溫度對臨滄鐵殼麥種子生活力、發(fā)芽期α-淀粉酶活性及其基因表達(dá)的影響

周國雁，隆文杰，雷涌濤，陳 丹，蔡 青，伍少云

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650205)

α-淀粉酶活性決定了種子萌發(fā)、淀粉降解和收獲前發(fā)芽(pre-harvest sprouting，PHS)的水平[1]。遲熟α-淀粉酶(late maturity a-amylase，LMA)是一種在籽粒成熟中后期合成的具有高等電點(diǎn)(isoelectric poin，PI)的α-淀粉酶，在一些文獻(xiàn)中也作熟前α-淀粉酶(pre-maturity a-amylase，PMA)[2-4]提及，是影響小麥加工品質(zhì)和收獲前發(fā)芽的主要因素[2]。

小麥主要有3類α-淀粉酶同工酶[5]。第1類為TaAMY1[6]、AMY-1[1,7]或α-淀粉酶-1，由第6部分同源染色體長臂(6AL/BL/DL)的 amy1等位基因控制[1,7-8]，具有pH 6.3～7.5的高等電點(diǎn)[7,9]，主要存在于胚乳內(nèi)，在籽粒發(fā)芽前1～2 d開始表達(dá)[1]，也因此被稱為麥芽α-淀粉酶[7]。其活性約占發(fā)芽小麥籽?？偊?淀粉酶活性的84%[9]。第2類為TaAMY2[6]、AMY-2[1,7]或α-淀粉酶-2，存在于籽粒發(fā)育早期階段的果皮中，也因此被稱為發(fā)育或綠色α-淀粉酶[8]，由第7部分同源染色體長臂(7AL/BL/DL)的 amy2基因支配[1,7-8]，具有pH4.9～6.0的低等電點(diǎn)，在發(fā)芽期的第3天[1]或第5～6天[10]開始表達(dá)，對α-淀粉酶-1起輔助作用。這兩類是遺傳和功能已比較清楚、被廣泛描述的主要類型[6]。第3類是TaAMY3[6]，出現(xiàn)在籽粒發(fā)育的全過程，由第5染色體編碼，但對籽粒發(fā)芽的作用尚不清楚[10]。谷物籽粒的α-淀粉同工酶活性由環(huán)境、遺傳因子以及二者的相互作用共同影響[8]。在環(huán)境因子中，溫度的影響可能是最大且有害的[8]。在低溫緩慢干燥條件下，溫度僅能提高收獲前即將成熟小麥的籽粒α-淀粉酶含量，而生理成熟(physiological maturity，PM)后高溫可降低小麥籽粒的α-淀粉酶活性[11]。溫度也能強(qiáng)烈地影響小麥籽粒萌發(fā)過程中α-淀粉酶活性及其基因的相對表達(dá)量[12]，即α-淀粉酶活性和其基因表達(dá)量不僅與籽粒發(fā)芽時(shí)的溫度呈正相關(guān)，而且發(fā)芽小麥籽粒的α-淀粉酶活性還與籽粒發(fā)芽率呈顯著或極顯著正相關(guān)[13-14]。

臨滄鐵殼麥?zhǔn)请`屬云南小麥亞種(Triticumaestivumssp.yunnanense)的一個(gè)原始農(nóng)家品種，具有典型云南小麥亞種的斷穗、帶殼或包殼特征，可能還帶有強(qiáng)休眠和穗發(fā)芽抗性[15]基因，是改良和提高現(xiàn)代小麥生產(chǎn)品種穗發(fā)芽抗性的重要優(yōu)質(zhì)基因資源。因此，本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，研究經(jīng)不同溫度貯藏后，臨滄鐵殼麥發(fā)芽期的α-淀粉酶活性及其編碼基因表達(dá)量與貯藏溫度、貯藏時(shí)間及生活力指標(biāo)間的關(guān)系，可為有效保存、保護(hù)和再利用該小麥種質(zhì)資源提供酶學(xué)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物種子及貯藏處理

