EGCG通過NF-κB信號通路抑制感染ALV-J病毒的DF-1細胞凋亡

張 瑩，尹華東，鄔秀宏，楊海濱，鐘應(yīng)富，袁林穎，李中林，徐 澤*

（1.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，重慶永川 402160；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，成都 611130）

禽白血?。╝vian leukosis，AL）是感染禽白血病毒（avian leukosis virus，ALV）后引起的一類禽類疾病，主要導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和免疫抑制。禽白血病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，α反轉(zhuǎn)錄病毒屬。禽白血病毒根據(jù)病毒干擾模式、病毒中和試驗、宿主范圍，可分為外源性病毒A、B、C、D、J亞群和內(nèi)源性病毒ALV-E亞群[1]。1988年，L.N.Payne等人首次從肉雞中分離出了ALV-J病毒，而該病毒在當(dāng)年大范圍地爆發(fā)，對家禽生產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的損失[2]。經(jīng)過近30年的凈化，目前歐美家禽業(yè)發(fā)達國家已成功地遏制或根除了該病毒，但在中國ALV-J呈現(xiàn)出宿主范圍擴展、多重混合感染及腫瘤多樣化的新趨勢，現(xiàn)已成為中國雞群中最常見的重要病原之一[3]。由于ALV-J基因序列的復(fù)雜性及其抗原變異性，到目前為止還缺乏有效的針對性疫苗和藥物，只能通過種群凈化控制該病，但代價昂貴。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是綠茶中茶酚的主要成分，占兒茶素總量的50%～75%。研究表明，由于其特殊的分子結(jié)構(gòu)，EGCG可顯著清除自由基，具有強烈的抗氧化、抗菌、抗突變等作用[4]。1987年，富田勛等報道了EGCG對體外培養(yǎng)人體腫瘤細胞具有較高的抑制作用，因而受到廣泛關(guān)注[5]。隨后，大量的研究表明EGCG可促進腫瘤細胞內(nèi)活性氧（ROS）的生成，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。體外細胞培養(yǎng)表明，EGCG通過改變細胞周期、抑制或激活蛋白等途徑來誘導(dǎo)細胞凋亡與促進細胞生長停滯[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，EGCG在人類結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤以及慢性炎癥的抵抗過程中存在anti-NF-κB反式激活作用[7]。

轉(zhuǎn)錄因子核factor-kappa B（NF-κB）由多個Rel家族成員的蛋白組成，包括 NF-κB1（P105/p50），NF-κB2（p100/p52），RelA（p65），RelB 以及 c-Rel，它們在N端均包括一個高度保守的約300個氨基酸組成的Rel同源結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含DNA結(jié)合功能區(qū)、蛋白質(zhì)二聚化區(qū)和核定位信號[8]。許多研究已經(jīng)證明NF-κB激活后在免疫、炎癥、氧化應(yīng)激等生理、病理過程中發(fā)揮重要作用，此外發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)腫瘤細胞的增殖和凋亡，如：人類肝癌、胃癌、乳腺癌細胞等[9]。

然而，EGCG是否可以抑制J亞型禽白血病病毒的感染尚不清楚。因此，本研究向感染J亞型禽白血病的DF-1細胞添加不同濃度的EGCG，檢測其對ALV-J病毒的抗性及其作用機制。本研究結(jié)果擬為抗ALV-J的研究提供重要的理論依據(jù)，也可能為實際生產(chǎn)中應(yīng)用天然產(chǎn)物預(yù)防ALV-J感染提供參考。

1 材料和方法

EGCG由重慶農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提取，純度大于99%，溶解于pH值為7.4的PBS溶液中，用于處理細胞。

1.1 細胞培養(yǎng)

DF-1雞胚胎成肌細胞系購買于上海博谷生物科技有限公司。DF-1細胞培育于DEME生長培養(yǎng)基中（DEME/F12+10%胎牛血清+10%馬血清+1%雙抗），置于溫度37℃濕度95%以及5%CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

1.2 EGCG對DF-1細胞的毒性研究

將密度為 1×105～2×105細胞/孔置于 96 孔板中培育 48 h，分別用濃度為 0、5、10、20 以及 40 μg/mL的EGCG溶液進行處理，之后再培育0、24、48、72以及96 h，采用MTT法檢測細胞活性。MTT法檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氧酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。

