馬曉雨 劉永佳 朱邦尚＊,,2

(1上海交通大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，上海 200240)

(2上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心，上海 200240)

羥基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2，Hydroxyapatite,HA),與人體內(nèi)骨組織和牙齒等礦化組織中的無機(jī)質(zhì)在化學(xué)成分和結(jié)構(gòu)上相似[1-4]，具有良好的生物活性和生物相容性[5-7]，可作為藥物載體用于藥物的負(fù)載和釋放[8-10]，在釋放藥物后可被人體降解吸收或全部隨糞便排出，被認(rèn)為是具有發(fā)展前景的生物活性材料之一。羥基磷灰石可被其他陰陽離子替換，通過摻雜不同的金屬元素(如 Mg2+、Cu2+、Sr2+、Zn2+等)或陰離子(CO32-、F-等)可使羥基磷灰石具有不同的形貌[2,11-12]，進(jìn)而影響其穩(wěn)定性、比表面積和對(duì)藥物的負(fù)載能力等[13-14]。

HA具有很好的生物相容性和生物安全性。同時(shí)，它的化學(xué)穩(wěn)定性很好，對(duì)許多藥物都不起化學(xué)反應(yīng)，可以作為多種藥物的緩釋載體使用。HA一般為納米實(shí)心棒狀結(jié)構(gòu)，不像碳納米管具有空腔結(jié)構(gòu)，載藥量不夠高(低于10%)，因此，人們采用與其它材料復(fù)合如殼聚糖或制備成微球結(jié)構(gòu)來解決上述問題[15-16]。但對(duì)直接從合成途徑設(shè)計(jì)對(duì)HA納米棒結(jié)構(gòu)進(jìn)一步改性，實(shí)現(xiàn)比表面面積的有效增加目前報(bào)道的還較少。鎂(Mg)與鈣(Ca)元素同屬堿土金屬即元素周期表中ⅡA族元素，化學(xué)性質(zhì)非常相近。Mg是人體必須的微量元素之一，對(duì)人體起著十分重要的作用，可參與催化人體內(nèi)200多個(gè)酶生物反應(yīng)過程，并且Mg在維持骨骼細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合骨骼韌性方面起了重要作用[17-18]。Mg取代羥基磷灰石中Ca的位置后，會(huì)使羥基磷灰石的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使羥基磷灰石的形貌和理化性質(zhì)發(fā)生改變[19]。近年來，已有文獻(xiàn)報(bào)道多種Mg摻雜的羥基磷灰石的合成方法，這些研究表明，Mg的摻雜對(duì)于羥基磷灰石的生物活性有明顯的提高。例如，Kalita[20]將氧化鎂和氧化鋅作為摻雜劑加入到羥基磷灰石前驅(qū)體粉末中，通過高溫固相合成了Mg/Zn-HA，其力學(xué)性能與生物活性均優(yōu)于單純的HA；Kim[21]利用化學(xué)共沉淀法合成了Si/Mg-HA，具有良好的生物活性，可用于骨填充材料。但是由于Mg與Ca的離子半徑與親水性都相似，會(huì)引起離子競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，降低產(chǎn)物的結(jié)晶度[22-23]。

本文擬利用與鈣元素化學(xué)和生物學(xué)性能相近的鎂元素?fù)诫sHA,Ca10(PO4)6(OH)2分子結(jié)構(gòu)中Ca部分被Mg取代形成MgxCa10-x(PO4)6(OH)2復(fù)合物，能在HA納米棒狀結(jié)構(gòu)上形成缺陷，從而增大HA比表面積和提高生物化學(xué)活性，對(duì)于載藥能力的有效提高和藥物的緩釋能起重要作用。研究通過逐步化學(xué)沉淀反應(yīng)和Mg2+、Ca2+離子置換反應(yīng)一鍋法制備了一系列不同含量鎂摻雜的納米羥基磷灰石(Mg-HA)。將以 Mg(NO3)2·6H2O 和(NH4)2HPO4發(fā)生反應(yīng)形成納米羥基磷酸鎂為前驅(qū)體，進(jìn)一步滴加Ca(NO3)2·4H2O和(NH4)2HPO4溶液最終形成Mg-HA。對(duì)其納米粉體的理化特性、生物學(xué)性能進(jìn)行表征，選擇化療藥物順鉑 (Cisplatin，cDDP)作為模型藥物，評(píng)價(jià)新型Mg-HA納米材料載藥特性及其在藥物載體方面的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料與試劑

