于天弘，Siva Bharath MERUGU＃，Hema NEGI＃，孫宋暄，丁云鶴，武正華*，李大偉，3**

（上海交通大學(xué) 1藥學(xué)院，上海200240；2生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院；3細胞工程及抗體藥物教育部工程研究中心，上海200240）

前梯度蛋白2（anterior gradient2，AGR2）是蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）家族的成員，具有促進蠑螈斷肢再生［1］、皮膚傷口愈合［2］和在胰腺組織再生的過程中激活表皮生長因子受體信號通路等作用［3］。AGR2也是一種腫瘤相關(guān)蛋白，在乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌等腫瘤組織中過表達［4－8］。細胞內(nèi)AGR2在腫瘤中與腫瘤增殖、存活、遷移、黏附、不良預(yù)后、耐藥等特性息息相關(guān)［9－12］。另外，在腫瘤組織中，AGR2可以被分泌至細胞外并能在腫瘤病人的血液和尿液中被檢測到［13－14］。細胞外的AGR2是腫瘤微環(huán)境中的重要參與者，已知的功能有導(dǎo)致前列腺基質(zhì)細胞的程序性死亡［15］，影響上皮細胞的極性和黏附，引起上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［16］，與血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）結(jié)合，增強 VEGF和 FGF形成二聚體的能力，繼而促進血管內(nèi)皮細胞和成纖維細胞向腫瘤組織遷移，引起血管生成［17］。這些特性都說明AGR2是一個潛在的抗腫瘤靶點。

本課題組通過雜交瘤技術(shù)制備了以AGR2為靶點的單克隆抗體，命名為18A4［18］。初步藥效實驗發(fā)現(xiàn)，18A4能夠抑制AGR2表達陽性的乳腺癌細胞的生長和遷移［19］，通過抑制血管生成的功能減緩了SKOV3卵巢癌細胞的裸鼠移植瘤的生長［17，20］。但18A4的藥理活性研究仍然存在拓展的空間。本研究運用兩種自身不表達AGR2的黑色素瘤細胞，將AGR2蛋白和18A4同時作用于細胞，觀察18A4抗體能否抑制細胞外AGR2引起的腫瘤細胞活性。

1 材 料

1.1 試 劑

單克隆抗體18A4，His標(biāo)簽AGR2蛋白由本實驗室構(gòu)建、表達、純化［2，18］。人黑色素瘤細胞 A375，小鼠黑色素瘤細胞B16-F10購自美國ATCC中心。DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清、青霉素-鏈霉素混合液；MTT、結(jié)晶紫（索萊寶生物科技有限公司）；細胞周期與細胞凋亡試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽、DAPI（美國Millipore公司）；兔抗人p53抗體（美國Proteintech公司）；鼠抗β-actin抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司）；IRDye 680CW標(biāo)記的羊抗兔抗體、IRDye 800CW標(biāo)記的羊抗鼠抗體（美國Odyssey公司）；Dylight488，Dylight594標(biāo)記的羊抗兔抗體（聯(lián)科生物有限公司）。

1.2 儀 器

FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）；酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國徠卡公司）；Odyssey雙色紅外激光成像儀（美國Li-Cor有限公司）。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

A375和B16-F10細胞分別在含10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基，37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的細胞進行實驗。細胞增殖、細胞周期、細胞遷移、細胞形態(tài)觀察實驗分成空白對照組和AGR2組（50，100 ng／mL）；18A4組（20μg／mL）及 AGR2＋18A4組（100 ng／mL AGR2＋20μg／mL 18A4）。Western blot和免疫熒光實驗分成空白對照組和阿霉素組（1μmol／L）；阿霉素＋AGR2組（1μmol／L阿霉素 ＋100 ng／mL AGR2）及阿霉素 ＋AGR2＋18A4組（1μmol／L阿霉素 ＋100 ng／mL AGR2＋20μg／mL 18A4）。

2.2 MTT法檢測AGR2和18A4抗體對A375和B16-F10細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，加藥，每組設(shè)8個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入5 mg／mL MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10 min使結(jié)晶溶解。酶標(biāo)儀測定490 nm下的吸收度，計算細胞生長的抑制率：抑制率＝（對照組吸收度的平均值－實驗組吸收度的平均值）／（對照組吸收度的平均值）×100%。

2.3 克隆形成實驗測AGR2和18A4抗體對A375和B16-F10細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期細胞，以每孔2×103個細胞接種于6孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，加藥。37℃、5%CO2培養(yǎng)10 d。吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌后每孔加入0.5%結(jié)晶紫500μL，染色30 min。PBS洗滌，拍照，計數(shù)。