1.3 EGCG對感染ALV-J后細胞的保護效應(yīng)研究

在96孔板中加入密度為5×103的DF-1細胞，當(dāng)細胞密度達到80%時，分別加入濃度0、5、10 μg/mL的EGCG溶液進行預(yù)培育2 h，添加滴度為1.0的ALV-J病毒后加入生長基質(zhì)培育0、24、48、72和96h，采用MTT法檢測細胞活性。

1.4 熒光定量檢測

采用Qiagen細胞RNA提取試劑盒提取細胞中的總RNA，之后進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存在-20℃?zhèn)溆?；采用RT-PCR檢測env基因的mRNA表達量，引物序列為上游：5-AGAAAGACCCGGAGAAGAC-3；下游：5-ACACGTTTCCTGGTTGTT-3。

1.5 禽白血病抗原檢測

采用美國IDEXX禽白血病抗原檢測試劑盒對ALV-J攻毒后DF-1中的禽白血病p27抗原水平進行測定，各步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6 NF-κB活性檢測

采用NF-κB激活－核轉(zhuǎn)運檢測試劑盒（NF-κB Activation，Nuclear Translocation Assay Kit）檢測 NF-κB 的 5 個亞基（p50，p52，p65，c-Rel和 RelB）從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞核的情況，從而確認NF-κB信號通路是否被激活。

1.7 蛋白檢測

在細胞培養(yǎng)96 h后，使用NE-PER?Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents分別提取DF-1細胞中的細胞質(zhì)蛋白和細胞核蛋白，采用westernblot法分別檢測NF-κB p50和 NF-κB p65的蛋白在細胞質(zhì)和細胞核中的表達情況。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結(jié)果用平均值（Mean）±標(biāo)準差（SEM）表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行差異顯著性檢驗，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對DF-1細胞活性的影響研究

為避免因添加EGCG溶液直接對DF-1細胞活性造成影響，本研究首先在培養(yǎng)的DF-1細胞中添加了濃度為 0、5、10、20 和 40 μg/mL 的 EGCG 溶液，在培養(yǎng)后的 24、48、72、96 h時，采用 MTT法檢測了細胞活性。由圖1可見：在細胞中添加40 μg/mL的EGCG后，在4個檢測時間點其OD值都顯著低于對照組（P＜0.05）；添加 20 μg/mL 的 EGCG 在培養(yǎng)后24和48 h的OD值也顯著低于對照組（P＜0.05），而5和10 μg/mL的EGCG細胞的活性不造成影響。因此，我們選取5和10 μg/mL的EGCG濃度添加水平開展后續(xù)試驗。

2.2 添加EGCG對ALV-J攻毒后DF-1細胞活性的影響

ALV-J攻毒DF-1細胞24 h后，分別在細胞中添加0、5和10 μg/mL EGCG溶液，空白對照組為正常生長的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h檢測DF-1細胞活性。由圖2可知：在ALV-J病毒侵入的細胞中添加0和5 μg/mL的EGCG溶液，這2個處理組的OD值在所有檢測的時間點均顯著低于空白對照（P＜0.05），但 5 μg/mL 添加組的 OD 值顯著高于0 μg/mL 處理組（P＜0.05）。然而，當(dāng)細胞中添加的EGCG溶液濃度提高至10 μg/mL后，OD值顯著升高，在檢測的各時間點和對照組相比均沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 添加EGCG對DF-1生長的影響Figure 1 Effect of EGCG cytotoxicity on DF-1 cell growth

圖2 添加EGCG對感染ALV-J病毒DF-1細胞的影響Figure 2 Effects of EGCG on ALV-J infection of DF-1 cells

為驗證10 μg/mL的EGCG對DF-1細胞具有保護效應(yīng)，本研究檢測了細胞培養(yǎng)96 h時不同試驗組DF-1細胞中禽白血病p27抗原水平。由表1可知：p27抗原在沒有感染ALV-J的DF-1細胞中表現(xiàn)為陰性；在感染了ALV-J病毒的細胞中檢測出了高水平的p27抗原；而感染ALV-J的DF-1細胞在用10 μg/mL的EGCG處理96 h后，雖然p27抗原仍然為陽性，但表達水平與未經(jīng)EGCG處理組相比顯著降低（P＜0.05）。