四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O，AR)，六水合硝酸鎂(Mg(NO3)2·6H2O，AR)，磷酸氫二銨((NH4)2HPO4，AR)，二甲亞砜(C2H6SO，dimethyl sulfoxide，DMSO)均購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃氨水(含量(以NH3計(jì))25%～28%，AR)購于上海聯(lián)試有限公司；1,1,1-三羥甲基乙烷(1,1,1-tris(hydroxymethyl)ethane，TME，97%)，順鉑(cis-diammineplatinumギ dichloride,cDDP，Pt 65%) 均購于 Alfa Aesar；胎牛血清(FBS)、DMEM干粉培養(yǎng)基 (高糖)、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液、非必需氨基酸以及磷酸鹽緩沖液(PBS)、3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide (MTT試劑)均購于Sigma-Aldrich。

1.2 Mg-HA的制備

通過逐步化學(xué)沉淀反應(yīng)一鍋法制備鎂摻雜的納米羥基磷灰石。250 mL燒瓶中加入10 mL濃度為 33.4 mmol·L-1的 Mg(NO3)2·6H2O 溶液，加入 1%(w/w)TME，磁力攪拌條件下加熱至85℃，緩慢滴加10 mL 濃度為 20 mmol·L-1的(NH4)2HPO4溶液。用濃氨水調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液的pH值為8.5左右。保持反應(yīng)3 h后，向體系中滴加物質(zhì)的量濃度為33.4 mmol·L-1的Ca(NO3)2·4H2O溶液，其中Ca與Mg的物質(zhì)的量比控制為 1∶1、2.5∶1、5∶1 和 7.5∶1，反應(yīng) 3 h 后再向體系中滴加濃度為20 mmol·L-1的(NH4)2HPO4溶液,保證(nCa+nMg)/nP=1.67。反應(yīng)保持24 h，陳化12 h以上，用超純水去除多余的TME，冷凍干燥后得到Mg-HA。

1.3 Mg-HA的結(jié)構(gòu)與性能表征

利用透射電鏡 (TEM，Tecnai G2 Spirit型，美國(guó)FEI公司)觀測(cè)樣品的形態(tài)和大小，工作電壓為120 kV。利用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，Nicolet 6700型，美國(guó)Nicolet公司)表征其化學(xué)結(jié)構(gòu)；樣品用溴化鉀(KBr)壓片法制樣，透射模式檢測(cè)，檢測(cè)范圍為4 000～400 cm-1。 利用 X 射線衍射儀(XRD，D/max-2200/PC型，日本Rigaku公司)表征物相結(jié)構(gòu)，檢測(cè)條件為銅靶(λ=0.154 05 nm)，電流 20 mA，電壓 40 kV，掃描速率 0.02°·s-1，掃描范圍：2θ=5°～80°。 樣品的比表面積和孔隙度通過比表面積孔隙度及化學(xué)吸附分析儀(ASAP 2010 M+C型，美國(guó)Micromeritics公司)檢測(cè)；樣品經(jīng)過100℃除濕處理后，以Brunauer-Emmett-Teller(BET)模型分析計(jì)算樣品的比表面積數(shù)據(jù)，并通過脫附等溫線計(jì)算得到孔結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)。利用電感耦合等離子光譜發(fā)射光譜儀(ICP，iCAP6300型，美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司)定量分析樣品中Ca、Mg和P元素的含量；樣品的熱穩(wěn)定性通過熱重分析儀 (TGA，Pyris1型，美國(guó)PerkinElmer儀器公司)檢測(cè)；稱取一定量的樣品，置于氧化鋁坩堝中，N2氣氛，檢測(cè)溫度范圍為40～900℃，升溫速率為 20 ℃·min-1。

