丹,金亞東,等.甘露寡糖對泌乳早期奶牛瘤胃發(fā)酵及生產(chǎn)性能影響的研究[J].飼料工業(yè),2017,38(17):56-60.

[7] Deng Y,Velázquez A L B,Billes F,et al.Bonding mechanisms between aflatoxin B and smectite[J].Applied Clay Science,2010,50(1):92-98.

[8] Seeling K,Lebzien P,Dnicke S,et al.Effects of level of feed intake and Fusarium toxin-contamina-ted wheat on rumen fermen?tation as well as on blood and milk parameters in cows[J].Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition,2006,90(3-4):103-115.

[9] Mojtahedi M,Mesgaran M D,Vakili S A,et al.Effect of aflatoxin b1on in vitro rumen microbial fermentation responses using batch culture[J].Annual Review and Research in Biology，2013,3(4):686-693.

[10] 齊琪.黃曲霉毒素B1對荷斯坦奶牛乳中黃曲霉毒素M1含量、生產(chǎn)性能及血液生化指標(biāo)的影響[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[11] Martinez A,Church D C.Effect of various mineral elements on in vitro rumen cellulose digestion[J].Journal of Animal Science,1970,31(5):982-990.

[12] 朱金林,齊德生.不同霉菌毒素吸附劑對維生素B2及Cu、Fe、Mn和Zn的吸附影響[J].飼料研究,2013(12):31-32.

[13] Iii J F G,Edds G T.Effect of dietary selenium on the metabolism of aflatoxin B 1,in turkeys[J].Food and Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association,1984,22(8):637.

[14] Griffin A C.Role of selenium in the chemoprevention of cancer[J].Advances in Cancer Research,1979,29:419-442.

[15] Edrington T S,Harvey R B,Kubena L F.Effect of aflatoxin in growing lambs fed ruminally degradable or escape protein sources[J].Journal of Animal Science,1994,72(5):1274-1281.

[16] Kutz R E,Sampson J D,Pompeu L B,et al.Efficacy of solis,NovasilPlus,and MTB-100 to reduce aflatoxin M1,levels in milk of early to mid lactation dairy cows fed aflatoxin B1[J].Journal of Dairy Science,2009,92(8):3959-3963.

[17] Firmin S,Morgavi D P,Yiannikouris A,et al.Effectiveness of modified yeast cell wall extracts to reduce aflatoxin B1 absorption in dairy ewes[J].Journal of Dairy Science,2011,94(11):5611-5619.

[18] 楊平平,甄玉國,鄭艷秋,等.優(yōu)化對羥基聯(lián)苯法定量測定瘤胃液中乳酸含量[J].畜牧與飼料科學(xué),2013,34(2):1-2,5.

[19] 馮宗慈,高民.通過比色測定瘤胃液氨氮含量方法的改進[J].畜牧與飼料科學(xué),2010(6):40-41.

[20] Hu W,Liu J,Ye J,et al.Effects of tea saponin on rumen fermenta?tion in vitro[J].Animal Feed Science and Technology,2005,120(4):333-339.

[21] 汪水平,王文娟.瘤胃纖維降解相關(guān)酶活性的測定[J].中國飼料,2006(11):31-32.

[22] 馮仰廉.反芻動物營養(yǎng)學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2004.

[23] Mould F L,?rskov E R.Manipulation of rumen fluid pH and its influence on cellulolysis in sacco,dry matter degradation and the rumen microflora of sheep offered either hay or concentrate[J].Animal Feed Science and Technology,1983,10(1):1-14.

[24] Mcallister T A,Cheng K J,Rode L M,et al.Digestion of barley,maize,and wheat by selected species of ruminal bacteria[J].Applied and Environmental Microbiology,1990,56(10):3146.

[25] Dengler F,Rackwitz R,Benesch F,et al.Bicarbonate-dependent transport of acetate and butyrate across the basolateral membrane of sheep rumen epithelium[J].Acta Physiologica,2014,210(2):403-414.

[26] Jiang Y H,Yang H J,Lund P.Effect of aflatoxin B1 on in vitro ruminal fermentation of rations high in alfalfa hay or ryegrass hay[J].Animal Feed Science and Technology,2012,175(1-2):85-89.

[27] Mojtahedi M,Mesgaran M D,Vakili S A,et al.Effect of aflatoxin B1 on in vitro rumen microbial fermentation responses using batch culture[J].Annual Review and Research in Biology,2013,3(4):686-693.

[28] Mathur C F,Smith R C,Hawkins G E.Growth and morphology of Streptococcus bovis and of mixed rumen bacteria in the presence of aflatoxin B1,in vitro[J].Journal of Dairy Science,1976,59(3):455-458.

[29] Burmeister H R,Hesseltine C W.Survey of the sensitivity of microorganisms to aflatoxin[J].Appl Microbiol,1966,14(3):403-404.

[30] Nagaraja T G,Titgemeyer E C.Ruminal acidosis in beef cattle:The current microbiological and nutritional outlook[J].Journal of Dairy Science,2007,90(Sl):17-38.

[31] Moya D,Calsamiglia S,Ferret A,et al.Effects of dietary changes and yeast culture(Saccharomyces cerevisiae)on rumen microbial fermentation of Holstein heifers[J].Journal of Animal Science,2009,87(9):2874-2881.

[32] Krause K M,Oetzel G R.Understanding and pre-venting suhacute ruminal acidosis in dairy herds:A review[J].Animal Feed Science and Technology,2006(126):215-236.

[33] Stephenson R G A,Huff J L,Krebs G,et al.Effect of molasses,sodium bentonite and zealot,on urea toxicity[J].Australian Journal of Agricultural Research,1992,43(2):301-314

[34] Salem F A,Soliman A S,Abdelmawla W S,et al.Effect of some feed additives to rations of growing sheep on growing perfor?mance,rumen fermentation,blood constituents and carcass char?acteristics[J].Annals of Agricultural Science Moshtohor,2000,38(4):1885-1904.

[35] Ehrlich W K,Davison T M.Adding bentonite to sorghum grainbased supplements has no effect on cow milk production[J].Australian Journal of Experimental Agriculture,1997,37(5):505-508.

[36] Diaz D E,Jr H W,Blackwelder J T,et al.Aflatoxin bindersⅡ:Reduction of aflatoxin M1 in milk by sequestering agents of cows consuming aflatoxin in feed[J].Mycopathologia,2004,157(2):233-241.

[37] Alexandros Y,Gwéna?lle A,Alain B,et al.Comprehensive confor?mational study of key interactions involved in zearalenone complexation with β-d-Glucans[J].Biomacromolecules,2004,5(6):2176-2185.