此外，為了進一步驗證10 μg/mL的EGCG是否可以提高DF-1細胞的抗ALV-J能力，本研究采用RT-PCR檢測了禽白血病J亞型env基因的mRNA表達水平。由圖3可知：在沒有攻毒ALV-J的DF-1細胞中env基因幾乎沒有表達；ALV-J攻毒后的細胞中env基因表達量明顯升高；而在采用10 μg/mL的EGCG處理后，在4個檢測時間點env表達量均下降，24、48以及72 h下降顯著。

表1 不同處理DF-1細胞中p27抗原水平Table 1 The p27 antigen level in DF-1 cells with different treatments

圖3 不同處理DF-1細胞中env基因mRNA表達量Figure 3 The expression of env mRNA in DF-1 cells with different treatments

因此，為了檢測EGCG對抗ALV-J毒性的分子機制，選取EGCG添加濃度為10 μg/mL開展后續(xù)試驗。

2.3 添加EGCG對NF-κB不同亞基跨膜轉(zhuǎn)移的影響

為探討添加10 μg/mL EGCG對感染ALV-J病毒DF-1細胞的保護機理，本研究分別檢測NF-κB亞基 p50，p52，p65，RelB 和 C-Rel的跨膜轉(zhuǎn)移情況（圖4a和4b）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在正常培養(yǎng)的DF-1細胞中，細胞質(zhì)內(nèi)的p50和p65亞基都顯著高于細胞核內(nèi)；在外源病毒的刺激下，只有p50和p65亞基從細胞質(zhì)顯著地向細胞核中轉(zhuǎn)移，而但當(dāng)加入10 μg/mL的EGCG后，這種跨膜現(xiàn)象得到抑制，胞漿和細胞核中的p50和p65亞基含量沒有顯著差別。

為驗證以上結(jié)果，本研究對NF-κB亞基p50和p65蛋白在不同處理下細胞質(zhì)和細胞核中的表達情況進行了檢測（見圖4c）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常生長的DF-1細胞中，細胞質(zhì)p50和p65蛋白表達量高于細胞核；ALV-J病毒感染后，p50和p65蛋白水平在細胞核中上升，細胞質(zhì)中下降，而在添加了10 μg/mL的EGCG的處理后，細胞核和細胞質(zhì)中p50和p65蛋白水平基本相同。

3 討論

禽白血病被發(fā)現(xiàn)已經(jīng)超過一個世紀，是家禽中一類重要的致腫瘤性病毒，可以通過垂直和橫向傳播造成雞群感染。J亞型（ALV-J）是禽白血病中最重要的亞型，可以破壞機體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，顯著降低抵抗力，由于沒有特異性針對ALVJ的疫苗，所以目前都通過提高自身免疫能力來進行預(yù)防[10]。

在過去幾十年里，許多天然產(chǎn)物已經(jīng)被證明具有化學(xué)保護效應(yīng)，可用于提高動物機體免疫能力。近年來，EGCG由于其對腫瘤的化學(xué)保護能力引起了研究者的高度關(guān)注，并發(fā)現(xiàn)其在一定的濃度條件下可以提高細胞抗腫瘤浸染能力[11]。本研究中，通過細胞活性檢測首先發(fā)現(xiàn)了EGCG對DF-1細胞的正常生長的影響具有劑量效應(yīng)，20和40 μg/mL的EGCG會抑制細胞生長。在進行ALV-J攻毒后，低濃度（5 μg/mL）的EGCG無法提高細胞對ALV-J的抵抗能力，當(dāng)EGCG濃度提高至10 μg/mL時才能顯著抵御ALV-J侵擾，明顯提高DF-1細胞的活性。