試驗(yàn)用植物種子為2005年繁殖、2006年1月保存于-7.5±2.5 ℃低溫種質(zhì)庫的臨滄鐵殼麥種子。其入庫時(shí)種子量約300 g，發(fā)芽率達(dá)97%。該試驗(yàn)材料為云南小麥亞種內(nèi)的農(nóng)家品種，于20世紀(jì)70年末80年代初期考察收集于云南省原臨滄地區(qū)臨滄縣(現(xiàn)臨滄市臨翔區(qū))，穗部特征為穎殼無毛、無芒、白殼、紅粒，在云南省的保存編號為云0006，國家統(tǒng)一保存編號則為XM0927。2016年1月初從種質(zhì)庫中取出已貯藏10年左右的臨滄鐵殼麥種子，用電子天平將其平均分成25份，每份約12 g，密封于10 cm×15 cm的鋁泊袋，并保留少量種子用于檢測其出庫時(shí)的發(fā)芽率(隨后測得為91%)。然后，將分裝好的種子分別貯藏在低溫1(LT1，-7.5±2.5 ℃，低溫種質(zhì)庫)、低溫2(LT2，7.5±2.5 ℃，低溫種質(zhì)庫)、室內(nèi)溫度(AT，木質(zhì)柜)和高溫(HT，40±1 ℃，恒溫箱)4種溫度條件下。但是，由于保持在低溫環(huán)境下的種子在短時(shí)間內(nèi)的生活力變化會很小，因此只在AT、LT1和LT2三種溫度條件下各放置5袋種子，而將另外10袋種子暫留在溫度LT1的種質(zhì)庫內(nèi)保存至高溫貯藏試驗(yàn)開始。高溫貯藏試驗(yàn)(2016年7月11日)開始時(shí)，將存放于LT1溫度下的10袋種子轉(zhuǎn)移至溫度HT的恒溫箱內(nèi)貯藏。

1.2 種子生活力指標(biāo)測定

按照農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T3543-1995)和貯藏種子的不同溫度對貯藏后的種子進(jìn)行定期發(fā)芽試驗(yàn)，以觀測其生活力的變化。其中，貯藏在HT條件下的種子每7 d一次，貯藏在其他3種溫度條件下的種子每2或3月1次。每次發(fā)芽試驗(yàn)用1袋種子，重復(fù)4次，每100粒種子為1次重復(fù)。種子在20±1 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)7 d，每天10:00 前記錄前一天發(fā)芽種子粒數(shù)，發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)測量10苗的苗高(芽長+根長，cm)。計(jì)算發(fā)芽勢(3 d內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)/N×100%)、發(fā)芽率(7 d內(nèi)的發(fā)芽種子數(shù)/N×100%)、發(fā)芽指數(shù)[GI=∑(Gi/Di)]、發(fā)芽速率(GR=[(7×N1+ 6 ×N2+ … + 1×N7)/(7 ×N)][16-17]和活力指數(shù)(VI=GI×S)5項(xiàng)生活力指標(biāo)。式中，N為參試種子總數(shù)，Gi為第Di天發(fā)芽的種子數(shù)，i=1、2、3…7，N1、N2、N3…N7為第1、2、3…7天發(fā)芽的種子數(shù)，S為平均苗高。

1.3 α-淀粉酶液提取與活性測定

1.3.1 α-淀粉酶液提取

取上述發(fā)芽7 d的種子，吸干表面水分，摘除根芽，稱取1 g，置于研缽內(nèi)，加2 mL蒸餾水，研磨至勻漿，然后轉(zhuǎn)入離心管，4 000 r·min-1離心10 min。取上清液，用蒸餾水定容至25 mL。

1.3.2 麥芽糖含量測定

由于發(fā)芽試驗(yàn)設(shè)置的發(fā)芽時(shí)間不同，因此在測定α-淀粉酶活性時(shí)需根據(jù)發(fā)芽種子批次單獨(dú)配制麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，并據(jù)此計(jì)算溶液的吸光值和麥芽糖含量，為每批發(fā)芽種子建立共享的吸光度(y)與麥芽糖含量(x)的線性回歸方程。然后，再以此回歸方程計(jì)算出待測樣品的實(shí)際麥芽糖含量，并用其估算待測樣品的α-淀粉酶活性。因此，試驗(yàn)期間共獲得6個(gè)方程：

y1=-0.021+0.265x(R2=0.995，P=0.006<0.01)

y2=-0.032+0.306x(R2=0.987，P=0.000<0.01)

y3=-0.021+0.283x(R2=0.997，P=0.000<0.01)

y4=-0.025+0.288x(R2=0.995，P=0.000<0.01)

y5=-0.027+0.276x(R2=0.994，P=0.007<0.01)

y6=-0.035+0.290x(R2=0.991，P=0.000<0.01)