1.4 Mg-HA/cDDP的制備與體外藥物緩釋性能評(píng)價(jià)

稱取 10 mg Mg-HA(nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1 和 7.5∶1)加入到5 mL PBS(pH=7.4)中超聲均勻分散。稱取15 mg順鉑(cDDP)溶于DMSO與PBS混合溶液中(VPBS∶VDMSO=4)，逐滴滴入 Mg-HA 分散液中，在 37 ℃條件下保持24 h使順鉑充分吸附在Mg-HA上；然后，離心分離、冷凍干燥后得到裝載順鉑的Mg-HA。用ICP測(cè)定鉑元素含量計(jì)算出上清液中未被吸附順鉑的濃度C1，已知初始的順鉑濃度為C0，溶液體積為V，載藥樣品總質(zhì)量為m，裝載藥物質(zhì)量為m0，則樣品的載藥量通過以下公式計(jì)算得出：

藥物緩釋效果測(cè)定：稱取4 mg Mg-HA/cDDP樣分散在2 mL PBS(pH=5.5或pH=7.4)中，并置于透析袋中 (截留分子量為1 kDa)。將透析袋置于30 mL pH=5.5或7.4的PBS(含2 mL DMSO助溶)中(37℃，12 000 r·min-1)， 分別在 0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48和72 h時(shí)取樣ICP檢測(cè)緩釋藥物，將透析袋外液體全部移除，重新加入30 mL PBS(含2 mL DMSO 助溶)，(pH=5.5 或 pH=7.4)。

載藥量與釋藥量測(cè)定數(shù)據(jù)是3組平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)選用的L929(小鼠成纖維細(xì)胞)細(xì)胞系與HeLa(人宮頸癌細(xì)胞)細(xì)胞系購于中科院上海細(xì)胞庫。其培養(yǎng)方法如下：用含有10%(V/V)胎牛血清(FBS)、100 units·mL-1鏈霉素、100 units·mL-1青霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，置于75 cm2的培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)瓶置于溫度為37℃，含有5%CO2(V/V)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d細(xì)胞進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)操作。

1.6 Mg-HA的體外細(xì)胞毒性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞胰酶消化制成細(xì)胞懸液，使用DMEM培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行稀釋，細(xì)胞密度約為每毫升5×104個(gè)，小心接種于96孔板，每孔中加入200 μL細(xì)胞懸液，使每孔中含有約1×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入50 μL一系列不同濃度的Mg-HA(PBS配制),濃度依次為0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40 和 80 μg·mL-1，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積PBS，置于37℃、含有5%(V/V)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h后，吸出培養(yǎng)液，再加入PBS小心清洗96孔板2次后，每孔加入200 μL新鮮的DMEM培養(yǎng)基，然后加入用PBS配制的濃度為 5 mg·mL-1的 MTT溶液 20 μL，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后棄去培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL DMSO，振板 10 min，通過酶標(biāo)儀測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光度值。每組有6個(gè)平行孔(n=6)，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.7 Mg-HA/cDDP對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率

按1.6所述方法于96孔板中接種細(xì)胞培養(yǎng)24 h，分別加入50 μL Mg-HA/cDDP溶液，梯度濃度以順鉑濃度計(jì)算， 設(shè)為 0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40和 80 μg·mL-1，每個(gè)濃度設(shè)置 5 個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組加入等體積PBS，置于37℃、含有5%(V/V)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液，再用PBS小心清洗96孔板2次后，每孔加入200 μL新鮮的DMEM培養(yǎng)基，再加入用PBS配制的濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后棄去培養(yǎng)液，每孔加入 150 μL DMSO，振板10 min，通過酶標(biāo)儀測(cè)每孔在490 nm波長(zhǎng)下的光密度值(Optical density，OD)，OD實(shí)表示實(shí)驗(yàn)組 OD 平均值，OD空表示空白組OD平均值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(η)。

對(duì)照組為單獨(dú)作用順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。每組有6個(gè)平行孔(n=6)，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌與尺寸分析