2.4 流式細胞儀檢測AGR2和18A4抗體對A375和B16-F10細胞周期的影響

取對數(shù)生長期細胞，以每孔5×105個細胞接種于6孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，加藥。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。胰酶消化收集所有細胞，70%乙醇固定過夜。PBS洗滌后PI染色，37℃避光水浴30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。

2.5 劃痕實驗檢測AGR2和18A4抗體對A375和B16-F10細胞遷移的影響

取對數(shù)生長期細胞，以每孔1×106個細胞接種于6孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)至細胞長滿。換成0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基刺激24 h。用200μL槍頭在孔內(nèi)劃痕，PBS洗滌后加藥，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。在0 h和24 h，每個劃痕拍照4張，分析兩個時間點上劃痕寬度的變化。

2.6 鬼筆環(huán)肽染色檢測AGR2和18A4抗體對A375和B16-F10細胞形態(tài)的改變

取對數(shù)生長期細胞，以每孔2×105個細胞接種于含細胞爬片的12孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌后取細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌后加羅丹明交聯(lián)的鬼筆環(huán)肽，避光染色45 min。PBS洗滌，DAPI避光染色5 min?？篃晒獯銣鐒┓馄?，激光共聚焦顯微鏡鏡檢，拍照。

2.7 Western blot檢測 AGR2和 18A4抗體對A375和B16-F10細胞中p53表達量的影響

取對數(shù)生長期細胞，以每孔1×106個細胞接種于6孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化收集所有細胞，PBS洗滌后加入預(yù)冷、含蛋白酶抑制劑的NP40細胞裂解液裂解，每個樣品中加入等體積的5×上樣緩沖液，混勻，95℃水浴5 min，－20℃儲存?zhèn)溆?。樣品?jīng)10%SDS-PAGE分離，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜1 h。在5%脫脂奶中室溫振蕩封閉1 h。加1∶1 000稀釋的兔抗人p53抗體，鼠抗β-actin抗體，4℃孵育過夜，TNET溶液洗膜10 min×3次。加1∶5 000稀釋的IRDye 680CW標(biāo)記的羊抗兔抗體或IR Dye 800CW標(biāo)記的羊抗鼠抗體，室溫孵育1 h，TNE-T溶液（10 mmol／L Tris-base，2.5 mmol／L EDTA-2Na，50 mmol／L NaCl，0.1%Tween-20）洗膜 10 min×3次。雙色紅外激光成像儀掃膜，用Quantity One軟件分析蛋白條帶的深淺。

2.8 免疫熒光分析AGR2和18A4抗體對A375和B16-F10細胞中p53表達量的影響

取對數(shù)生長期細胞，以每孔2×105個細胞接種于含細胞爬片的12孔板。37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS洗滌后取細胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%Triton X-100通透15 min，5%羊血清封閉1 h。加1∶200稀釋的兔抗人p53抗體，室溫孵育2 h，PBS洗滌。加1∶500稀釋的 Dylight488或Dylight594標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫避光孵育1 h，PBS洗滌。DAPI避光染色5 min，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡鏡檢，拍照。

2.9 數(shù)據(jù)分析

用GraphPad Prism 5軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，對兩組樣本采用Student′sT-test比較差異顯著性。P＜0.05表示有顯著性差異。

3 結(jié) 果

3.1 18A4抗體對胞外AGR2引起的細胞增殖加快的抑制作用

運用MTT實驗測定細胞外AGR2和18A4對兩種黑色素瘤細胞A375和B16-F10增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入50 ng／mL AGR2刺激24 h僅顯著加快B16-F10的增殖，而100 ng／mL AGR2能同時顯著提高A375和B16-F10細胞的增殖，分別高于對照組生長率（34.74±7.69）%和（29.87±5.02）%。而在加入100 ng／mL AGR2的基礎(chǔ)上加入20μg／mL 18A4，與 AGR2組相比，兩種細胞的生長率均有顯著的降低，分別降低了（43.99±5.93）%和（33.63±6.48）%，如圖1所示。

用克隆形成實驗再次驗證MTT實驗的現(xiàn)象。與對照組相比，100 ng／mL AGR2單獨作用后，A375和B16-F10細胞形成克隆的數(shù)量分別顯著增加了（49.00±7.12）%和（36.67±7.77）%。而在100 ng／mL AGR2和20μg／mL 18A4同時作用的條件下，A375和B16-F10細胞形成克隆的數(shù)量與AGR2組相比分別減少了（32.00±8.64）%和（27.33±8.50）%，如圖1C，1D所示。兩項實驗均表明18A4抗體能抑制胞外AGR2引起的腫瘤細胞增殖加快。