1.3.3 α-淀粉酶活性測定

采用3, 5-二硝基水楊酸法測定α-淀粉酶活性。向4支試管(其中1支為對照，另3支為待測)各加入α-淀粉酶原液1 mL，70 ℃水浴15 min，取出用流水迅速冷卻；每管加入pH5.60的檸檬酸緩沖液1 mL，并向?qū)φ展芗尤?.4 mol·L-1氫氧化鈉溶液4 mL，各管均于40 ℃水浴15 min；每管都加入經(jīng)40 ℃預(yù)熱的1%淀粉溶液2 mL，搖勻，并立即放進(jìn)40 ℃恒溫水浴5 min；迅速向每管中加入0.4 mol·L-1的氫氧化鈉溶液4 mL；分別取每管中的酶促反應(yīng)液2 mL轉(zhuǎn)至25 mL試管，并加入3,5-二硝基水楊酸2 mL，沸水浴5 min。取出冷卻，以蒸餾水稀釋至25 mL，通過紫外分光光度計(jì)測量520 nm的吸光值。

待測樣品的吸光值為其實(shí)測值與對照樣品的實(shí)測值之差(A)。將A值代入上述各回歸方程，求得各待測樣品的實(shí)際麥芽糖含量。

將每克樣品孵化5 min后降解產(chǎn)生1 mg麥芽糖作為1單位的α-淀粉酶活性。即待測樣品α-淀粉酶活力(mg·g-1)=通過回歸方程求得的麥芽糖含量(mg)×淀粉酶原液總體積(mL)/樣品重(g)×5 min×顯色用酶液體積(mL)。

1.4 α-淀粉酶基因?qū)崟r(shí)定量PCR檢測

1.4.1 RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

取上述發(fā)芽的麥苗幼葉提取RNA?？俁NA的提取按照寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)的試劑盒(TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction Kit)使用指南操作。cDNA合成則按該公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTmⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說明操作，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 定量PCR引物篩選

為研究臨滄鐵殼麥種子發(fā)芽期的α-淀粉酶基因的相對表達(dá)量，對已報(bào)道[1,8,12]的目標(biāo)基因 amy1-2、 amy1和 amy2及其內(nèi)參基因actin、 α-Tubulin等引物，以及周飛[18]設(shè)計(jì)的引物，共12對引物(表1)進(jìn)行篩選，最終篩選出用于臨滄鐵殼麥α-淀粉酶基因表達(dá)研究的PCR引物：內(nèi)參基因?yàn)樾←渁ctin基因[19]的引物，目標(biāo)基因 amy1的引物為amy1-RT， amy3的引物為AMY-2[18](由于引物AMY-2的序列是根據(jù)GenBank編號x05809.1的α-淀粉酶基因序列設(shè)計(jì)的，而這個(gè)編號在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x05809.1中對應(yīng)的α-淀粉酶基因是 amy3，所以，由AMY-2檢測到的結(jié)果是基因 amy3的相對表達(dá)量)。

表1 用于研究小麥α-淀粉酶基因表達(dá)量的引物和序列Table 1 Primers and their sequences used for expression analysis of a-amylase gene in wheat

1.4.3 定量PCR擴(kuò)增

反應(yīng)采用寶生物工程(大連)有限公司的試劑盒[SYBR○RPremix Ex TaqTM(TIiRNaseH Plus)]。反應(yīng)體系20 μL：SYBR○RPremixExTaq(TIiRNaseH Plus)(2×)10 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1) 0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1) 0.4 μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 34 s。

1.5 數(shù)據(jù)處理

α -淀粉酶基因相對表達(dá)量2-△Ct和2-△△Ct值按文獻(xiàn)[20]的方法計(jì)算。采用IBM SPSS statistics 19統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差和雙變量相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的差異顯著性分析與檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子生活力隨貯藏溫度和時(shí)間的變化