通過TEM能清楚觀察到不同投料物質(zhì)的量比制得的鎂摻雜羥基磷灰石(nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1 和7.5∶1)的形貌和尺寸大小，以及鎂摻雜量對(duì)納米顆粒形態(tài)和尺寸的影響(圖1)。如圖1a所示，羥基磷灰石的形貌為長(zhǎng)500～600 nm，直徑為50～100 nm的棒狀結(jié)構(gòu)。摻雜鎂后的羥基磷灰石在形貌上與羥基磷灰石相比發(fā)生了較大變化(如圖1(b～e))，產(chǎn)物的尺寸為 300～400 nm，直徑約為 100～200 nm，外觀上有束狀納米纖維，呈稻草狀結(jié)構(gòu)，在更高的放大倍數(shù)下 (圖1d′)，可以觀察到其束狀形態(tài)是由許多直徑10 nm左右的定向排列納米纖維組成；電子衍射圖譜中的衍射環(huán)清楚地表明其為各向異性的多晶結(jié)構(gòu)。當(dāng)投料比 nCa∶nMg=1∶1(圖 1b)，2.5∶1(圖 1c)時(shí)，其納米纖維并不明顯，隨著Mg比例的減小，當(dāng)投料比nCa∶nMg=5∶1(圖 1d)，7.5∶1(圖 1e)時(shí)產(chǎn)物外觀上的纖維狀結(jié)構(gòu)趨于明顯，并且產(chǎn)物形貌的均一性較好。

圖1 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的TEM圖Fig.1 TEM images of Mg-HA particles synthesized at different feeding molar ratios

2.2 結(jié)構(gòu)與性質(zhì)分析

根據(jù)不同投料物質(zhì)的量比所制得的Mg-HA的XRD衍射峰(圖2)與純羥基磷灰石的衍射峰相符合，并且隨著Mg在產(chǎn)物中的比例增加，產(chǎn)物的晶型的混亂度也有所增加，與文獻(xiàn)報(bào)道的規(guī)律相符合[25]。在投料物質(zhì)的量比為2.5∶1時(shí)，可以明顯看到有雜質(zhì)峰的存在，為Mg3(PO3)2·5H2O 前體導(dǎo)致[26]，說明在投料比為2.5∶1時(shí)，有部分Mg離子在被Ca離子替換出來后，未能繼續(xù)參與反應(yīng)。其他不同投料比的條件下，由于雜質(zhì)含量較低，并不能明顯觀測(cè)到雜質(zhì)峰。

圖3是不同比例的Mg-HA的紅外吸收譜圖。譜圖中2 800～3 600 cm-1的寬峰以及1 635 cm-1左右的吸收峰是產(chǎn)物中的羥基或吸收空氣中的水的羥基O-H鍵振動(dòng)吸收峰。1 430 cm-1處的峰是羰基C=O的吸收峰，表明了樣品在制備過程中，空氣中的CO2可能參與了反應(yīng)，形成了碳酸根離子(CO32-)。927～1 160 cm-1處的單峰是由磷酸根離子(PO43-)中P-O的ν3伸縮振動(dòng)造成的。497～608 cm-1處的雙峰則是由于磷酸(PO43-)的ν4彎曲振動(dòng)造成的[27]。

圖2 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的XRD圖Fig.2 XRD patterns of Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

圖3 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的FTIR圖譜Fig.3 FTIR spectra of the Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

表1是不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的比表面積數(shù)據(jù)，其中羥基磷灰石的比表面積為43 m2·g-1，而不同投料物質(zhì)的量比的鎂摻雜羥基磷灰石的比表面積均大于羥基磷灰石，約為2～3倍，這可能是受到其表面的大量納米纖維結(jié)構(gòu)的影響，極大的增大了鎂摻雜羥基磷灰石的比表面積。

為了驗(yàn)證最終產(chǎn)物中的Ca與Mg的含量是否與實(shí)際投料比相一致，用ICP來定量檢測(cè)樣品中Ca、Mg 和 P。結(jié)果如表 2 所示。所有產(chǎn)物中 nCa∶nMg的實(shí)際比值均大于投料比，分別為6.94，3.64，7.90，9.56(其對(duì)應(yīng)的 nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1 和 7.5∶1)。 說明在反應(yīng)過程中，被鈣離子置換出來的鎂離子有部分未能重新參與反應(yīng)。 當(dāng) nCa∶nMg=5∶1，7.5∶1 時(shí) Ca∶Mg 的實(shí)際比值較為接近。羥基磷灰石的nCa/nP的理論值為 1.67，當(dāng) nCa∶nMg=5∶1，7.5∶1 時(shí)，檢測(cè)出的(nCa+nMg)/nP的數(shù)值均接近于理論值，分別為1.64，1.67，此時(shí)產(chǎn)物中的實(shí)際鎂含量分別為2.26%和2.17%(w/w)。