Figure 1 Monoclonal antibody 18A4 blocked the proliferation enhancement induced by extracellular AGR2 in melanoma cells（ˉx±s，n＝3）A：MTT assay of AGR2 and mab 18A4 on the proliferation of A375 cells；B：MTT assay of AGR2 andmab 18A4 on the proliferation of B16-F10 cells；C：Colony formation assay of A375 and B16-F10 cells treated with AGR2，18A4 or a combination of them；D：Quantification of colony numbers in histograms*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001 vs control group，＃P＜0.05；＃＃＃P＜0.001 vs AGR2 group

3.2 18A4抗體對胞外AGR2引起的細胞周期改變的抑制作用

細胞增殖與細胞周期調(diào)控密切相關(guān)，故通過流式細胞儀檢測胞外AGR2與18A4抗體對兩種黑色素瘤細胞周期的影響。與對照組相比，AGR2組細胞的G1期比例分別減少了（10.02±1.92）%和（7.73±1.70）%，S期比例分別增加了（9.09±1.85）%和（8.01±1.23）%，統(tǒng)計結(jié)果表明 AGR2組與對照組存在顯著性差異。所以胞外AGR2能引起腫瘤細胞G1／S細胞周期轉(zhuǎn)化。而與AGR2組相比，AGR2＋18A4組細胞的G1期比例分別增加了（7.39±1.37）%和（7.60±1.40）%，S期比例分別減少了（6.78±1.12）%和（6.76±0.78）%，統(tǒng)計結(jié)果表明AGR2＋18A4組與AGR2組存在顯著性差異，如圖2所示。所以18A4抗體能抑制胞外AGR2引起的G1／S細胞周期轉(zhuǎn)化。

Figure 2 Monoclonal antibody 18A4 hindered the cell cycle transition induced by extracellular AGR2 in melanoma cells（ˉx±s，n＝3）A：Flow cytometry analysisof AGR2 andmab 18A4 on the cell cycle of A375 cells；B：Flow cytometry analysisof AGR2 andmab 18A4 on the cell cycle of B16-F10 cells；C：Statistical analysis of G1 and S phase distributions in histograms*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs AGR2 group

3.3 18A4抗體對胞外AGR2引起的細胞遷移加快和細胞形態(tài)變化的抑制作用

通過細胞劃痕實驗分析胞外AGR2和18A4抗體對細胞遷移的影響。結(jié)果表明，AGR2組細胞的遷移速度分別比對照組細胞提高了（27.88±8.61）%和（49.81±10.64）%，兩組間有顯著性差異。而AGR2＋18A4組細胞的遷移速度分別比AGR2組細胞降低了（21.21±8.36）%和（40.21±10.22）%，兩組間有顯著性差異，如圖 3A～3D所示。

細胞遷移與細胞形態(tài)的變化相關(guān)，進一步用鬼筆環(huán)肽染色法觀察AGR2和18A4抗體對兩種黑色素瘤細胞形態(tài)的影響。研究發(fā)現(xiàn)與對照組上皮細胞形態(tài)相比，AGR2組的細胞均呈現(xiàn)成纖維細胞的形態(tài)，而AGR2＋18A4組的細胞仍然維持上皮細胞的形態(tài)（圖3E，3F），說明胞外AGR2能夠改變腫瘤細胞的形態(tài)，而18A4抗體能抑制 AGR2的這一作用。

3.4 18A4抗體對胞外AGR2引起的p53表達量變化的抑制作用

選擇檢測抑癌基因p53的表達量來觀察胞外AGR2和18A4抗體對細胞信號的影響。為了更清晰地觀察p53表達量的變化，加入1μmol／L阿霉素來增加p53的表達量。Western blot結(jié)果顯示，阿霉素組A375和B16-F10細胞的p53表達量分別達到對照組表達量的（8.41±1.91）倍和（5.90±0.94）倍，上調(diào)明顯。與阿霉素組相比，阿霉素＋AGR2組細胞的p53表達量又明顯降低，分別是阿霉素組p53表達量的（27.33±4.15）%和（25.50±7.39）%，兩組間有顯著性差異，說明胞外AGR2降低了p53的表達量。而阿霉素＋AGR2＋18A4組細胞p53表達量與阿霉素＋AGR2組相比有明顯的回升，分別是阿霉素＋AGR2組p53表達量的（3.22±0.57）倍和（3.85±1.09）倍，兩組間有顯著性差異，說明胞外AGR2對p53表達量的影響被18A4抗體中和，如圖4A～4D所示。