種子生活力指標(biāo)(如發(fā)芽勢和發(fā)芽率等)隨種子貯藏溫度的升高和貯藏時(shí)間的延長而降低，種子逐步死亡。但在不同貯藏溫度下，種子生活力的下降速度明顯不同(表2)。在LT1和LT2條件下，5項(xiàng)生活力指標(biāo)雖然都有隨貯藏時(shí)間的延長而逐漸降低的趨勢，但在63、189、252和365 d 4個(gè)貯藏時(shí)間段間的變化均不明顯(F=0.393～2.555，P=0.128～0.761)。在AT條件下，除發(fā)芽勢在不同貯藏時(shí)段間的變化達(dá)到極顯著差異(F=7.675，P=0.004<0.01)外，其他4項(xiàng)指標(biāo)的變化均不明顯(F=1.335～2.056，P=0.162～0.323)。但是，在HT條件下，發(fā)芽率在7、14、21、28、35、42、49、56、63和70 d 10個(gè)貯藏時(shí)段間的差異都達(dá)到了顯著水平(F=2. 727，P=0.029<0.05)，而另外4項(xiàng)指標(biāo)則都達(dá)到了極顯著水平(F=3.887～7.308，P=0.000～0.005<0.01)。由此說明，貯藏種子的溫度越高，生活力指標(biāo)下降越快，種子保持高生活力的貯藏時(shí)間也越短。

2.2 α-淀粉酶活性隨種子貯藏溫度和時(shí)間的變化

由圖1可知，在相同貯藏時(shí)間內(nèi)，除第1貯藏階段(63 d)種子的α-淀粉酶活性在LT1、LT2和AT3處理間的差異不明顯外(P>0.05)，另外3個(gè)階段(189、252和365 d)α-淀粉酶活性至少在2種處理間存在顯著差異(P<0.05)；除第4階段(365 d)外，其他3個(gè)階段的α-淀粉酶活性隨種子貯藏溫度的升高呈逐步上升的趨勢。在相同的貯藏溫度下，低溫貯藏條件下種子的α-淀粉酶活性有隨貯藏時(shí)間延長而逐漸升高的趨勢；在AT條件下貯藏至第3階段(252 d)，或在LT1、LT2條件下貯藏至第4階段(365 d)的種子，其α-淀粉酶活性較前幾個(gè)貯藏時(shí)期有顯著升高；而貯藏在HT條件下的種子α-淀粉酶活性隨貯藏時(shí)間延長呈由高至低的顯著下降，且在貯藏至42 d及以后趨于穩(wěn)定。與在LT1 、LT2和AT條件下貯藏至第2階段(189 d，2016年1月初至7月11日，此日為高溫貯藏試驗(yàn)起始日)及第3階段(252 d，2016年1月初至2016年9月12日，此日為高溫貯藏試驗(yàn)結(jié)束日)的種子相比，在HT溫度條件下貯藏7～70 d的種子，其α-淀粉酶活性大都出現(xiàn)了顯著或極顯著(P<0.01)地上升，尤其是貯藏7～28 d的種子，其α-淀粉酶活性與貯藏在另外3種溫度條件下的第2、第3階段的種子的α-淀粉酶活性的差值達(dá)到4.239～12.810 mg·g-1。

表2 不同貯藏溫度和時(shí)間下臨滄鐵殼麥種子的生活力指標(biāo)Table 2 Viability indices of Lincang hulled wheat seed stored at different temperature and time

LT1:低溫1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:低溫2(7.5±2.5 ℃)；AT:室內(nèi)溫度；HT:高溫(40±1 ℃)。下同。

LT1:Low temperature(-7.5±2.5 ℃); LT2:Low temperature 2(7.5±2.5 ℃); AT:Ambient temperature; HT:High temperature(40±1 ℃). The same in other tables.