通過不同投料比制得的 Mg-HA(nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1 和 7.5∶1)的熱穩(wěn)定性熱失重曲線如圖 4 所示，隨著Mg在產(chǎn)物中的比例增加，樣品的熱穩(wěn)定性也逐漸增加。在30～800℃的升溫范圍內(nèi)，Mg-HA和HA的失重主要為表面吸附的水失重 (0～200℃，體中的晶格水失重(200～400℃)和羥基磷灰石中羥基的失重(600～800℃)[28]。所制得的Mg-HA的熱穩(wěn)定性均較好，在30～800℃的升溫范圍內(nèi)，失重均小于10%。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過逐步反應(yīng)一鍋法可以獲得這種形貌尺寸可控的鎂摻雜的納米羥基磷灰石。其離子置換的過程可能為：

圖4 TGA分析不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的熱穩(wěn)定性Fig.4 Thermal stability of the Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

表1 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的比表面積、孔徑、孔容數(shù)據(jù)Table 1 Specific surface area,pore volume,and average pore diameter of Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

表2 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石的元素Ca、Mg、P組成分析Table 2 Chemical analysis of Ca,Mg and P in Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios

2.3 Mg-HA的體外細(xì)胞毒性

通過MTT法測(cè)定不同Ca和Mg的投料比制得的Mg-HA對(duì)L929細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性。結(jié)果如圖5所示，隨著Mg-HA濃度的增加和孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，材料對(duì)L929細(xì)胞系的毒性略有增加，但最終細(xì)胞存活率都保持在80%以上，結(jié)果表明所制得的鎂摻雜的納米羥基磷灰石對(duì)于L929細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒性較低，具有較好的生物相容性。

圖5 不同投料比制得的鎂摻雜羥基磷灰石以不同濃度梯度與L929細(xì)胞共同培養(yǎng)不同時(shí)間后相對(duì)細(xì)胞活性的數(shù)據(jù)圖Fig.5 Relative cell activity of L929 cells against Mg-HAs synthesized at various feeding molar ratios compared with HA at different concentrations with different times

2.4 Mg-HA/cDDP的載藥量與釋藥量的結(jié)果分析

不同投料比制得的 Mg-HA(nCa∶nMg=1∶1、2.5∶1、5∶1和7.5∶1)的載藥量隨著鎂的比例的增加，載藥量有升高的趨勢(shì)，這與材料上的纖維狀的結(jié)構(gòu)及其比表面積有關(guān)(圖 6)。 其中(nCa∶nMg=5∶1 的 Mg-HA 載藥量最高，為54.84%，所合成的Mg-HA的載藥量均大于羥基磷灰石HA的載藥量。

羥基磷灰石對(duì)于順鉑藥物的負(fù)載主要為吸附原理，Kawasaki[29]認(rèn)為羥基磷灰石表面有2種吸附位置：① Ca位置：當(dāng)羥基磷灰石表面為OH-時(shí)，該位置連著2個(gè)Ca2+，當(dāng)在水溶液中，OH-至少在一瞬間空缺，該位置便形成了1個(gè)可吸附陰離子如PO43-、羧基等的吸附位置；②P位置：當(dāng)羥基磷灰石表面為Ca原子時(shí)，該位置周圍連著6個(gè)O原子，在水溶液中，表面的Ca位置至少在一瞬間空缺，該位置便形成了1個(gè)可吸附陽離子如Sr2+、K+等的吸附位置。因此，在羥基磷灰石負(fù)載順鉑時(shí)，主要原理為順鉑中心的二價(jià)鉑通過該吸附原理吸附在羥基磷灰石的P位置。摻雜鎂元素后，會(huì)導(dǎo)致羥基磷灰石的結(jié)構(gòu)缺陷，更有利于順鉑的吸附負(fù)載。

綜合上述物理化學(xué)性能表征的結(jié)果，以及載藥量的測(cè)試結(jié)果，我們選定投料比nCa∶nMg=5∶1制備的鎂摻雜羥基磷灰石(實(shí)際鎂含量為2.26%(w/w))作為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

圖6 不同比例的鎂摻雜羥基磷灰石對(duì)順鉑藥物的載藥量Fig.6 Drug loading rate of Mg-HA materials synthesized at different feeding molar ratios(nCa∶nMg)with cDDP in comparison with HA