為了再次驗證Western blot的結(jié)果，進一步用免疫熒光染色法檢測各組細胞的p53表達量。實驗結(jié)果與Western blot的結(jié)果類似，同時在兩種細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，阿霉素明顯提升了熒光強度，即p53表達量。阿霉素＋AGR2組細胞的熒光強度與阿霉素組相比明顯回落，而阿霉素＋AGR2＋18A4組細胞的熒光強度又明顯回升，如圖4E，4F所示。Western blot和免疫熒光的結(jié)果均說明胞外AGR2引起腫瘤細胞p53表達量降低的現(xiàn)象能被18A4抗體所抑制。

Figure 3 Monoclonal antibody 18A4 decreased themigration acceleration and morphological changes induced by extracellular AGR2 inmelanoma cellsA：Wound healing assay of AGR2 and mab 18A4 on themigration of A375 cells；B：Statistical analysis of A375 cellmigration in histograms；C：Wound healing assay of AGR2 andmab 18A4 on themigration of B16-F10 cells；D：Statistical analysisof A375 cellmigration in histograms；E：Cellmorphology staining of A375 cells with corresponding treatments；F：Cellmorphology staining of B16-F10 cells with corresponding treatments*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs AGR2 group

Figure 4 Monoclonal antibody 18A4 masked the decline of p53 expression level induced by external AGR2A：Western blot analysis of p53 expression in A375 cells with corresponding treatments；B：Western blot analysis of p53 expression in B16-F10 cells with corresponding treatments.β-actin was served as an internal control；C：Statistical analysis of the band intensities on Western blots as compared to β-actin bands in A375 cells；D：Statistical analysisof the band intensities onWestern blotsas compared toβ-actin bands in B16-F10 cells；E：Immunofluorescence assay of p53 expression in A375 cells；F：Immunofluorescence assay of p53 expression in B16-F10 cells*P＜0.05 vs control group；＃P＜0.05 vs AGR2 group

4 討 論

AGR2在多種腫瘤組織中過表達，細胞內(nèi)和細胞外AGR2均與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥等有關(guān)，所以AGR2是一個潛在的抗腫瘤靶點。雖然科學(xué)家們已經(jīng)提出了若干種抑制AGR2功能的策略，但是針對AGR2的藥物至今尚未出現(xiàn)［21］。故本研究探究了以AGR2為靶點18A4抗體能否抑制細胞外AGR2引起的腫瘤細胞活性。

首先通過MTT實驗和克隆形成實驗發(fā)現(xiàn)了18A4抗體能夠抑制細胞外AGR2引起的腫瘤細胞增殖加快，并進一步檢測胞外AGR2與18A4對細胞周期的影響。敲降細胞內(nèi)AGR2能夠讓乳腺癌和前列腺癌細胞阻滯在 G1期［22－23］，但胞外 AGR2能否影響細胞周期還是未知的。本研究中細胞周期檢測結(jié)果說明胞外AGR2的刺激能夠減少G1期細胞，增加S期細胞。更重要的，胞外AGR2對腫瘤細胞周期的調(diào)控能被18A4抗體抑制。

AGR2與腫瘤細胞的遷移有著緊密的聯(lián)系。敲降胞內(nèi)AGR2可減慢腫瘤細胞的侵襲性，反之，將AGR2轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞，細胞的遷移能力明顯增強［8，24－25］。同樣的，胞外 AGR2促進了上皮細胞的遷移，引起 EMT，加快傷口愈合［2，16］。所以本研究通過劃痕實驗和細胞形態(tài)染色檢測18A4能否緩解胞外AGR2導(dǎo)致的腫瘤細胞遷移加快和細胞形態(tài)變化。本研究結(jié)果證實18A4抗體具有減緩胞外AGR2引起的細胞遷移加快和形態(tài)變化。

p53是經(jīng)典的抑癌基因，超過半數(shù)的腫瘤組織中存在p53的突變和缺失［26］。Hrstka等［27］發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)AGR2通過雙特異性磷酸酶10（DUSP10，dual specificity protein phosphatase 10）的調(diào)控降低p53的活性，但胞外AGR2能否影響p53的表達還是未知的。本研究用阿霉素處理腫瘤細胞以增加p53的表達量，通過Western blot和免疫熒光染色說明胞外AGR2的刺激能夠降低 p53的表達量，而18A4抗體能夠穩(wěn)定p53的表達量，抑制AGR2對p53表達量的影響。

綜上所述，18A4抗體能夠抑制胞外AGR2引起的腫瘤細胞活性，包括增殖速度加快、G1／S細胞周期轉(zhuǎn)變、遷移速度加快、細胞形態(tài)的改變和p53表達量的降低，這些結(jié)果不僅延伸了18A4的藥理作用，也說明18A4是一種潛在的抗腫瘤藥物。

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