2.3 α-淀粉酶基因相對表達(dá)量(2-△△Ct )隨種子貯藏溫度和時(shí)間的變化

以貯藏在LT1條件下種子的相對表達(dá)量為對照。在第1貯藏階段，貯藏在LT2和AT條件下的種子發(fā)芽期 amy1基因的表達(dá)量只達(dá)到對照的43.8%和16.7%，極顯著降低；在第2貯藏階段(189 d)，分別相當(dāng)于對照的148.9%和299.0%，極顯著地升高；但在第3階段(252 d)，又分別相當(dāng)于對照的60.9%和110.4%，表現(xiàn)為極顯著下降或不明顯升高；在第4階段(365 d)，相當(dāng)于對照的131.2%和95.8%，上升或下降幅度差異不明顯。因此，與貯藏在LT1條件下的種子相比，貯藏在LT2和AT條件下種子的 amy1基因表現(xiàn)為貯藏開始時(shí)極顯著下調(diào)表達(dá)、貯藏中期極顯著上調(diào)表達(dá)、貯藏后期不明顯上調(diào)或下調(diào)表達(dá)。但是， amy3基因的相對表達(dá)量，在4個(gè)貯藏階段均表現(xiàn)為不明顯地下降，相當(dāng)于對照的53.5%～88.2%。由圖2可知，若以第1貯藏階段種子的相對表達(dá)量為對照，則貯藏在低溫(LT1和LT2)下的種子，其發(fā)芽期 amy1基因的相對表達(dá)量隨貯藏時(shí)間的延長而呈極顯著下調(diào)表達(dá)，分別相當(dāng)于對照的15.0%～26.2%和41.2%～70.5%。但是，在室溫及高溫貯藏條件下，隨貯藏時(shí)間的增加表現(xiàn)為開始時(shí)極顯著上調(diào)表達(dá)，然后再顯著或不顯著地下調(diào)表達(dá)，分別相當(dāng)于對照的96.1%～372.8%和93%～238%。由圖3可知，與 amy1基因的表達(dá)行為相反，在室溫及低溫(LT1和LT2)下貯藏的種子，其發(fā)芽期 amy3基因的相對表達(dá)量隨貯藏時(shí)間的推移先呈不顯著或極顯著上調(diào)表達(dá)，然后再顯著或不顯著地下降，分別相當(dāng)于各自對照(第1貯藏階段的種子的相對表達(dá)量)的1.11%～104.2%、72.9%～190.6%和1.5%～161.7%。在HT條件下，則表現(xiàn)為不顯著或顯著下調(diào)表達(dá)，相當(dāng)于對照表達(dá)量的53%～81%。

LT1:低溫1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:低溫2(7.5±2.5 ℃)；AT:室內(nèi)溫度；HT:高溫(40 ℃±1 ℃)。橫坐標(biāo)上的數(shù)字為儲藏天數(shù)。在同一貯藏溫度內(nèi)，圖注上不同字母表示在0.05水平上有顯著差異。

LT1:Low temperature 1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:Low temperature 2(7.5±2.5 ℃)；AT:Ambient temperature in Kunming；HT:High temperature(40 ℃±1 ℃). The digital on x-axis is days of seed stored. The different letters on the chart indicate significant differences at 0.05 levels in the same storage temperature.

圖1臨滄鐵殼麥種子發(fā)芽期α-淀粉酶活性隨貯藏種子的溫度和時(shí)間的變化

Fig.1Changesofα-amylaseactivityatgerminationstageinLincanghulledwheatseedswiththeincreaseofstoragetemperatureandtime

LT1:低溫1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:低溫2(7.5±2.5 ℃)；AT:室內(nèi)溫度；HT:高溫(40 ℃±1 ℃)。橫坐標(biāo)上的數(shù)字為儲藏天數(shù)。*和**表示在同一貯藏溫度內(nèi)不同貯藏期種子的 amy1基因相對表達(dá)量與對照(數(shù)值為1.000)間的差異分別達(dá)到0.05和0.01的顯著水平。圖3同。

LT1:Low temperature 1(-7.5±2.5 ℃)；LT2:Low temperature 2(7.5±2.5 ℃)；AT:Ambient temperature in Kunming；HT:High temperature(40 ℃±1 ℃). The digital on x-axis is days of seed stored. * and ** showed that differences between relative expression quantitation(REQ) of amy1 gene during storage marked within same temperature and REQ of control(1.000) are significant at 0.05 and 0.01 levels, respectively.The same in figure 3.