圖7 為在pH=5.5和pH=7.4條件下測(cè)定Mg-HA/cDDP的藥物緩釋曲線。72 h后材料在pH=7.4和5.5時(shí)順鉑藥物累積釋放量分別達(dá)到29.77%和41.72%(w/w)。表明鎂摻雜羥基磷灰石對(duì)順鉑有一定的緩釋效果，在pH=5.5條件下藥物累積釋放量高于pH=7.4時(shí)，表明該負(fù)載藥物后的材料在腫瘤部位的微酸環(huán)境[30-32]中能有較好的藥物緩釋結(jié)果。

圖7 鎂摻雜羥基磷灰石(含2.26%鎂元素)在pH=5.5和7.4時(shí)的藥物緩釋曲線Fig.7 Drug releasing rate of Mg-HA(with 2.26%Mg)materials with cDDP at pH=5.5 and 7.4

2.5 Mg-HA/cDDP對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

圖8 鎂摻雜羥基磷灰石(含2.26%鎂元素)載順鉑后以不同濃度梯度(以順鉑計(jì))與HeLa細(xì)胞共同培養(yǎng)后相對(duì)細(xì)胞活性的數(shù)據(jù)圖Fig.8 Relative cell activity of HeLa cells against Mg-HA/cDDP(with 2.26%Mg)at different concentrations for cDDP

如圖 8 所示，Mg-HA(nCa∶nMg=5∶1，實(shí)際鎂含量為2.26%)負(fù)載順鉑藥物后對(duì)HeLa細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng)，順鉑濃度的增加，對(duì)HeLa細(xì)胞增殖抑制作用也在增加。80 μg·mL-1載cDDP藥物的Mg-HA(以cDDP計(jì))與細(xì)胞共孵育24和48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為80.46%，87.79%。證明Mg-HA負(fù)載順鉑后能具有很好抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。

如圖9所示，單獨(dú)作用順鉑對(duì)HeLa細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用。隨著作用時(shí)間的增長(zhǎng)以及順鉑濃度的增加，對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖抑制作用也變得顯著。80 μg·mL-1cDDP藥物與細(xì)胞共孵育 24、48和 72 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為78.43%、89.11%和88.65%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與利用Mg-HA/cDDP作用于HeLa細(xì)胞對(duì)其的生長(zhǎng)抑制率相一致，證明所制得的Mg-HA作為藥物載體不會(huì)影響抗癌藥物的藥效。

圖9 順鉑(cDDP)以不同濃度梯度與HeLa細(xì)胞共同培養(yǎng)后相對(duì)細(xì)胞活性的數(shù)據(jù)圖Fig.9 Relative cell activity of HeLa cells against cDDP at different concentrations

3 結(jié) 論

本研究使用了逐步反應(yīng)步驟一鍋法合成了鎂摻雜的納米羥基磷灰石，通過調(diào)節(jié)Ca和Mg的投料比，能有效地調(diào)控Mg-HA的形貌和尺寸，其中當(dāng)nCa∶nMg=5∶1 時(shí)，產(chǎn)物的形貌均一性較好，比表面積較大，有利于藥物的負(fù)載，此時(shí)所制得的Mg-HA中Mg的實(shí)際含量為2.26%。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明所制備材料的體外細(xì)胞毒性較低，具有良好的生物相容性。選擇nCa∶nMg=5∶1的Mg-HA作為藥物載體負(fù)載抗癌藥物順鉑，載藥率為54.84%，載藥性能比HA有了較大提升，且在pH=5.5時(shí)，能有較好的藥物緩釋效果。材料負(fù)載藥物后仍能對(duì)HeLa細(xì)胞有較好的生長(zhǎng)抑制效果，80 μg·mL-1藥物與細(xì)胞共孵育24和48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為80.46%和87.79%，其結(jié)果與相同濃度與孵育時(shí)間條件下，單獨(dú)順鉑藥物與HeLa細(xì)胞作用的結(jié)果相一致。本文制備的鎂摻雜的納米羥基磷灰石能夠作為一種安全的藥物載體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域等具有較好的應(yīng)用前景。

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其中，εLMD、LSD1和 LSD2分別由式（9）、（10）和（11）給出，δε為Dirac函數(shù)，由式（3）給出。

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