p27是禽白血病群（A，B，C，E和J亞群）的主要gs抗原，高度保守，因而p27是ALV抗原檢測的基礎(chǔ)[12]。此外，秦愛建等發(fā)現(xiàn)重組env基因產(chǎn)物與雞抗ALV-J血清反應(yīng)，而與抗其他亞群禽白血病的雞血清微弱反應(yīng)，說明了該env基因編碼蛋白有ALV-J的特異抗原表位，其表達量用于快速診斷ALV-J感染情況[13]。本研究中，通過檢測發(fā)現(xiàn)了10 μg/mL的EGCG可顯著DF-1細胞中p27抗原水平；對照組DF-1細胞中幾乎檢測不到env基因的表達，而在ALV-J攻毒組和經(jīng)過10 μg/mL的EGCG處理組，env表達量呈現(xiàn)顯著的下降，這都表明了在該EGCG處理濃度下的細胞抗ALV-J效果明顯。之前的研究也發(fā)現(xiàn)了天然化學(xué)產(chǎn)物對DF-1細胞生長具有劑量效應(yīng)，如：Zhang L.等發(fā)現(xiàn)使用藍莓中的花青素在不超過80 μg/mL情況下可以促進DF-1細胞生長，超過則抑制生長[14]；Wang D.等發(fā)現(xiàn)紫玉米中的花青素低于20 μg/mL可以保護DF-1抵御A型禽白血病的侵蝕[15]。S.Gupta和他的同事也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了EGCG對人類惡性腫瘤細胞（惡性上皮腫瘤、前列腺癌等）感染的抵御作用存在劑量效應(yīng)[16]。因此，盡管添加EGCG容易對感染ALV-J后的DF-1細胞具有保護作用，其濃度也應(yīng)該被控制在合理的范圍，避免EGCG自身對細胞正常生長產(chǎn)生抑制作用。

圖4 添加EGCG對細胞核和細胞質(zhì)中NF-κB的p50和p65亞基活性以及蛋白表達量的影響Figure 4 The effect of EGCG on NF-κB DNA-binding activity，p50 and p65，and protein expression of NF-κB p50 and p65 in cytoplasm and nucleus

NF-κB信號途徑廣泛參與炎癥發(fā)生，腫瘤細胞增殖、侵擾以及代謝過程。在正常細胞中，NF-κB未被激活時與其抑制蛋白IκB-α形成一個復(fù)合物，分布在細胞質(zhì)中；一旦受到外源刺激，IκB-α?xí)赟er32和Ser36被磷酸化，隨后被泛素-蛋白酶體途徑降解。NF-κB和IκB-α解聚后，被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)促進NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄，行使多種生理學(xué)功能[17]。之前的研究表明：人類T細胞I型白血病毒（HTLV-1）可以通過NF-κB激活機制引起病毒細胞無限增殖[13]，而禽白血?。ˋLV）和人類T細胞I型白血病毒（HTLV-1）為同屬，我們推測NF-κB信號途徑也可能參與ALV-J的侵入機制。當(dāng)ALV-J病毒進入細胞后，與受體作用蛋白（RIPs）相結(jié)合，從而激活了IκB激酶，導(dǎo)致其被磷酸化和泛素化，p50和p65等NF-κB二聚體通過各種翻譯后的修飾，并轉(zhuǎn)移至細胞核中與目的基因相結(jié)合，促進轉(zhuǎn)錄和表達。本研究中，DF-1細胞受到ALV-J病毒刺激后，NF-κB的p50和p65亞基發(fā)生了明顯的轉(zhuǎn)移，細胞核中的表達量顯著高于細胞質(zhì)，在加入濃度為10 μg/mL的EGCG后，NF-κB p50/p65再次發(fā)生轉(zhuǎn)移，核內(nèi)含量降低，抑制了NF-κB的信號激活途徑。因此，我們認為NF-κB途徑參與了EGCG調(diào)控DF-1抗J亞型禽白血病的生物學(xué)過程。Li Y.J.等的研究發(fā)現(xiàn)人類鼻咽癌細胞系CNE2和C666-1在激活狀態(tài)下，NF-κB的p65亞基從細胞質(zhì)中明顯向細胞膜轉(zhuǎn)移，癌細胞快速增殖，而在濃度為20 μmol/L的EGCG處理48 h后，核內(nèi)的p65含量明顯降低，癌細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象[18]；戴結(jié)的研究發(fā)現(xiàn)，EGCG預(yù)處理人正常食管上皮細胞能抑制由細胞癌變誘導(dǎo)劑導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，細胞質(zhì)總NF-κB/p65水平增加同時伴隨細胞核NF-NF-κB/p65水平下降[19]，以上研究結(jié)果與本研究類似。

4 結(jié)論

EGCG可通過抑制NF-κB信號激活來提高DF-1細胞對ALV-J的病毒抵御能力，但添加水平具有顯著的劑量效應(yīng)，10 μg/mL為最佳濃度。由于ALVJ可以導(dǎo)致多種禽內(nèi)腫瘤疾病的發(fā)生，因此可以進行個體飼喂試驗進一步驗證EGCG的保護效應(yīng)。

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