圖2amy1基因的相對表達(dá)量隨貯藏種子的溫度和時(shí)間的變化

Fig.2Changesofrelativeexpressionquantitationofamy1withtheincreaseofseedstoragetemperatureandtime

圖3 amy3基因的相對表達(dá)量隨貯藏種子的溫度和時(shí)間的變化

與在LT1和LT2溫度下貯藏189 d種子的相對表達(dá)量相比，貯藏在高溫條件種子的 amy1基因表現(xiàn)為不顯著、顯著或極顯著地上調(diào)表達(dá)，相當(dāng)于對照的107.5%～274.1%和72.2%～184.1%。但與在AT條件下貯藏189 d的種子相比，則呈極顯著、顯著或不顯著地下調(diào)表達(dá)，為對照的36.0%～91.7%。同樣，與在LT1、LT2和AT溫度下貯藏189 d的種子相比，貯藏在HT溫度下的種子，其 amy3基因表現(xiàn)為不顯著、顯著或極顯著下調(diào)表達(dá)，為對照的44.4%～84.6%、50.4%～96%和53.6%～102.1%。

2.4 a-淀粉酶活性及基因相對表達(dá)量(2-△Ct )與種子貯藏時(shí)間及生活力指標(biāo)間的相關(guān)性

由表3可知，隨著種子貯藏溫度的提高，有顯著相關(guān)性的觀測性狀或指標(biāo)的數(shù)目也隨之增多，但生活力指標(biāo)間的顯著相關(guān)性始終都是主要的。α-淀粉酶活性及基因相對表達(dá)量與種子的貯藏時(shí)間、生活力間的顯著或極顯著相關(guān)性，在不同的貯藏溫度間表現(xiàn)不同。在低溫條件下，無論是貯藏時(shí)間還是α-淀粉酶活性及其基因相對表達(dá)量與生活力指標(biāo)間均無明顯相關(guān)性，僅α-淀粉酶活性與 amy3基因的相對表達(dá)量間存在極顯著(r=-0.769)或顯著(r=-0.670)負(fù)相關(guān)，以及貯藏時(shí)間與 amy1(r= -0.823和r= -0.646)、 amy3(r=-0.889)基因的相對表達(dá)量間存在顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。在室溫和高溫條件下，貯藏時(shí)間、α-淀粉酶活性及其基因相對表達(dá)量不僅與生活力指標(biāo)間有顯著相關(guān)關(guān)系，而且α-淀粉酶活性同其基因相對表達(dá)量間的相關(guān)性也發(fā)生了改變，由低溫條件下與 amy3基因相對表達(dá)量呈極顯著或顯著負(fù)相關(guān)轉(zhuǎn)變?yōu)榕c amy3基因相對表達(dá)量呈極顯著(r=0.570)正相關(guān)、與 amy1基因相對表達(dá)量呈顯著(r=-0.543)或極顯著(r=-0.568)負(fù)相關(guān)；另外，貯藏時(shí)間與生活力指標(biāo)(r=-0.487～-0.559)、 amy3基因的相對表達(dá)量(r=-0.770和-0.436)及α-淀粉酶活性(r=-0.729)呈顯著和極顯著負(fù)相關(guān)。

另外，在室溫條件下，僅發(fā)芽率與 amy3基因相對表達(dá)量(r= 0.543)呈顯著相關(guān)性。而高溫條件下，除發(fā)芽率與α-淀粉酶活性和 amy3基因相對表達(dá)量呈顯著或極顯著正相關(guān)外，其他4項(xiàng)生活力指標(biāo)也均與這2個(gè)觀測指標(biāo)呈顯著或極顯著正相關(guān)。值得注意的是，無論在室溫還是高溫條件下，生活力指標(biāo)都只與 amy3基因而不是 amy1基因的相對表達(dá)量有顯著相關(guān)性。

表3 不同貯藏溫度下相關(guān)系數(shù)達(dá)到顯著或極顯著水平的指標(biāo)Table 3 Correlation coefficients reaching the significant level among observationindices of seeds stored at different storage temperature

括號內(nèi)的數(shù)字為相關(guān)系數(shù)；*和**分別表示達(dá)到0.05和0.01的顯著水平。

The number in brackets are correlation coefficients; * and ** mean significant at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

3 討 論

在昆明的氣候條件下，密封貯藏在室溫及低溫(-7.5±2.5 ℃和7.5 ℃±2.5 ℃)種質(zhì)庫的臨滄鐵殼麥種子，發(fā)芽期α-淀粉酶活性有隨種子貯藏溫度升高和貯藏時(shí)間延長而逐步升高的趨勢，與其他小麥種子隨萌發(fā)時(shí)間的延長而升高[12,21]的結(jié)果一致。而貯藏在高溫(40±1 ℃)條件下的種子，發(fā)芽期α-淀粉酶活性雖然隨貯藏時(shí)間的延長顯著下降，并在貯藏至42 d后趨于穩(wěn)定，但仍明顯地高于貯藏在低溫條件下的種子，高1.242～13.080 mg·g-1。因此，高溫貯藏處理明顯提升了臨滄鐵殼麥種子發(fā)芽期的α-淀粉酶活性，與朱美榮[22]利用晝35 ℃和夜27 ℃處理小麥種子7 d獲得的結(jié)果相似。

近年來的研究表明，α-淀粉酶基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄，除受到脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、油菜素內(nèi)酯(BR)和乙烯(ETH)等多種內(nèi)源激素及ABA/GAs的調(diào)控[23-25]外，也明顯與種子萌發(fā)過程中的溫度有關(guān)[12]。本研究中，貯藏在高溫條件下種子的 amy1基因表達(dá)量明顯高于貯藏在低溫(LT1和LT2)條件下189 d的種子，為LT1下的107.5%～274.1%和LT2下的72.2%～184.1%；而同樣貯藏在高溫條件下的種子，其 amy3基因表達(dá)量則僅分別相當(dāng)于在LT1、LT2和AT溫度條件下貯藏189 d種子的44.4%～84.6%、50.4%～96%和53.6%～102.1%。因此，溫度對 amy1和 amy3基因表達(dá)量的影響可能是不同的。高溫顯著提高 amy1基因的表達(dá)量，而顯著地降低 amy3基因的表達(dá)量。說明相同的種子貯藏溫度能明顯影響種子萌發(fā)過程中不同的α-淀粉酶基因的表達(dá)。但是，由于未篩選到用于研究 amy2基因相對表達(dá)量的PCR引物，因此，有關(guān)臨滄鐵殼麥或云南小麥亞種 amy2基因的相對表達(dá)量隨種子貯藏溫度、貯藏時(shí)間的變化，以及與生活力指標(biāo)之間的相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

貯藏在低溫條件下種子的α-淀粉酶活性與 amy3基因的相對表達(dá)量呈極顯著、顯著負(fù)相關(guān)，而貯藏在高溫條件下種子的α-淀粉酶活性又與 amy3基因相對表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)的關(guān)系，說明 amy3基因在高溫和低溫條件下的表達(dá)機(jī)制可能不同。另外，周 飛[18]設(shè)計(jì)的5對引物擴(kuò)增小麥品種川農(nóng)24和川農(nóng)27的cDNA，只有第1對引物(AMY-1)獲得了1條約1 300 bp的清晰條帶，未獲得引物AMY-2的擴(kuò)增條帶，而在本研究選用的小麥臨滄鐵殼麥中，僅引物AMY-2(而非AMY-1)獲得了清晰條帶，并且其擴(kuò)增曲線和熔解曲線與內(nèi)參基因擴(kuò)增引物獲得的結(jié)果一致。所以，臨滄鐵殼麥種子發(fā)芽期的 amy3基因可能與川農(nóng)24和川農(nóng)27的有一定差異。

本研究中貯藏在低溫條件下種子的生活力指標(biāo)與貯藏時(shí)間、α-淀粉酶活性及其基因相對表達(dá)之間無明顯相關(guān)性，而貯藏在高溫條件種子的生活力指標(biāo)均與貯藏時(shí)間、α-淀粉酶活性及其 amy3基因的相對表達(dá)量呈顯著或極顯著相關(guān)性，表明隨著貯藏溫度逐漸升高，種子生活力與貯藏時(shí)間、α-淀粉酶活性及其基因相對表達(dá)量間的關(guān)系也由不顯著變?yōu)轱@著或極顯著，由不緊密變?yōu)榉浅＞o密，即高溫提升種子生活力與貯藏時(shí)間、α-淀粉酶活性及基因表達(dá)量間的相關(guān)性。

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